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Práctica 1.2.

Espectrofotometrı́a
Biosensores
Alumna: Carreño Castillo Marı́a del Carmen
Docente: Juan de Dios Galindo de la Rosa1
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Universidad Autónoma de Querétaro
La espectrofotometrı́a es uno de los métodos experimentales más usados para la detección de
moléculas especı́ficas, se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración.

Keywords: longitud de onda, absorbancia, transmitancia.

I. INTRODUCCIÓN pero la mayorı́q se encuentran fuera del rango percepti-


bles al ojo humano. Estas radiaciones se pueden describir
La espectrometrı́a es una propiedad de la interacción como partı́culas y como ondas. Ësta última, se basa en
de la luz con una gran cantidad de especies quı́micas nos que la luz consta de campos eléctricos y magnéticos que
permite identificar y cuantificar analitos, dando lugar a osculan sinusoidalmente y en forma perpendicular a la
una rama de la quı́mica analı́tica denominada espectro- dirección de traslación por el espacio.
fotometrı́a.
La espectrofotometrı́a estudia los fenómenos de inter-
acción de la luz con la materia. En general, cuando una
lámpara ilumina cualquier objeto, pueden suceder algu-
nos fenómenos: La luz puede ser emitida, reflejada, trans-
mitida o absorbida. Desde que sabemos que la energı́a no
puede ser destruida, la cantidad total de luz debe ser
igual al 100 %; por lo tanto, cuando un objeto es ilumi-
nado, se puede medir cuánta radiación ha sido reflejada
o transmitida y podemos decir entonces cuánta fue ab-
sorbida, cuál es la cantidad que ha interactuado con el
objeto.
La espectroscopı́a ha jugado una parte importante en
el desarrollo de la bioquı́mica. Se ha utilizado para me-
dir velocidades de reacción catalizadas por enzimas, para
medir concentraciones de compuestos, determinar con-
formaciones estructurales e interacciones moleculares.
Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio
comprenden a la luz visible y ultravioleta. Para enten-
der mejor cómo se lleva a cabo el fenómeno de la es-
pectroscopı́a, es necesario entender lo que es la radiación
electromagnética y la Ley de Lambert-Beer.
Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado para Figura 1. Espectro de radiaciones electromagnéticas.
determinar a qué longitud de onda la muestra absorbe
la luz y la intensidad de la absorción. Aunque varı́an
En cada una de estas ondas, la distancia entre dos cres-
en el diseño, todos los espectrofotómetros consisten de
tas (o valles) consecutivas corresponden a la longitud de
una fuente de luz, un selector de longitud de onda, un
onda. El producto de ésta por la frecuencia (el número
contenedor transparente en el cual se deposita la muestra,
de ciclos por segundo en unidades de Hertz, Hz), es la
un detector de luz y el medidor.
velocidad de la luz, c (en condiciones de vacı́o).
En cualquier medio material, la velocidad de propa-
gación es inferior a ésta y queda dada por 10 nc =
II. ANTECEDENTES
2.9979X10 (cm/s), donde n es el ı́ndice de refracción del
medio. La radiación sólo se absorbe o emite en unidades
A. Espectro electromagnético definidas llamadas fotones. La energı́a de los fotones es
proporcional a la frecuencia de radiación.
La luz per se, puede explicarse como un conjunto de El conjunto de radiaciones electromagnéticas se llama
radiaciones que se mueven por todo el espacio. Aquellas espectro electromagnético y es conveniente agruparlas en
detectables por nuestro ojo, corresponden a la luz visible, regiones para poder conocer sus propiedades. En la figura
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1 se muestran las zonas del espectro según la clasificación representar como una reacción quı́mica y en un diagrama
más aceptada. Como se puede observar la zona del visible de energı́a.
(radiaciones percibidas por nuestro ojo) es muy pequeña Para realizar una identificación generalmente se hace
en comparación con la gran amplitud del espectro. Aun- incidir sobre la sustancia estudiada radiaciones electro-
que hablamos de una radiación determinada (Λ), fı́sica- magnéticas de diferente energı́a. Normalmente se estudia
mente es imposible aislar dicha radiación. Siempre po- un rango de radiaciones y se va aumentando (o disminu-
dremos obtener un rango de radiaciones pequeño según yendo) la longitud de onda de las radiaciones incidentes
la exactitud del dispositivo de selección (difractares de desde un extremo del rango hasta el extremo opuesto. Ası́
radiación y filtros), pero nunca una sola. De la misma se obtiene un espectro de absorción de la sustancia, que
manera que no podemos obtener o aislar un punto de se puede representar gráficamente y este espectro es como
una recta, sino un trozo pequeño. una huella digital de esa molécula en donde se encuentran
registrados todos los enlaces y sus transiciones correspon-
dientes. Entonces, si tenemos el espectro de absorción de
B. Espectrofotometrı́a una molécula podemos identificarla con bastante exac-
titud. La gráfica de la probabilidad de absorción contra
La espectrofotometrı́a es una técnica que mide la inter- longitud de onda se denomina espectro de absorción y la
acción de las moléculas con la radiación electromagnéti- espectroscopı́a de absorción se refiere a la adquisición y
ca. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz análisis de los datos de absorción.
ultravioleta de los espectros electromagnéticos presenta La absorción de energı́a de longitud de onda Λ resulta
una energı́a de 150- 400 kJmol-1. La energı́a de la luz es de la diferencia de energı́a entre niveles si
usada para promover electrones de un estado de excita-
ción a otro. Un espectro es obtenido cuando la absorción
de luz es medida en función de una frecuencia o longi- hc
λ=
tud. Moléculas con electrones deslocalizados en sistemas E2 − E1
aromáticos a menudo absorben la luz a 150-400 nm (ul-
travioleta) o en la región visible de 400-800 nm. donde E1 es el nivel de energı́a de la molécula antes
La espectrofotometrı́a de absorción es usualmente usa- de la absorción y E2 es un nivel de energı́a alcanzado
da con moléculas disueltas en un solvente transparente. durante la absorción. En cambio entre niveles de energı́a
La absorbancia de un soluto depende linealmente de la se llamatransición, que representa la energı́a requerida
concentración y por consiguiente la espectrofotometrı́a para mover un electrón de una órbita a otra.
de absorción es ideal para hacer mediciones cuantitativas.
La longitud de absorción y la fuerza de absorbancia de Ley de Lambert-Beer
una molécula no sólo depende de la naturaleza quı́mica, La cantidad de radiación electromagnética absorbida por
si no del ambiente molecular en donde se encuentre el un analito se puede relacionar cuantitativamente con la
cromóforo. La espectrofotometrı́a de absorción es por concentración de dichas sustancias en solución. La trans-
lo tanto una excelente técnica para seguir reacciones mitancia (T) se define como la fracción de radiación inci-
de unión a ligando, catálisis enzimáticas y transiciones dente trasmitida por la disolución. Si la potencia radiante
conformacionales en proteı́nas y ácidos nucleicos. Las que incide sobre la disolución es Po y P la potencia ra-
mediciones espectroscópicas son muy sensibles y se diante que sale.
requieren pequeñas muestras de material para el análisis. Transmitancia
Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P)
Las moléculas absorben radiación electro- por una muestra y la energı́a o luz incidente (Po) sobre
magnética ella. Tanto la energı́a radiante incidente como la trans-
Cuando una onda encuentra a una molécula, puede cam- mitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.
biar la dirección de propagación (dispersión) de esa onda,
o puede ser absorbida. En este último caso, una molécula
absorbe un fotón y su energı́a interna aumenta para en- T = P/P0 = 10−abc %T = 100P/P0 (2.1)
trar a un estado inestable, por lo que rápidamente vuelve
a liberar esa energı́a sobrante y vuelve al estado inicial
que es más estable. El estado inicial se denomina estado Absorbancia
fundamental y el estado más energético se llama estado Se define como la cantidad de energı́a radiante absorbida
excitado. La absorción de radiación produce un paso del por una sustancia pura o en solución. Matemáticamente,
estado fundamental al excitado (excitación) y en el pro- corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia,
ceso contrario (llamado relajación) hay una liberación de T, expresada como fracción decimal % T, transmitancia
energı́a. Esta energı́a liberada en la relajación puede ser expresada como porcentaje.
en forma de calor o en forma de radiación electromagnéti-
ca otra vez. Este último proceso de desprendimiento de
radiación se llama de emisión. Estos procesos se pueden A = −logT = 2 − log %T A = abc (2.2)
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C. Espectrofotómetros

El espectrofotómetro es el nombre genérico de todos


los aparatos basados en esta técnica. El espectrofotóme-
tro puede estar equipado con un sólo detector o un de-
tector multicanal, configurados por medidas con un solo
rayo (SB) o doble rayo (DB) y designados para la medi-
ción de una longitud fija o para adquirir una espectro de
absorción completo.
El espectrofotómetro de un solo detector es el más
común y en este caso particular la banda de longitud
Figura 2. Diagramas de espectofotómetros de absorción mo-
de la fuente de radiación es trasmitida por el selector de
lecular UV-visible. a) Espectómetro con detector simple.
longitud a la muestra y finalmente al detector como se b)Espectómetro con doble rayo.
muestra en la figura 5a y 5b. Con el equipo SB un rayo
pasa a través de la muestra y este coincide con el detec-
tor. En los equipos DB (figura 5b), el rayo es desviado a
una longitudes seleccionada con un espejo rotatorio obte- Los espectrofotómetros de barrido (scanning) usual-
niendo dos rayos, pasando alternativamente por la celda mente proporcionan amplios rangos de longitudes de on-
que contiene la muestra y la celda de referencia. El rayo da para analizar (de 1 a 2000 nm min-1). Los espectro-
que viene de la muestra y de la referencia se mezcla, y fotómetros rápidos basados en un componente óptico de
éste llega hasta el detector. oscilación en el monocromador son capaces de adquirir es-
pectros en un segundo o menos. Muchos espectrofotóme-
tros de longitud fija o de barrido de varias longitudes
ya sean automáticos o manuales, permiten la colocación
1. Componentes del espctrofotómetro
de filtros en el tren óptico para reducir la pérdida de
radiación de diferencias significativas en la longitud. En
Fuentes: Las fuentes de radiación son generalmente espectrofotómetros multicanales la resolución de la lon-
lámparas de tungsteno o tungsteno-halógeno para pro- gitud es determinada por el tamaño del pixel en el diodo.
veer de una radiación continua adecuada del espectro vi- Por lo tanto, la entrada a la abertura del espectrógrafo
sible al infrarojo cercano. Para la capacidad de rdiar con es fijada a la misma anchura de abertura que la anchura
los UV se necesita una lámpara de H2 o D2 . La lámpara de un diodo; la resolución es del orden de 1 a 2 nm.
de D2 es generalmente por sobre la de H2 porque emi-
te una radiación tres veces mayor. Por simplicidad, una
lámpara de D2 y H2 puede servir como una sola fuente
para emitir en la región UV-visible aunque la radiación
en el espectro visible es más pequeña que la emitida por
una lámpara de tungsteno y al mismo tiempo poco esta-
ble.
En algunos instrumentos la fuente de radiación es
modulada con un instrumento mecánico.
Figura 3. Espectómetro de un solo rayo con abertura en forma
Selector de longitud: Una porción de la radiación de v (entrance slit).
emitida por la fuente es colectada y dirigida al selector
de longitud o a la muestra con algunos lentes o espejos.
En instrumentos con un solo detector, el selector de lon-
gitud es normalmente puesto antes del compartimento en
donde se encuentra la muestra para minimizar el calenta- 2. Celdas
miento o fotodescomposición de la muestra por radiación
a longitudes no monitoreadas. Si este efecto no es signifi-
cante, el selector de longitud puede ser pasado después de Existe una amplia variedad de celdas (diferentes ma-
la celda del compartimento de la muestra. Con espectro- teriales, tamaños y formas). Los materiales más comunes
fotómetros multicanales, el detector multicanal debe ser de los que están constituidos son vidrio, cuarzo, sı́lice o
colocado en el plano focal del espectrográfo; la celda con varios plásticos. Las más utilizadas son las celdas de cuar-
la muestra tiene que ser puesta antes que el selector de zo y sı́lice para medir la absorbancia a longitudes de 300
longitud e iluminado con radiación blanca. Los fotóme- nm, donde las celdas de vidrio y otros plásticos absorben
tros emplean la interferencia con filtros para seleccionar significantemente. En el caso de muestras que se leen en
la longitud deseada, únicamente se necesita tener los fil- el infrarrojo existen celdas especiales de materiales como
tros correspondientes. NaCl, ArCl y KBr.
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III. METODOLOGÍA IV. RESULTADOS

Se nos entregaron dos soluciones de sustancias desco- 1. Solución violeta


nocidas, con la referencia de que se encontraban a 1 ppm.
A partir de éstas, se obtuvieron cinco muestras con con-
centraciones de 0 ppm (agua destilada), 0.75 ppm, 0.68 Concentración (ppm) Absorbancia
ppm, 0.5 ppm, 0.32 ppm y 0.15 ppm, respectivamente; 0 0
para luego colocarlas en el espectrofotómetro un orden 0.15 0.014
ascendente, y obtener su curva de calibración. 0.32 0.025
0.5 0.159
0.68 0.196
0.75 0.277
1 0.353

Figura 5. Gráfico de calibración de solución violeta, a los 590


nm.

Figura 4. Celdas en espectrofotómetro. En el eje x se observan las concentraciones y en el y


las absorbancias respectivas a cada una.

A. Materiales y equipo

5 matraces de aforado

Espectrofotómetro

B. Reactivos
Figura 6. Gráfico de calibración de solución violeta, a los 590
nm con lı́nea de tendencia.
Solución morada a 1 ppm

Cálculos Tomando los valores obtenidos experimen-


Solución naranja a 1 ppm talmente, se calculó la desviación estándar y lı́mites de
desviación (LOD).

Agua destilada Sumatorias


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y = 0,14629 − 0,03949x

Se obtiene el lı́mite de dispersión:

3δ (3)(0,139079970144)
LOD = = = 2,852142391
b 0,14629
Sustraı́do del gráfico y la lı́nea de tendencia, se tiene
que el coeficiente de correlación al cuadrado (R2 ) es de
0.9141, por tanto:

R = 0,9560857702

V. ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 7. Sumatorias obtenidas en Excel. Gráficamente, haciendo referencia a la Fig. 5, se pue-


de observar que los valores de absorbancia aumentan en
relación a la concentración en ppm de la solución analiza-
Varianza: 0.0193432390952
da, sin embargo, como se observa en la Fig. 6, la relación
Desviación estándar (δ)= 0.139079970144
entre lı́nea de tendencia y la curva de calibración no in-
Regresión lineal tersectan mas que en un punto.
Se sabe que el valor de R, que hace referencia a la co-
nΣxy − ΣxΣy
a1 = rrelación que existe entre los valores de la concentración
nΣx2 − (Σx)2 (eje x) y la absorbacia (eje y) es muy cercano a 1 (véase
apartado de cálculos), lo que indica que es una buena
aproximación lineal.
a1 = 0,3825 Con base en esto, se puede inferir que los valores de la
gráfica variaron un poco debido a que la concentración
varı́o un poco, sin embargo, no afectó notablemente su
relación entre los parámetros medidos. Errores relaciona-
dos al manejo del equipo, al equipo per se, y al material
a0 = yavg − a1 (xavg ) empleado.

VI. CONCLUSIÓN
a0 = 0,14629 − ((0,3825)(0,48571)) = −0,03949
La espectrofotometrı́a es un método de gran utilidad
para calcular la curva de calibración, debido a su rapi-
dez, sensibilidad y especificidad, para poder identificar
y = a1 + a0 x los analitos de una muestra desconocida.

[1] C. Brown. Ultraviolet, visible, and near-infered spectrop- [3] D. Freifelder. Physical biochemistry. Chapter 14. 2nd
hotometers. Applied Spectrocospy Reviews, 35(3):151–173, Edition:494–536, 1982.
2000. [4] D. A. Skoog. Fundamentos de quı́mica analı́tica. Research
[2] G. D. Christian. Quı́mica analı́tica. Research Gate, 2 ed, Gate, 4 Edición, 1996.
1981. [5] Jhonson W. C. et Ho P. S. Van Holde, K. E. Principles of
physical biochemistry. pages 394–407, 1998.

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