ANÁLISE DE CITOTOXICIDADE – BIOENSAIO Artemia salina

1) Preparado das soluções

a) Pesar a quantidade de material vegetal a ser utilizado, particioná-lo para

aumentar a superfície de contato com o líquido extrator. O ideal é que o
solvente cubra o material vegetal.
b) Faça uma regra de três para ter o volume adequado para todas as séries
que virão.
c) Utilize a metodologia adequada (infusão, decocção, agitação?). Se
atente para a higienização prévia do material e/ou esterilização).
d) Diluições seriadas devem ser feitas, considerando a concentração final
da solução. Anote sempre os valores desejados entre parênteses.

e) Faça uma tabela para lhe auxiliar:

Descrição nos tubos Quantidade da infusão Quantidade solução salina (pH)
A1, A2, A3 (1) 5 mL -

B1, B2, B3
2,5 mL 2,5 mL
(1:2)

C1, C2, C3
1 mL 4 mL
(1:5)

D1, D2, D3
0,5 mL 4,5 mL
(1:10)

E1, E2, E3
0,25 mL 4,75 mL
(1:20)

Controle negativo - 5 mL
 2) Inserir 10 larvas por tubo de ensaio
a) As larvas devem ser acondicionadas nas soluções. Se atente para que
o extrato esteja frio e livre de contaminantes.
b) Identifique previamente a série.
c) Não utilize a mesma pipeta ou a lave para inserir as larvas nas
diferentes séries.
d) Não tampe os tubos de modo a impedir a passagem de O 2
e) Anote no livro ata o dia, a hora e os autores no final procedimento.

3) Avaliação
a) Faça uma tabela e anote o número de sobreviventes por tubo
Série 1 2 3
A

B (1:?)

C (1:?)

D (1:?)

E (1:?)

CN

b) Cálculo do percentual de mortalidade

% mortalidade = 100 – (Média dos indivíduos vivos por concentração) 100
Média dos indivíduos vivos do controle negativo

Calcular para cada concentração (por tratamento)

%MA = 100 – 0x100/10 = ?
%MB = 100 – 4 x 100/ 10 = ?
%MC = 100 - 7,3 x 100/10 = ?
%MD = 100 – 8,3 x 100/10 = ?
%ME = 100 – 10 x 100/10 = ?
 c) Construir, NO EXCEL, o gráfico da regressão linear relacionando %M
pelo log10 de cada concentração. Veja o exemplo hipotético.

A partir da concentração do extrato de [A] = 8,15 mg/mL, determinou-se as

outras: [B] = 4,07, [C] = 1,63, [D] = 0,81, [E] = 0,40 (o log desses valores serão
o eixo X) e a %M o Y correspondente.

%M Linear (%M) y = 74.246x + 22.387

R² = 0.95
120

100

80
MORTALIDADE (%)

60

40

20

0
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-20
LOG [ ]

d) Determina-se a equação da reta e substitui-se o y por 50.

e) Eleva-se o valor encontrado à potência da base 10: 10x e o resultado

será a DL50 (ug/mL).

y = 74,246x + 22,387

50 – 22,387 = 74,246x

X = 27,613/74,246

X = 0,371

100,371 = (2,34 mg/mL ou 2.340 µg/mL)

DL50 = 2.340 µg/mL ou ppm

O critério de classificação dos extratos frente Artemia salina com base nos
valores das CL50 foi estabelecido por (DOLABELA, 1997), sendo definido como
CL50 ≤ 80 μg/mL, o produto é altamente tóxico; CL50 entre 80 a 250 μg/mL, o
produto é moderadamente tóxico e CL50 ≥ 250 μg/mL, o produto é levemente
tóxico ou atóxico. (MEYER, 1982) utiliza o critério de avaliação em que considera
a amostra tóxica ou ativa as que apresentarem DL50 < 1000 μg/mL e amostras
atóxicas ou inativas as que apresentarem CL50 > 1000 μg/mL. (Cálculos de
CL50).

Pelas duas classificações nosso substrato é levemente tóxico ou

atóxico ou, ainda, consiste em uma amostra inativa.

A correspondência para o número de colheres:

2 colheres de sopa em 240 mL = 8150 µg/mL

X colheres --------------------------- 2340 µg/mL

X = 0.57, ou seja, corresponde à aproximadamente meia

colher de sopa do pó solúvel das flores do Bacuri.

1:5 é igual a 1630 µg/mL