CUANTIFICACION DE SUTRATO Y BIOMASA SIGUIENDO UNA FERMENTACION BATCH DE

Saccharomyces Cerevisiae

INFORME DE LABORATORIO GRUPO 1 LABORATOIO 101

1
Leidy Gonzalez Rivera2 Jorge Chaves 3 Diego Tamayo4 Ana Maria Contreras

leidy.gonzalez2@estudiantes.uamerica.edu.co, jorge.chaves0905@gmail.com,
diegotamayo1217@gmail.com, ana.contreras@estudiantesuamerica.edu.co

DOCENTE: Diana Morales Fonseca

Departamento de Ingeniería Química, Fundación Universidad de América Sede Los Cerros

OBJETIVO GENERAL

Determinar los coeficientes de rendimiento que intervienen en la fermantación batch (por lotes)
mediante el uso de técnicas experimentales y teóricas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Reconocer diferentes protocolos para la cuantificación de biomasa y consumo de sustratos

(azucares reductores) , técnicas aplicables en los procesos de fermentación
 Reconocer y determinar los azucares reductores por el método DNS
 Determinar las fases de crecimiento de las fermentaciones
 Identificar mediante la tinticion Gram las bacterias presentes en el cultivo

RESUMEN

Durante la práctica se llevó a cabo la fermentación de la levadura Sacharomisse Cerevisae, mediante

una serie de procesos químicos y experimentales por medio de un cultivo, se realizó una propagación
del microorganismo; además de esto en una primera instancia se realizaron dos curvas patrón, de
azúcar y de biomasa, leyendo en una serie de muestras las respectivas absorbancias a 540nm. Se debe
tener en cuenta que al microorganismo se le proporcionaron los nutrientes y condiciones óptimas para
su crecimiento. Se realizaron dos tipos de fermentaciones, una de ellas estática, y la otra con agitación
durante 48 horas, en dichas horas, se fueron tomando muestras con intervalos diferentes de tiempo.
En segunda instancia se realizó una “Tinción de Gram” para determinar la pureza del cultivo
verificando la no presencia de bacterias diferentes al microorganismo. Asimismo se cuantificaron y
se hallaron las concentraciones reales tanto de la biomasa como de azúcar, teniendo en cuenta
absorbancias, y distintas diluciones, para posteriormente realizar cálculos e identificar correctamente
concentraciones y parámetros cinéticos.

ABSTRACT

During the fermentation of the yeast Sacharomisse Cerevisae was carried out, through a series of
chemical and experimental processes by means of a culture, a propagation of the microorganism was
carried out; besides this in a first instance is made of the curves, sugar and biomass patterns, reading
in a series of samples the respective absorbencies at 540 nm. It must be taken into account that the
microorganism was provided with the nutrients and optimal conditions for its growth. Two types of
fermentations were performed, one of them static, and the other with shaking for 48 hours, at that
time, samples were taken at different intervals of time. In the second instance, a "Gram stain" was
performed to determine the purity of the culture, verifying the presence of different bacteria in the
microorganism. The actual concentrations of both biomass and sugar were also quantified and
analyzed, taking into account absorbances and different dilutions, to subsequently perform
calculations and correctly identify concentrations and kinetic parameters.

INTRODUCCION

En la práctica se utilizó una fermentación tipo batch, o discontinua, en donde se utiliza una técnica
de propagación de biomasa en un medio de cultivo, nutrientes, y demás condiciones óptimas. Esta
fermentación se lleva a cabo en procesos de producción o propagación de biomasa, en ella se usan
sustratos tales como glucosa, los cuales usa el microrganismo como fuente de energía. La adición del
sutrato se realiza únicamente en la fase inicial del proceso, es decir, no hay adición durante la
fermentación por lo que es considerado un proceso cerrado. Durante los procesos de fermentación se
pueden evidenciar 4 fases de crecimiento del microorganismo, conocidas como: fase de latencia, fase
exponencial, fase estacionaria, y fase de muerte.

MARCO TEORICO

Fermentación:

Según la teoría evolutiva acerca del origen de la vida en la Tierra, se considera que la fermentación
es el proceso de obtención de energía más antiguo. Sobre esa base se considera que, dadas las
condiciones de la Tierra primitiva, en la que no existía oxígeno libre y donde los rayos del sol no
llegaban a la superficie terrestre, los primeros organismos solo podían obtener la energía de los
compuestos orgánicos mediante la fermentación.

La fermentación fue descubierta por Louis Pasteur, que la describió como la vie sans l´air (la vida sin
el aire). La fermentación típica es llevada a cabo por las levaduras.

La fermentación es un proceso que realizan muchos microorganismos, efectuando reacciones sobre

algunos compuestos orgánicos y liberando energía, siendo esta usualmente utilizada en la producción
de alimentos, los alimentos fermentados son aquellos cuyo procesamiento involucra el crecimiento y
actividad de microorganismos como mohos, bacterias, levaduras (hongos microscópicos). La
fermentación en alimentos los conserva por largos períodos de tiempo.

Las técnicas de fermentación se modernizaron a partir de la aparición de técnicas de cultivos puros

de células animales y vegetales, al igual de otro tipo de cultivos microbianos. Así, se industrializa la
fermentación y da origen a grandes industrias tales como las alimenticias donde se destacan la
panificadora y la de bebidas alcohólicas; la industria farmacéutica en el campo de las vacunas,
medicamentos, etc., y la industria química que produce ácidos, aldehídos, etc.

Biomasa:

Materia total de los seres que viven en un lugar determinado, expresada en peso por unidad de área o
de volumen. Materia orgánica originada en un proceso biológico, espontáneo o provocado, utilizable
como fuente de energía.
Sustrato:

El sustrato es la parte del biotopo donde determinados seres vivos realizan sus funciones vitales
(nutrición, reproducción, relación).

Es la base, materia o sustancia que sirve de sostén a un organismo, ya sea vegetal, animal o protista,
en el cual transcurre su vida; el sustrato satisface determinadas necesidades básicas de los organismos
como la fijación, la nutrición, la protección, la reserva de agua, etc.

Cultivo Batch:

Es un método de cultivo de alimentación discontinua o por lo lotes en el cual se hacen presentes las
etapas de crecimiento y decrecimiento celular tales como: lag (periodo de adaptación al medio),
exponencial (crecimiento celular), estacionaria (fase en la que el crecimiento se iguala con el número
de muertes) y muerte (de tipo exponencial). Su importancia radica en que no es constante a lo largo
del tiempo.

Tinción de Gram:

Es un proceso rápido de identificación de bacterias, se basa en la coloración de contraste sobre las

paredes celulares de las bacterias, allí se usa una muestra a analizar en un portaobjetos, dicha muestra
es tratada con reactivos como el lugol, alcohol-acetona y safranina.

La pared celular de las bacterias Gram positivas poseen capas gruesas de peptidoglicano lo que les
da un color específico por el contrario las bacterias Gram negativas tienen capas de peptidoglicano
delgadas.

Método DNS:

El método DNS, es una técnica colorimétrica que emplea un procedimiento que se basa en una
reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra, seguido de
la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azucares reductores, esta técnica sirve para
cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los
productos de una reacción enzimática.

Determinación de turbidimetría

Este método se basa principalmente en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a

través de un cultivo bacteriano. La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través
de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma
dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que
haya una buena disminución de la luz transmitida)

Método del peso seco

Para la obtención de biomasa, es necesario realizar previamente una curva de calibración, ésta será
realizada por el grupo del cultivo control.

La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por
unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles
(SSV)..La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo
microorganismos activossino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y
materia orgánica adsorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son
insolubles. Los métodos gravimétricosson simples, pero consumen bastante tiempo y son poco
reproducibles. A la vez este método este método los componentes volátiles de las células pueden
perderse en el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca pude recobrar
humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene humedad relativa alta.

Saccharomyces cerevisiae:

Desarrolla ambos tipos de metabolismo (catabólico y anabólico); pero sólo produce etanol en
condiciones de crecimiento anaerobio (fermentativo).Por consiguiente, y en general, al preparar un
cultivo industrial debemos saber (1) en qué condiciones metabólicas se produce lo que nos interesa
fabricar y (2) controlar la fermentación industrial para que se produzca en esas condiciones deseadas.
Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan
ambientes reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse
con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento

Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras como la Saccharomyces cerevisiae, varían desde
los carbohidratos hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares
ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas que esta especie
presenta. Entre los azúcares que puede utilizar están monosacáridos como la glucosa, fructosa,
manosa y galactosa, entre otros. Por norma general, las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo
muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que existen altas concentraciones de
glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir,
se realiza la glucólisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azúcares escasean, se
produce la respiración del etanol, vía ciclo de Krebs.

Las condiciones óptimas a las que funciona esta levadura son:

• Oxígeno: Para el desarrollo de las reacciones biológicas es fundamental mantener un medio

aerobio, con oxígeno suficiente, que permita la síntesis y la respiración endógena, para así igualmente
producir mayor cantidad de biomasa.

• Temperatura: La temperatura influye en las reacciones de oxidación biológica, aumentando

su velocidad cuando aumenta la temperatura. Esta ley se mantiene hasta los 37ºC, en que la velocidad
de reacción desciende bruscamente, al morir los microorganismos por desnaturalización de las
proteínas del protoplasma celular.

• Humedad: el contenido de humedad óptimo varía en el rango de 50 a 60% y, por debajo del
40% reduce la velocidad de fermentación.

Tal como se estaba diciendo las levaduras al estar bajo condiciones aeróbicas estas usan tanto la
glucólisis, fosforilación oxidativa y el posterior ciclo de Krebs, como rutas catabólicas para producir
energía e igualmente una mayor biomasa.
Técnicas de cuantificación de biomasa:
Métodos directos:
1. Métodos gravimétricos: La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse
en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales
(SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por
centrifugación bien por filtración. La principal desventaja de estas técnicas es que su
determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos,
material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida. Además, no puede
aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos son
simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles.
2. Métodos espectrofotométricos: Se basan en la existencia de una relación directa entre el
número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la
determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el
resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez
como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas
directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez.
Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal
parámetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de métodos rápidos, pero de
baja sensibilidad y que presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo)
y de interferencias con partículas.
3. Método de recuento celular en cámaras: Existen diversos tipos de cámaras para el recuento
de microorganismos tales como la cámara de Neubauer, Thoma, Bürker, Turk, Fuchs-
Rosenthal, Malassez, Petroff Hauser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la
cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número
de microorganismos por unidad de volumen (número de células.ml-1, generalmente). El
recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las
irregularidades en la distribución de la muestra. Además. pueden confundirse las células con
otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células
vivas de células muertas.
4. Método mediante epifluorescencia: La microscopía de epifluorescencia comenzó a emplearse
a principios de los 70 y hoy en día se considera como uno de los mejores métodos para la
estimación de la biomasa. La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adición
de algún anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una
autofluorescencia natural debida a la existencia de algún componente celular
autofluorescente. Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el
procedimiento consiste en la tinción de las bacterias con dicho agente y posterior recuento
mediante microscopía óptica con iluminación de epifluorescencia.
Métodos indirectos:
Estos métodos se basan fundamentalmente en la determinación de algún componente celular
específico, en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos bioquímicos) o en la medida
de consumo de sustrato o de la formación de algún producto (métodos cinéticos). También se incluyen
en este apartado algunos métodos fisicoquímicos. Los métodos bioquímicos y cinéticos determinan,
más que la viabilidad de las bacterias la actividad ya que dependen más del estado metabólico de los
microorganismos que de1 número de individuos.
CALCULOS Y RESULTADOS
Fermentación estática.
Tabla 1. Curva de Calibración Fermentación Estática

TUBO DE Sln Stock AGUA Abs Concentración

ENSAYO (mL) (mL) 540nm (g/L)

0 0,0 5,0 0,000 0,0000

1 1 4,0 0,046 0,4
2 1,5 3,5 0,183 0,6
3 2 3,0 0,343 0,8
4 2,5 2,5 0,459 1
5 2,7 2,3 0,564 1,08
6 3,0 2,0 0,652 1,2

𝑉1𝐶1 = 𝑉2𝐶2
C1= 2g/L
V1= Solucion Stock
V2= Solucion Stock + H20 Destilada
C2= Concentracion glucosa g/L
𝑉1𝐶1
𝑉2 =
𝐶2

Grafica 1. Curva de calibración glucosa Fermentacion 2B

0.7

0.6

0.5
Absorbancia

0.4 y = 0.7536x - 0.2635

R² = 0.9948
0.3

0.2

0.1

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Concentracion glucosa
 Tabla 2. Calibracion curva patrón Biomasa

concentracion
tubo Sln biomasa sln salina Absorbancia biomasa
0 0 5 blanco 0
1 0,5 4,5 0,105 0,0025
2 1 4 0,177 0,005
3 1,5 3,5 0,23 0,0075
4 2 3 0,36 0,01
5 2,5 2,5 0,443 0,0125
6 3 2 0,469 0,015

Grafica 2. Curva calibración Biomasa Fermentacion 2B

0.6

0.5 y = 31.406x + 0.0225

R² = 0.9752
0.4
Absorbancia

0.3

0.2

0.1

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
Concentracion glucosa

Tabla 3. Determinación consumo de glucosa fermentación Estática

Muestra Absorbancia
Sobrenandante (μL) Agua destilada (μL) Factor dilucion (540nm)
To 100 9900 1/100 0,181
T1 100 9900 1/100 0,219
T2 100 9900 1/100 0,061
T3 100 9900 1/100 0,116
T4 100 9900 1/100 0,041
T5 100 9900 1/100 0,033

y=m*x + b y=0,7536x - 0,2675 y= absorbancia

 𝑦−𝑏 1
𝑥= 𝑍 =𝑥∗( )
𝑚 1
100
Tabla 4. Cuantificación Sustrato respecto al tiempo

Hora Z=X* (1/(1/100)) Tiempo (min)

59,51433121 0
11:13 a. m.
64,55679406 2,783333333
2:00 p. m.
43,59076433 4,783333333
4:00 p. m.
50,88906582 6,616666667
5:50 p. m.
40,93683652 20,78333333
8:00 a. m.
39,87526539 24,28333333
11:30 a. m.

Grafica 3. Consumo sustrato Fermentacion 2B

Tiempo Vs. Z
70
60
50
Z (g/ml)

40
y = -0.8067x + 57.86
30
R² = 0.6288
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (hr)

Tabla 5. Cuantificacion Biomasa de acuerdo al tiempo

muestra
de
biomasa sln Absorbancia
t(h) (ml) salina fd (540nm) X (g/ml) Z (g/ml)
t0 0 1 2 1/3 0,376 0,01197235 0,03591705
t1 2,78333333 1 2 1/3 0,457 0,0145515 0,0436545
t2 4,78333333 1 2 1/3 0,422 0,01343705 0,04031115
t3 6,61666667 1 3 1/4 0,378 0,01203603 0,04814413
t4 20,7833333 1 3 1/4 0,441 0,01404204 0,05616815
t5 24,2833333 1 3 1/4 0,667 0,02123818 0,08495273
 Grafica 4. Formacion Biomasa Fermentacion 2B

0.09
tiempo (h) vs Z
0.08
0.07
0.06
Z (g/ml)

0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)

Después de realizar la curva patrón de glucosa y biomasa para la fermentación 2B, estatica, se
prosigue a realizar el consumo de Sustrato y producción de Biomasa de acuerdo a la toma realizada
en distintos rangos de horario. Esa grafica es presentada a continuación.

Gráfica 5. Consumo de sustrato/Producción de biomasa vs Tiempo

Consumo sustrato / Produccion biomasa Vs. Tiempo

FERMENTACION ESTATICA
70 0.1
Produccion biomasa

60
Consumo sustrato

y = -5.2017x + 63.575 0.08

50
40 0.06
30 0.04
20 y = 0.0098x + 0.0251
0.02
10
0 0
0 2.783333333 4.783333333 6.616666667 20.78333333
Tiempo (hr)

Z=X* (1/(1/100)) g/ml Z (g/ml)

Linear (Z=X* (1/(1/100)) g/ml) Linear (Z=X* (1/(1/100)) g/ml)
Fermentación en agitación
Tabla 6. Curva calibración glucosa Fermentacion 1A, en agitación

Sln Stock
Glucosa (ml) Agua destilada Absorbancia
Tubo V1 (ml) (540nm)
0 0 5 0
1 1 4 0,075
2 1,5 3,5 0,133
3 2 3 0,175
4 2,5 2,5 0,19
5 2,7 2,3 0,221
6 3 2 0,32

Gráfica 6. Curva calibración azucares reductores fermentación en agitación

Curva calibracion glucosa

0.35

0.3

0.25
Absorbancia

0.2

0.15
y = 0.2564x - 0.0314
0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Concentracion glucosa

Tabla 7. Calibracion curva patrón biomasa de la fermentación en agitación

Sln
Tubo biomasa Sln salina Absorbancia 540nm Concentracion biomasa
0 0 5 blanco 0
1 0,5 4,5 0,06 0,0025
2 1 4 0,139 0,005
3 1,5 3,5 0,189 0,0075
4 2 3 0,267 0,01
 5 2,5 2,5 0,314 0,0125
6 3 2 0,416 0,015

Grafica 7. Calibracion curva patrón biomasa fermentación en agitación

0.45
0.4 y = 27.234x - 0.0075
R² = 0.9908
0.35
0.3
Absorbancia

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
Concentracion biomasa

Tabla 8. Producción biomasa fermentación en agitación (1A)

Muestra
de la Sln
Tiempo Biomasa Salina Determinación Determinación
(h) (ml) (ml) Fd Absorbancia de X (g/ml) de Z (g/ml)
t0 0 1 2 0,3333 0,319 0,012017329 0,036051987
t1 3,0833 1 2 0,3333 0,356 0,013411189 0,040233566
t2 5,0833 1 2 0,3333 0,379 0,014277642 0,042832925
t3 6,9166 1 3 0,2500 0,305 0,011489923 0,045959691
t4 22,7166 1 3 0,2500 0,401 0,015106423 0,060425692
t5 25,4166 1 3 0,2500 0,508 0,019137314 0,076549256
 Gráfica 8. Consumo sustrato para fermentación en agitación vs Tiempo

t (h) Vs Z (g/ml)
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
Z

0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 5 10 15 20 25 30
t

Tabla 9. Consumo sustrato fermentación en agitación (1A)

Muestra Agua Z=X* Tiempo

Factor Absorbancia
Sobrenandante destilada (1/(1/100)) (min)
dilucion (540nm)
(μL) (μL) g/ml
To 100 9900 1/100 0,498 0
206,474259
T1 100 9900 1/100 0,486 3,0833
201,794072
T2 100 9900 1/100 0,478 5,0833
198,673947
T3 100 9900 1/100 0,437 6,9166
182,683307
T4 100 9900 1/100 0,177 22,7166
81,2792512
T5 100 9900 1/100 0,115 25,4166
57,0982839
 Grafica 9. Consumo sustrato Vs. Tiempo para fermentación en agitación

Tiempo Vs. Z
250

200

150
Z (g/ml)

100

50 y = -6.1884x + 219.87
R² = 0.9844
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (hr)

Después de realizar la curva patrón de glucosa y biomasa para la fermentación 1A, en agitación, se
prosigue a realizar el consumo de Sustrato y producción de Biomasa de acuerdo a la toma realizada
en distintos rangos de horario. Esa grafica es presentada a continuación

Gráfica 10. Consumo de sustrato/Producción de biomasa vs Tiempo

Consumo sustrato / Produccion biomasa Vs. Tiempo

FERMENTACION EN AGITACION
250 y = 0.009x + 0.0261 0.09
0.08
200
Produccion biomasa
0.07
Consumo sustrato

0.06
150
0.05
0.04
100
0.03
y = -40.679x + 266.34 0.02
50
0.01
0 0
0 3.0833 5.0833 6.9166 22.7166
Tiempo (hr)

Z=X* (1/(1/100)) g/ml Z (g/ml)

Linear (Z=X* (1/(1/100)) g/ml) Linear (Z=X* (1/(1/100)) g/ml)
Linear (Z (g/ml))
Fases de crecimiento.
a. Fermentación estática

Tabla 10. Determinación de fases de crecimiento fermentación estática.

Tiempo Concentracion real fermentacion estatica

(Hr) (X) Ln (x)
0 0,03591705 -3,3265432
2,783333 0,0436545 -3,1314489
4,783333 0,04031115 -3,2111272
6,616667 0,04814413 -3,0335561
20,78333 0,05616815 -2,8794054
24,28333 0,08495273 -2,4656603

De acuerdo a los parámetros cinéticos existen cuatro fases de crecimiento tales como latencia,
exponencial, estacionaria y muerte.
−3,0335561 − (−3,3265432)
μmax =
6,616667 − 0
μmax = 0,0442802h-1
La velocidad especifica de crecimiento para la fase estacionaria es igual a la velocidad especifica de
crecimiento máxima que es igual a 0,0442802 h-1
𝑙𝑛(2)
𝑡𝑑 =
μmax
ln(2)
𝑡𝑑 = 0,0442802 h-1

El tiempo de duplicación para la fermentación 2B, estatica, es igual a 15,65366h-1

 Grafica 11. Fases de crecimiento fermentación estática

0
0 5 10 15 20 25 30
-0.5

-1

-1.5
Ln(x)

-2
y = 0.0281x - 3.2854
R² = 0.8595
-2.5

-3

-3.5
Tiempo

No hay etapa de latencia ya que al momento de realizar la práctica de laboratorio el microorganismo

fue entregado metabólicamente activo.
Tabla 11. Determinacion Ks
Concentracio
n real
Tiempo fermentacion X S
(Hr) estatica (X) Ln (x) S
Delta (X) Delta (T) promedio μ promedio
- 0,007737 2,783333 0,039785 0,069872 62,03556
0 0,03591705 59,514331
3,3265432 5 3 8 3 3
- -
2,783333 0,0436545 - 64,556794 0,003343 0,041982 0,039818 54,07377
3,1314489 4 2 8 1 9
- 1,833333 0,044227 0,096603 47,23991
4,783333 0,04031115 43,590764
3,2111272 0,007833 3 6 3 5
- 14,16666 0,052156 0,010859 45,91295
6,616667 0,04814413 50,889066
3,0335561 0,008024 7 1 7 1
- 0,028784 0,070560 0,116554 40,40605
20,78333 0,05616815 40,936837
2,8794054 6 3,5 4 9 1
-
24,2833 39,87526
0,08495273 2,465660
3 5
3

Monod
μmax∗Sprom Sprom(μmax−μ)
μ= 𝐾𝑠+𝑆𝑝𝑟𝑜𝑚
𝐾𝑠 = μ
 Tabla 12. Ecuación de Monod

S
μ promedio
0,0698723 62,035563
-
0,0398181 54,073779
0,0966033 47,239915
0,0108597 45,912951
0,1165549 40,406051

Gráfica 12. Ecuación de Monod. Fermentación 2B

Monod FERMENTACION ESTATICA

0.14
0.12
0.1 y = 0.0144x + 0.0076
R² = 0.125
0.08
0.06
0.04
0.02
0
62.03556264 54.0737792 47.23991508 45.91295117 40.40605096
-0.02
-0.04
-0.06

Lineweaver-Burk
y=a∗x+b
𝐾𝑠
𝑎 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑠 = 3524,7 ∗ 0,0442802 𝐾𝑠 =156,0744209kg/m3
 Grafica 13. Linealizacion Lineweaver-Burk Fermentacion 2B

Lineacion Lineweaver-Burk FERMENTACION

ESTATICA
100

80

60

40 y = 3524.7x - 52.08
1/μ

R² = 0.0719
20

0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
-20

-40
1/S promedio

Langmuir
Tabla 13. Ecuación de Langmuir

μ S promedio S promedio/ μ
0,0698723 62,035563 887,8424631
-0,0398181 54,073779 -1358,02115
0,0966033 47,239915 489,0094961
0,0108597 45,912951 4227,818387
0,1165549 40,406051 346,6696603

𝐾𝑠
𝑏 = μmax Ks= 3884* 0,0442802 Ks=171,9843kg/m3
 Gráfica 12. Linealizacion langmuir Fermentacion Estatica

S promedio/ μ Vs S promedio FERMENTACION

ESTATICA
5000

4000

3000 y = -59.385x + 3884

S promedio/ μ

R² = 0.0589
2000

1000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
-1000

-2000
S promedio

b. Fermentacion en agitación

Tabla 15. Determinación de fases de crecimiento fermentación en agitación.

Tiempo Concentracion real fermentacion en

(Hr) agitacion (X) Ln (x)
0 0,036051987 -3,3227933
3,0833 0,040233566 -3,2130537
5,0833 0,042832925 -3,1504482
6,9166 0,045959691 -3,0799905
22,7166 0,060425692 -2,8063409
25,4166 0,076549256 -2,5698209

La velocidad especifica de crecimiento para la fase estacionaria es igual a la velocidad especifica de

crecimiento máxima que es igual a 0,035117 h-1

−3,0799905(−3,3227933)
μmax =
6,9166 − 0
μmax = 0,035117h-1
El tiempo de duplicación para la fermentación 2B, estatica, es igual a 19,7383801h-1
𝑙𝑛(2)
𝑡𝑑 =
μmax
 ln(2)
𝑡𝑑 = 0,035117 h-1

Grafica13. Fases de crecimiento fermentación en agitación

Fases de crecimiento fermentacion en agitacion

0
0 5 10 15 20 25 30
-0.5

-1

-1.5
Ln (x)

-2
y = 0.0257x - 3.294
-2.5 R² = 0.9583

-3

-3.5
Tiempo

Tabla 16. Determinación Ks

Concentracion Concentracion
Tiempo
real biomasa real sustrato X S
(hr)
(X) (S) Ln (x) Delta X Delta T promedio μ promedio
-
0 0,036051987 206,474259
3,3227933 0,0041816 3,0833 0,0381428 0,0355559 204,13417
-
3,0833 0,040233566 201,794072
3,2130537 0,0025994 2 0,0415332 0,0312925 200,23401
-
5,0833 0,042832925 198,673947
3,1504482 0,0031268 1,8333 0,0443963 0,0384163 190,67863
-
6,9166 0,045959691 182,683307
3,0799905 0,014466 15,8 0,0531927 0,0172123 131,98128
-
22,7166 0,060425692 81,2792512
2,8063409 0,0161236 2,7 0,0684875 0,0871939 69,188768
-
25,4166 0,076549256 57,0982839
2,5698209
Monod
Grafica 14. Ecuacion monod fermentación en agitación

Ecuacion Monod FERMENTACION EN AGITACION

0.1
0.09
0.08
0.07
y = -0.0003x + 0.0918
0.06 R² = 0.4689
0.05
μ

0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 50 100 150 200 250
S promedio

Lineweaver-Burk

Tabla 17. Ecuación método Lineweaver-Burk

μ S promedio 1/ S promedio 1/μ

0,0355559 204,1341655 0,004898739 28,124692
0,0312925 200,2340095 0,004994157 31,956529
0,0384163 190,678627 0,005244426 26,03065
0,0172123 131,9812791 0,007576832 58,097917
0,0871939 69,18876755 0,014453213 11,468691
 Gráfica 18. Linealizacion Lineweaver-Bur

Linealizacion Lineweaver-Bur FERMENTACION EN

AGITACION
70
60
50 y = -1766.2x + 44.264
R² = 0.1804
40
1/μ

30
20
10
0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
1/ S promedio

y= a∗x+b
𝐾𝑠
𝑎 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 Ks= -1766,2* 0,035117 Ks= 62,0236g/ml

Langmuir

μ S promedio S promedio /μ
0,0355559 204,1341655 5741,210596
0,0312925 200,2340095 6398,783911
0,0384163 190,678627 4963,488607
0,0172123 131,9812791 7667,837401
0,0871939 69,18876755 793,5046234

S promedio /μ Vs. S promedio

9000
8000 y = 29.22x + 459.81
R² = 0.4241
7000
S promedio /μ

6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0 50 100 150 200 250

S promedio
 𝐾𝑠
𝑏 = μmax b=459,81*0,035117 Ks=16,147147g/ml

DISCUSION DE RESULTADOS
En el laboratorio se realizó la técnica DNS para cuantificar los azúcares reductores y en nuestro caso,
se realizó a partir de una concentración de azúcar de 2g/L y que fue distribuida en seis tubos de ensayo
donde a estas muestras se les añadió tanto agua, como reactivo DNS para poder a través de la
absorbancia ver la acción de los azúcares reductores, ya que esta técnica de DNS eso es lo que nos
permite conocer allí se pudo observar que hubo unas buenas mediciones, debido a que el ajuste lineal
de datos arrojó un buen R2, igualmente se pudo observar que a medida que crece la concentración de
glucosa también aumenta el crecimiento de la absorbancia.
La levadura que se usó para estas fermentaciones fue la Saccharomyces cerevisiae, esta levadura en
nuestro laboratorio no presentaba como producto final etanol, por lo tanto lo que se buscaba en esta
fermentación era el crecimiento de la biomasa y es lo que se puede apreciar en las gráficas
correspondientes, aunque se presentaron algunos errores en las mediciones, la tendencia fue el
crecimiento de la biomasa a través del tiempo, y por el contrario también se puede observar como en
la fase exponencial el consumo de glucosa es mayor tendiendo a acabarse alrededor de la fase
estacionaria y posterior fase de muerte, pero tendiendo a producir más rápido la biomasa en la
fermentación en agitación, ya que se estimula la velocidad de la transferencia de masa.
La levadura Saccharomyces cerevisiae trabaja con dos rutas metabólicas, respiración aeróbica o
fermentación, según el medio de cultivo que se proporcione. El cultivo se realizó en un medio el cual
favoreció la respiración aeróbica por tanto la levadura escogió esa ruta metabólica ya que es la que
más ATP produce.
En las gráficas 10 y 5 de Consumo de sustrato/Producción de biomasa vs Tiempo tanto en agitación
como estática , se logra apreciar con exactitud la fase estacionaria, comparados con otros resultados
y un consumo de sustrato al mismo tiempo, y esto puede confirmar que el medio enriquecido ayuda
a que el microorganismos tenga un crecimiento óptimo.
Durante la práctica se presentaron cierta serie de errores entre los cuales se encuentran los
instrumentales debido a la mala calibración de los instrumentos como el caso de espectrofotómetro
el cual en algunas mediciones no mostraba un valor exacto sino que por el contrario oscilaba en
rangos, se presentaron errores humanos, ya que se encuentra la poca exactitud a la hora de pesar o
tomar muestras para los análisis que se realizaron durante la práctica, por lo que afecto la medición
de las concentraciones de sustrato.
Igualmente se podrían recurrir a otras técnicas de cuantificación de biomasa para disminuir errores,
tales como métodos directos (peso seco, recuento celular en cámaras, método microscópico por
epifluorescencia) o indirectos (análisis de componentes celulares, métodos bioquímicos, métodos
cinéticos)
Para ver las fases de crecimiento se graficó Ln (X) vs T, sin embargo allí solo se puede ver crecimiento
y no se puede observar la fase de latencia (ya que entra metabólicamente activo), se puede denotar
fase exponencial, pero nunca se llega a ver una fase estacionaria y una fase de muerte, tal vez porque
se requería más tiempo de medición o por error en alguno de los procedimientos previos.
Mientras que para los modelos cinéticos es decir el crecimiento limitado por el sustrato, al realizar
los respectivos cálculos y mediciones, se graficaron estos, obteniéndose unas gráficas algo raras, por
lo cual ni la ecuación de Monod, ni sus respectivas linealizaciones (Lineweaver-BurK y Langmuir)
nos dejaron ver un modelo cinético correcto, tal como los expresados en las dos revistas indexadas
consultadas, en las cuales se puede ver como hay una curva que sigue los parámetros nombrados en
la clase magistral, por lo tanto al comparar nuestros datos con los de estas revistas, no coinciden de
la manera que se supone debería ser, esto puede ser debido a que no cumplen con estas ecuaciones o
que hubo errores en las mediciones ya sea por el método empleado o por errores humanos.
CONCLUSIONES
Se estableció como herramienta principal un reactor o fermentador el cual será la herramienta
principal para la producción de la biomasa. Éste provee todas las condiciones necesarias para el
cultivo, tales como agitación, regulación de temperatura, suministro de oxígeno, entradas para adición
de nutrientes, control del pH, etc; que también juegan un papel fundamental durante todas las etapas
de crecimiento del cultivo.
De acuerdo con los datos obtenidos en los experimentos de la Gráfica 2, se puede observar que la
curva de la glucosa presenta una mayor pendiente que las otras fuentes de carbono por lo cual se
puede concluir que la mejor fuente de carbono para la levadura es la glucosa. Otras fuentes como la
sacarosa y la lactosa no son adecuadas para el crecimiento óptimo de la levadura.
Se identificarón que en condiciones controladas, en el laboratorio, se puede seguir la evolución del
número de células a lo largo del tiempo de un cultivo microbiano en un sistema cerrado; si se
representan los resultados obtenidos obtendremos la denominada curva de crecimiento que
comprende cuatro fases: fase de latencia o de adaptación, fase de crecimiento exponencial o
logarítmico, fase estacionaria y fase de muerte.
Basados en la concentración inicial y final de los 5 medios de cultivo, se concluye que el medio de
cultivo B reúne las mejores condiciones para un mayor crecimiento en la levadura, debido a su gran
porcentaje de crecimiento con respecto a los demás.
Con base en lo anterior se presenta un pH óptimo de 5,2 para el crecimiento de la levadura, aunque
también se presentó un crecimiento bueno a un pH de 4,15, el cual es un resultado adecuado ya que
las levaduras presentan su crecimiento máximo a pH de 3,5 hasta 5,5.
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