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Roberta Hadad Cintra

Agosto/2011

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 A cromatografia líquida se define como uma técnica de


separação.

 A amostra é distribuída entre duas fases, uma estacionária e


outra móvel de tal forma que cada componente da amostra é
seletivamente retido na fase estacionária.

 É uma técnica que se baseia na solubilidade dos compostos. Por


isso é muito importante selecionar o solvente apropriado para
levar a amostra através do sistema cromatográfico.

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1
 Como toda técnica analítica a Cromatografia Líquida tem
suas vantagens e desvantagens.

 Entre as vantagens desta técnica está a diversidade de suas


aplicações tanto para compostos orgânicos ou inorgânicos.

 Desvantagens – custo dos equipamentos, tempo para


formação de um técnico , de 6 a 12 meses.

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 Igualmente as demais técnicas cromatográficas a


cromatografia líquida não é um bom método de identificação.

 Basicamente é uma técnica de separação de grande


resolução, mas não identifica com precisão o composto.

 Uma expressão usada é que “os tempos de retenção são


característicos, porém não são exclusivos”.

 Emprega-se outras técnicas como espectrometria de massas,


espectrometria de infravermelho ou ressonância magnética
nuclear para obter identificações precisas.

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 Cromatografia Líquida Clássica: colunas de vidro, sob
pressão atmosférica, com fluxo de fase móvel devido à força
da gravidade.

 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High


Perfomance Liquid Chromatography (HPLC): Coluna e
pressão de fase móvel elevada, obtida com o auxílio de uma
bomba de alta pressão que empurra a fase móvel com vazão
mais rápida.
(COLLINS, et al., 1993)

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 Separações cromatográficas se devem a mecanismos de


separação como:

 Adsorção -Cromatografia Líquido-sólido. Competição pelos


sítios ativos da fase estacionária.

 Partição- Cromatografia líquido-líquido. Baseada nas


diferenças de solubilidade dos componentes na fase
estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido).

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3
 Troca iônica - diferentes tendências dos componentes iônicos
ou ionizados da amostra a permutar com os íons da fase
estacionária.

 Exclusão os componentes são separados conforme o tamanho


efetivo das moléculas.

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 Cromatografia em Fase Normal: Quando se utiliza uma fase


estacionária polar com fase móvel apolar. Exemplo: uso de
sílica gel com hexano ou diclorometano.

 Cromatografia em Fase Reversa: Quando se utiliza uma fase


estacionária apolar juntamente com fase móvel polar.
Exemplo: uso de sílica gel modificada (C18) com
metanol/água.

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 Tempo de Retenção de A (tra): É o tempo que a amostra
permanece dentro da coluna e se mede desde o momento em
que a amostra é introduzida no sistema até o momento em
que se obtém o ponto máximo do pico da amostra.

Tra= tr-to

Figura 1: Tempo de retenção e tempo morto

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 Tempo morto(to): É o tempo necessário para eluir uma


amostra não retida na coluna. Se determina medindo o tempo
de retenção da fase móvel.

 Fator de Capacidade (K’) de A : descreve a velocidade com


que um dado composto migra ao longo da coluna.
K’a=tra / to

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 Fator de Seletividade (α) de A e B: é a razão entre os
coeficientes de partilha do soluto mais retido pelo menos
retido. É uma medida de separação de dois solutos A e

α = K’B / K’A

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 A Resolução (R) é uma medida quantitativa da separação


de dois picos consecutivos:
R = 2 T / la + lb
Quando R=1,5, a separação é completa; quando R= 1,0, os picos estão somente 90%
resolvidos.

Figura 2: Resolução entre dois picos

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 Eficiência da coluna:pode ser calculada pelo número de
pratos teóricos (N). Este termo se origina de colunas de
destilação e é usado como uma medida da eficiência de
colunas cromatográficas.

N = 16 (Tra / la)2

 Um prato teórico é definido como sendo um equilíbrio


de distribuição do soluto entre as duas fases; quanto
maior o valor de N, mais equilíbrio existirão e a
separação terá maior eficiência.

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Exemplos de Eficiência de Colunas

Figura3: Exemplo de pico com coluna com baixa Figura4: cada pico tem a mesma área, porém
eficiência e alta eficiência número de pratos teóricos diferentes

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 O sistema cromatográfico é composto de:
Figura 5: sistema cromatográfico

 Reservatório e sistema de Bombeamento da Fase Móvel


(Solvente ou Solventes)

 Sistema de Introdução da Amostra

 Sistema Analítico (Coluna Cromatográfica – Fase


 Estacionária)

 Sistema de Detecção

 Sistema de Registro e Tratamento dos Dados

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Figura 6: Sistema Cromatográfico

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 Os aspectos mais importantes são a pressão máxima de
operação, o fluxo de 0,5 a 10 ml/min, reprodutibilidade e
constancia do fluxo.

 Todo solvente deve ser filtrado e desgaseificado. Bolhas de


gás podem causar variações na vazão, e consequentemente
nos tempos de retenção.

 Também são importantes a resistência a líquidos


corrosivos, a facilidade de troca de fase móvel e a limpeza
do sistema.

 É importante o estudo do manual da bomba, o qual dá


indicações sobre manutenção e reparo.

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 Manter um estoque mínimo de peças sobressalentes,


especialmente aquelas que se desgastam facilmente.

 Ácidos e bases inorgânicas, soluções salinas e solventes


halogenados podem causar problemas de corrosão e não
devem ser deixados durante a noite no cromatógrafo.

 Deve- se lavar o sistema cromatográfico, sem a coluna com


uma solução de 20% de HNO3, para remover os pontos de
corrosão e apassivar o metal. Em seguida lavar o sistema com
água até a retirada total do ácido, seguido por lavagens com
solventes orgânicos até atingir a fase móvel desejável.

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 Muitas vezes, o fator limitante na precisão das medidas em
cromatografia líquida está na reprodutibilidade com a qual as
amostras podem ser introduzidas na coluna.

 Injeção Manual: pouca repetibilidade, o operador tem que


estar sempre atuando.

 Injeção Automática: maior repetibilidade, possibilidade de


programação dando maior autonomia ao sistema. Libera mais
o técnico.

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 Devem ter algumas propriedades gerais tais como:

 Resposta: pode ser universal ou seletivo; os detectores seletivos


são compatíveis com eluição em gradiente e são usados quando
se quer minimizar interferentes.

 Sensibilidade: a razão entre o sinal gerado e a quantidade de


amostra que produziu o sinal.

 Ruído: é a variação do sinal que não é atribuído à amostra.

 Linearidade: deve-se guardar uma relação linear com a


concentração da amostra.

 Estabilidade: o detector deve ser indiferente as variações de


temperatura e fluxo.

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 Detector Índice de Refração: é considerado um detector
universal,tem menos sensibilidade do que detectores de
UV. Não há destruição da amostra. Muito sensível a
mudança de temperatura e pressão.

 Detector de Ultravioleta: é considerado um detector


seletivo. É relativamente insensível as mudanças de fluxo
e de temperatura. Mais sensível que o IR. É o detector
mais usado.

 Detector de Fluorescência:é considerado um detector


seletivo. É um detector mais sensível que os outros, mas
fica restrito aos compostos que fluorescem ou podem
formar derivados que fluorescem.

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 Detector Eletroquímico: O princípio deste detector se


baseia na reação que pode ser de oxidação ou redução.
Desvantagem é a facilidade com que o eletrodo fica
“sujo” perdendo resposta, necessitando limpeza
frequente ou troca do eletrodo.

 Detector de massas: Combina sensibilidade, versatilidade


e universalidade. A maior dificuldade na utilização destes
detectores é o interfaceamento com o sistema de CLAE e
o seu alto custo.

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 Detector Evaporativo de Espalhamento de Luz: É considerado
um detector universal e que pode ser utilizado com gradiente
de eluição na determinação de compostos semi-voláteis, não
voláteis e que não possuem grupos cromóforos.

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 Em todo sistema cromatográfico a coluna é o “


coração” do sistema, pois é onde acontece a separação
dos componentes da amostra.

Figura 7: colunas

 A coluna consiste em um segmento de tubo de algum


material inerte, de diâmetro uniforme, capaz de resistir
a altas pressões e paredes internas finamente polidas.

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 O aço inoxidável é o material mais usado. Há também as
colunas de vidro com paredes grossas, mas não são
resistentes a altas pressões e dificuldades de conecção
metal-vidro.

 A capacidade da coluna depende do seu comprimento,


diâmetro e material de empacotamento.

 As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço


inoxidável, diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para
separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para
preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns
colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de
25-30 cm.

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 O tamanho e a configuração das partículas que preenchem as


colunas variam segundo a aplicação cromatográfica. Estas
partículas geralmente são de sílica ou alumina e podem ser
recobertas com outras substâncias.

 As partículas devem ter a menor variação de diâmetro


possível.

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 Quanto maior o tamanho da partícula porosa, mais lento o
processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a
transferência de massa entre a fase estacionária e a fase
móvel.

 Conforme diminui o tamanho da partícula, a profundidade


dos poros diminui e a saída dos poros acontece mais
rapidamente, permitindo obter análises rápidas, sem perda na
eficiência.

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 Fase normal:
Fase estacionária polar – Sílica, alumina, grupo amino(-NH2),
grupo nitrilo (-CN)
Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter
isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da Fase móvel, o tempo de
eluição diminui.

 Fase reversa:
Fase estacionária não polar – grupos octil (-C8H17),
octadecil(-C18H37)
Fase móvel relativamente polar (água, metanol, acetonitrila)
O componente mais polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da fase móvel, o tempo de
eluição aumenta.

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 Para registrar ou manipular os dados obtidos pelos
detectores na CLAE pode se usar um registrador ou mesmo
um microcomputador. Atualmente, para manter ou aumentar
a versatilidade, exatidão e precisão, o microcomputador é
mais utilizado. Pode processar os dados e também controlar
parâmetros de análise.

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FIGURA 8: Cromatograma, obtido por CLAE, da análise de uma mistura contendo as substâncias enumeradas na figura e seus picos
correspondentes de acordo com o tempo em que foram determinadas pelo método. Fonte: (CIOLA, 1998)

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 Verdadeiro motor das separações

 Os solventes devem possuir:


-Alto poder de solubilização das amostras;
-Baixa reatividade;
-Compatibilidade com o detector utilizado;
-Baixa viscosidade;
-Altíssimo grau de pureza (Grau HPLC)

 A fase móvel deve ser livre de impurezas que produzam


resposta no detector, não deve atacar as partes integrantes
do cromatógrafo.

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 Presença de estabilizantes por exemplo etanol ou amileno


em clorofórmio, BHT em tetrahidrofurano, pode afetar a
linha de base.

 A água é um solvente comum na CLAE. Esta deve ser


purificada. Sua armazenagem em tambores plásticos não é
recomendada.

 Para remover o gás dissolvido é importante degaseificar a


fase móvel.

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 Apesar dos solventes CLAE serem filtrados pelo fornecedor,
recomenda-se sua filtração antes do uso. adequado. Como
mais uma precaução, aconselha-se a utilização de um filtro
no reservatório.

 Podem ser utilizados dois tipos de eluição:


-isocrática: quando se mantém a composição da fase móvel
constante durante toda a análise cromatográfica.

-programação de gradiente: quando altera-se a


composição da fase móvel durante a execução da análise.
Utiliza-se dois ou mais solventes com polaridades
diferentes

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 Antes de iniciarmos um desenvolvimento de método com


HPLC precisamos definir :

◦ Qual coluna?
◦ Qual fase móvel?
◦ Qual detector?

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A regra básica é:

 usar uma fase estacionária com polaridade semelhante à


amostra e uma fase móvel de polaridade muito diferente.

 Se o composto que se quer separar tiver diferenças na parte


polar de suas estruturas usar uma coluna de fase normal(fase
estacionária polar).

 Se as diferenças forem na parte apolar usar coluna de fase


reversa(fase estacionária apolar).

 Se houver diferenças tanto na parte polar e apolar do composto


usar coluna de fase reversa.

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 Começar a eluição com uma fase móvel com alto poder de


eluição:
◦ Fase normal : 100% de diclorometano ou clorofórmio
◦ Fase Reversa: 50-100% de metanol ou acetonitrila com
água.
 Nestas condições todos os componentes devem eluir no
volume morto.

 Para aumentar a retenção adicionar:


◦ Fase normal: hexano, heptano, iso-octano.
◦ Fase reversa: aumentar a porcentagem de solvente mais
fraco (H2O).

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 Para melhorar a eficiência da separação:
◦ Baixar o fluxo;
◦ Trocar coluna;
◦ Reduzir concentração da amostra e/ou volume de injeção.

 Um cuidado importante também é com a preparação da


amostra. A amostra deve ser sempre filtrada e avaliada a
solubilidade na fase móvel.

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 Fazer uma limpeza prévia na amostra usando um cartucho


de extração tipo sep-pak, que consiste de um cartucho de
plástico, contendo sílica ou fase reversa, sobre o qual são
adsorvidos os contaminantes, preservando a coluna.

 O uso de uma pré-coluna contendo a mesma fase


estacionária que a coluna é também recomendado.

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 Sempre correr um branco antes de começar a analisar a
amostra. Este procedimento é importante para saber se um
pico presente é proveniente da amostra ou impurezas do
solvente.

Figura 9: Diferença de uma corrida de branco após a remoção de orgânicos da água

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 A escolha do detector deve ser feita considerando se a


amostra contém grupos cromóforos para a utilização de um
detector de UV que é mais barato, confiável e fácil de usar.

 Se há a necessidade de baixos limites de detecção ou maior


especificidade pode fazer uso do detector de fluorescência.

 Caso a amostra não possua grupos cromóforos pode-se fazer


uso do detector de índice de refração ou espalhamento de
luz.

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 Quando usar análise com gradiente de eluição?
 As vantagens que oferecem esta técnica são análises mais
rápidas, melhora a separação, maior simetria dos picos.

Eluição Isocrática Eluição por gradiente

Figura10: Eluição isocrática e eluição por gradiente respectivamente

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 Exemplo: uma mistura contendo cinco componentes deve ser


analisada. Usando hexano como fase móvel, no modo
isocrático, o tempo de análise foi considerado excessivo ,
picos largos e o quinto componente não eluiu.

Figura 11: Cromatograma mostrando o efeito típico de uma fase móvel de baixo poder

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 Uma fase móvel mais “forte” foi usada, diclorometano. O
quinto componente foi eluído, o tempo de análise reduzido,
mas perdeu-se a resolução entre os picos 1 e 2, 3 e 4.

Figura 12: Cromatograma mostrando o efeito típico de uma fase móvel excessivamente forte

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 Empregando-se um gradiente de eluição a resolução entre os


picos foi resolvida.
 Utilizou-se 100% hexano, até que o segundo pico tenha
eluído, quando, então adiciona-se diclorometano a uma taxa
de 2%/min. A composição final da fase móvel é 100% de
diclorometano.

Figura 13: Cromatograma mostrando as vantagens da utilização de um gradiente de fases móveis

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 Amostras:

◦ Obter sempre o máximo de informação sobre a


amostra.
◦ Sempre filtrar.
◦ Testar a solubilidade com a fase móvel.
◦ Sempre que possível usar a fase móvel para dissolver a
amostra.

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 Fase móvel:

◦ Usar sempre solventes grau HPLC.


◦ Filtrar a fase móvel.
◦ Usar filtro no reservatório da fase móvel.
◦ Evitar o uso de solventes alcalinos em colunas a base de
sílica.
◦ Fase móvel com pH <2 podem provocar o rompimento da
ligação Si-C, acarretando na perda de grupamentos
quimicamente ligados.
◦ Para um desenvolvimento usar o solvente de um mesmo
fabricante até o final da pesquisa.

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Figura14: Diferença de tempo de retenção com solvente de fabricantes diferentes

47

 Determinação de fenalenona
 Houve mudança de fabricante do solvente,
diclorometano. Apareceu uma “dobra” de pico.
 Ao medir o pH, observou que este se encontrava
levemente ácido, entre 5-6. Para uma melhora do sinal,
foi necessário adicionar piridina na fase móvel.
DAD1 A, Sig=400,8 Ref=600,100 (FEN0910\AMOST009.D)
mAU

60

50
Com Piridina
40

30

20

10

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 min


DAD1 A, Sig=400,8 Ref=600,100 (FEN0910A\AMOST009.D)
mAU

40

35

30
Sem piridina
25

20

15

10

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 min

Figura 15: cromatograma com e sem adição de piridina na fase móvel

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 Análise de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

 Utilização do solvente de um fabricante B necessita uma


etapa de purificação passando o solvente por uma
coluna de alumina para remoção de contaminantes que
interferem no sinal.
DAD1 A, Sig=302,16 Ref=360,100 (OVA0911\AMOST052.D)
mAU

20

15 Fabricante A
10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 min
DAD1 A, Sig=302,16 Ref=360,100 (OVA0911\AMOST023.D)
mAU

20

15
Fabricante B
10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 min

Figura 16: n-Heptano do fabricante A e fabricante B

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◦ Colunas:
◦ Deixar a coluna equilibrar com a fase móvel antes da injeção
da amostra, principalmente após uma análise usando
gradiente.

◦ Nunca deixar a coluna exposta a fontes instáveis de radiação


térmica, tais como os raios solares que penetram através de
janelas.

◦ Queda da coluna pode causar uma perturbação no leito da


coluna afetando a separação.

◦ Evitar que ocorra aumento de pressão no sistema


cromatográfico.

50

25
◦ Não deixar que o leito da coluna seque.

◦ Sempre antes de colocar uma coluna em uso avaliar a sua


eficiência .

◦ Guardar a coluna no solvente adequado. Hexano para fase


normal e metanol para fase reversa.

◦ Nunca guardar uma coluna com soluções tampão ou


solventes halogenados.

◦ Fechar as conexões da coluna apenas o suficiente para


evitar vazamentos. O aperto exagerado danifica as roscas
das conexões.

51

 Detectores:
◦ Mudanças em parâmetros de temperatura e pressão durante
uma análise, influenciam a resposta do detector.

◦ Impurezas da amostra e até mesmo resíduo da fase móvel


evaporada produzem a diminuição da resposta do detector
e interferência.

◦ A limpeza da célula do detector pode acontecer passando


solvente pelo sistema sem coluna. Pode-se usar HNO3 6N,
água, metanol, clorofórmio e hexano.

◦ Picos achatados podem ser causados por soluções


concentradas, fazendo com que a resposta do detector seja
não- linear

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Bombas:

◦ Mudanças de pressão no cromatógrafo pode ser


consequência de filtros porosos entupidos, variação de
vazão, vazamentos, bolha de gás na cabeça da bomba.

◦ Bolhas de gás podem causar variações na pressão e


consequentemente nos tempos de retenção.

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 Bombas:
◦ Verificar a miscibilidade dos solventes quando houver
mudança de fase móvel.

◦ Exemplo: uma fase móvel com água mudando para


hexano. Primeiro bombear água, depois acetona e por fim
o hexano.

◦ Fase móvel deve ser filtrada.

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 O que Causa Perda de Resolução:
◦ Componentes fortemente retidos na coluna;
◦ coluna fisicamente danificada;
◦ perda de eficiência da coluna;
◦ Coluna com sobrecarga de amostra;

 O que Causa Diminuição do Tempo de Retenção:


◦ Perda de sítios ativos da coluna;
◦ A coluna pode não ter sido regenerada suficientemente
após a eluição de um gradiente;
◦ Contaminantes podem estar adsorvidos na coluna;

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 O Que Causa o Aumento do Tempo de Retenção:


◦ A taxa de fluxo do solvente é muito baixa;
◦ Falta de solvente;
◦ Contaminantes podem estar adsorvidos na coluna;

 O que Causa Alargamento na forma do pico:


◦ Força iônica da fase móvel pode estar muito baixa;
◦ Coluna pode estar com sobrecarga de amostra;
◦ Adsorção da amostra;
◦ Coluna perdeu eficiência;

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Resolução inadequada em todo cromatograma-
Solvente forte em todo cromatograma

Resolução inadequada no início do cromatograma- solvente A


é muito forte e causa uma eluição rápida

Resolução inadequada no final do cromatograma- a troca do


solvente A por B não foi suficientemente forte e causa
uma eluição rápida

Para aumentar a resolução diminuir a força do solvente

Se for fase normal –diminuir a polaridade

Se for fase reversa –aumente a polaridade

Diminuir as condições iniciais

Aumentar o tempo do gradiente

Dobrar o fluxo

33
Resolução inadequada no início do cromatograma

Diminui o tempo do gradiente no início e aumenta o tempo no final

Diminui o tempo do gradiente no início e aumenta o tempo no


final, variando o grau de mudança

Diminui as condicões iniciais

Resolução ruim no final do cromatograma

Aumentar a proporção do solvente no início e diminuir no final

Aumentar a proporção do solvente no início e diminuir no final


variando o grau de mudança

Diminuir as condições finais

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K’-Fator de capacidade- velocidade que o
composto migra na coluna

N-Eficiência da coluna

Seletividade- medida de separação

Muito Obrigado!

◦ Roberta Hadad Cintra


◦ rhadad56@hotmail.com
◦ 9922-9987

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COLLINS, C. H.; Introdução a métodos cromatográficos. 6.
Ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1995.

CIOLA, R. Fundamentos de cromatografia a líquido de alto


desempenho HPLC. São Paulo: Ed. Edgard Blücher, 1998.

71

 CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto


Desempenho. 1.ed. São Paulo:Editora Edgard Blucher
Ltda,2000
 COLLINS, C.H; BRAGA, G.L.; BONATO, P.L. Introdução a
métodos cromatográficos. 7ed. Campinas:Editora da
Unicamp, 1997
 RUNSER, Dennis.J. Maintasining and Troubleshooting HPLC
Sustems. New York, J.Wiley and Sons, 1981
 YOST, R.W.,ETTRE,L.S.& CONLON, R.D. Pratical liquid
chromatography – na introduction. Perkin-Elmer Corporation,
1980
 McNair, H.M.,ESQUIVEL B.H. Cromatografia Líquida de Alta
´Presión. 2ed .EUA 1980

72

36