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Agosto/2011
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Como toda técnica analítica a Cromatografia Líquida tem
suas vantagens e desvantagens.
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Cromatografia Líquida Clássica: colunas de vidro, sob
pressão atmosférica, com fluxo de fase móvel devido à força
da gravidade.
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Troca iônica - diferentes tendências dos componentes iônicos
ou ionizados da amostra a permutar com os íons da fase
estacionária.
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Tempo de Retenção de A (tra): É o tempo que a amostra
permanece dentro da coluna e se mede desde o momento em
que a amostra é introduzida no sistema até o momento em
que se obtém o ponto máximo do pico da amostra.
Tra= tr-to
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Fator de Seletividade (α) de A e B: é a razão entre os
coeficientes de partilha do soluto mais retido pelo menos
retido. É uma medida de separação de dois solutos A e
α = K’B / K’A
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Eficiência da coluna:pode ser calculada pelo número de
pratos teóricos (N). Este termo se origina de colunas de
destilação e é usado como uma medida da eficiência de
colunas cromatográficas.
N = 16 (Tra / la)2
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Figura3: Exemplo de pico com coluna com baixa Figura4: cada pico tem a mesma área, porém
eficiência e alta eficiência número de pratos teóricos diferentes
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O sistema cromatográfico é composto de:
Figura 5: sistema cromatográfico
Sistema de Detecção
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Os aspectos mais importantes são a pressão máxima de
operação, o fluxo de 0,5 a 10 ml/min, reprodutibilidade e
constancia do fluxo.
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Muitas vezes, o fator limitante na precisão das medidas em
cromatografia líquida está na reprodutibilidade com a qual as
amostras podem ser introduzidas na coluna.
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Detector Índice de Refração: é considerado um detector
universal,tem menos sensibilidade do que detectores de
UV. Não há destruição da amostra. Muito sensível a
mudança de temperatura e pressão.
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Detector Evaporativo de Espalhamento de Luz: É considerado
um detector universal e que pode ser utilizado com gradiente
de eluição na determinação de compostos semi-voláteis, não
voláteis e que não possuem grupos cromóforos.
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Figura 7: colunas
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O aço inoxidável é o material mais usado. Há também as
colunas de vidro com paredes grossas, mas não são
resistentes a altas pressões e dificuldades de conecção
metal-vidro.
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Quanto maior o tamanho da partícula porosa, mais lento o
processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a
transferência de massa entre a fase estacionária e a fase
móvel.
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Fase normal:
Fase estacionária polar – Sílica, alumina, grupo amino(-NH2),
grupo nitrilo (-CN)
Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter
isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da Fase móvel, o tempo de
eluição diminui.
Fase reversa:
Fase estacionária não polar – grupos octil (-C8H17),
octadecil(-C18H37)
Fase móvel relativamente polar (água, metanol, acetonitrila)
O componente mais polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da fase móvel, o tempo de
eluição aumenta.
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Para registrar ou manipular os dados obtidos pelos
detectores na CLAE pode se usar um registrador ou mesmo
um microcomputador. Atualmente, para manter ou aumentar
a versatilidade, exatidão e precisão, o microcomputador é
mais utilizado. Pode processar os dados e também controlar
parâmetros de análise.
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FIGURA 8: Cromatograma, obtido por CLAE, da análise de uma mistura contendo as substâncias enumeradas na figura e seus picos
correspondentes de acordo com o tempo em que foram determinadas pelo método. Fonte: (CIOLA, 1998)
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Verdadeiro motor das separações
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Apesar dos solventes CLAE serem filtrados pelo fornecedor,
recomenda-se sua filtração antes do uso. adequado. Como
mais uma precaução, aconselha-se a utilização de um filtro
no reservatório.
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◦ Qual coluna?
◦ Qual fase móvel?
◦ Qual detector?
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A regra básica é:
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Para melhorar a eficiência da separação:
◦ Baixar o fluxo;
◦ Trocar coluna;
◦ Reduzir concentração da amostra e/ou volume de injeção.
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Sempre correr um branco antes de começar a analisar a
amostra. Este procedimento é importante para saber se um
pico presente é proveniente da amostra ou impurezas do
solvente.
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Quando usar análise com gradiente de eluição?
As vantagens que oferecem esta técnica são análises mais
rápidas, melhora a separação, maior simetria dos picos.
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Figura 11: Cromatograma mostrando o efeito típico de uma fase móvel de baixo poder
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Uma fase móvel mais “forte” foi usada, diclorometano. O
quinto componente foi eluído, o tempo de análise reduzido,
mas perdeu-se a resolução entre os picos 1 e 2, 3 e 4.
Figura 12: Cromatograma mostrando o efeito típico de uma fase móvel excessivamente forte
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Amostras:
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Fase móvel:
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Figura14: Diferença de tempo de retenção com solvente de fabricantes diferentes
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Determinação de fenalenona
Houve mudança de fabricante do solvente,
diclorometano. Apareceu uma “dobra” de pico.
Ao medir o pH, observou que este se encontrava
levemente ácido, entre 5-6. Para uma melhora do sinal,
foi necessário adicionar piridina na fase móvel.
DAD1 A, Sig=400,8 Ref=600,100 (FEN0910\AMOST009.D)
mAU
60
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Com Piridina
40
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30
Sem piridina
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Análise de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
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15 Fabricante A
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0 5 10 15 20 25 30 35 40 min
DAD1 A, Sig=302,16 Ref=360,100 (OVA0911\AMOST023.D)
mAU
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Fabricante B
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0 5 10 15 20 25 30 35 40 min
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◦ Colunas:
◦ Deixar a coluna equilibrar com a fase móvel antes da injeção
da amostra, principalmente após uma análise usando
gradiente.
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◦ Não deixar que o leito da coluna seque.
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Detectores:
◦ Mudanças em parâmetros de temperatura e pressão durante
uma análise, influenciam a resposta do detector.
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Bombas:
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Bombas:
◦ Verificar a miscibilidade dos solventes quando houver
mudança de fase móvel.
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O que Causa Perda de Resolução:
◦ Componentes fortemente retidos na coluna;
◦ coluna fisicamente danificada;
◦ perda de eficiência da coluna;
◦ Coluna com sobrecarga de amostra;
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Resolução inadequada em todo cromatograma-
Solvente forte em todo cromatograma
Dobrar o fluxo
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Resolução inadequada no início do cromatograma
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K’-Fator de capacidade- velocidade que o
composto migra na coluna
N-Eficiência da coluna
Muito Obrigado!
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COLLINS, C. H.; Introdução a métodos cromatográficos. 6.
Ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1995.
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