¿Qué es la HPLC y Cómo Funciona?

[sg_popup id=”96″ event=”onload”][/sg_popup]Autor invitado: Dr. Ramkumar Dhandapani

El término cromatografía procede de la palabra griega chroma- que significa color y -

graphein que significa escribir. El primer uso registrado de la cromatografía en columna se

le otorga al científico ruso Mikhail Tsvet que trituró carbonato de calcio en un tubo y

posteriormente agregó hojas de una planta verde homogeneizadas, seguido de un solvente

orgánico. Tsvet observó bandas de colores separadas a medida que el solvente pasaba a

través del tubo. Así es como la cromatografía práctica comenzó al principio, separando con
éxito varios pigmentos de las hojas. En el mundo de hoy, hay muchos analitos que son

incoloros y están separados por técnicas cromatográficas, todavía se le conoce con el mismo

nombre.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Es un tipo de cromatografía en columna en el que por acción de una bomba, se hace pasar

una mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como

fase móvil. La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene la fase

estacionaria a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la

interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria.

Cromatografía líquida de Ultra-Alta eficacia (UHPLC)

Es una tecnología basada en el principio de que un tamaño de partícula menor conlleva una

mayor eficiencia, rápidas separaciones con mayor resolución y sensibilidad. Sin embargo,

para resistir la presión extrema de las partículas más pequeñas de 2 µm, el equipo necesita

ser capaz de trabajar a alta contrapresión. La eficiencia de estas columnas no debe perderse

en el resto del equipo, debido al volumen muerto, por ello se diseñaron equipos capaces de
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trabajar a altas presiones.

Debido a que los instrumentos de UHPLC tienen un coste elevado, a finales del 2000,

Phenomenex lanzó las columnas Kinetex 2,6 μm con tecnología Core-Shell, que proporciona

un rendimiento UHPLC en un equipo HPLC tradicional. De esta forma se puede utilizar el

instrumento de HPLC tradicional que se posee en el laboratorio y lograr un rendimiento

equivalente de UHPLC.

Modos de separación.

Hay muchos modos de separación en cromatografía y cada uno tiene sus propios principios.

A continuación presentamos una guía de selección de columnas de HPLC para ayudar a los

lectores a elegir el modo de análisis correcto. Aunque hay muchos modos de separación

disponibles para resolver las mezclas en un cromatógrafo la separación mediante Fase

Reversa (RP) es el modo más común en cromatografía líquida.

“¿Por qué la fase reversa se llama fase reversa?”

La respuesta es simple:

La cromatografía evolucionó a partir del uso de la fase estacionaria polar y de un eluyente

no polar como componente principal de la fase móvil, por ello se consideró la práctica

normal, de ahí el nombre de fase normal. Si bien este modelo separó componentes basados ​

en su naturaleza polar, hubo una gran cantidad de mezclas de analitos que no eran polares y

tenían características hidrofóbicas que necesitaban separación.

El uso de una fase estacionaria no polar, con una fase móvil polar ayudó a separar estos

analitos hidrofóbicos. Dado que esta práctica es inversa a la fase normal, se utiliza el
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término fase reversa. Esto es similar a llamar a un jugador de ping-pong derecho como

normal y un jugador de ping-pong zurdo como el original.

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Proceso de separación en Fase Reversa

Ahora que sabemos que el modo más popular de cromatografía líquida es la fase reversa,

vamos a explorar cómo funciona.

A continuación se muestra un esquema del proceso de separación. La mezcla de analitos se

representa por puntos azules, morados y rojos, que se introducen de manera conjunta en la

columna que contiene una fase estacionaria de fase reversa no polar. Las flechas rojas

representan la dirección del flujo de la fase móvil. Cuando la mezcla de analitos mixtos

entran en la columna, la fase móvil empuja los analitos por la columna. A medida que

avanzan entran en contacto con la fase estacionaria. Los analitos que tengan una mayor

afinidad por la fase estacionaria (puntos azules) serán retenidos más fuertemente y eluirán

más tarde en la carrera. Por lo tanto, puede separar los analitos basándose en la intensidad

con la que interactúan con la fase estacionaria.

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En el siguiente ejemplo se representa una fase estacionaria, hidrofóbica no polar, más

concretamente una C18. La fase móvil consiste en un componente acuoso polar, hidrófilo,

usualmente agua y acetonitrilo o metanol. Los analitos se separarán basándose en su

afinidad relativa por estas dos fases. Los compuestos hidrófobos, tales como el benzopireno,

tendrán una fuerte afinidad por la fase estacionaria hidrófoba, y estarán fuertemente

unidos. Los compuestos hidrófilos tales como sulfato de etilo tendrán poca afinidad por la
fase estacionaria y permanecerán principalmente en la fase móvil y se transportarán

rápidamente a través de la columna.

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Aunque la separación en fase reversa se produce por la interacción hidrofóbica, existen tres

mecanismos primarios de interacción que dictan el comportamiento cromatográfico global.

Esto incluye:

1. Interacciones hidrofóbicas

2. Interacciones polares

3. Interacciones iónicas

A parte de esas tres interacciones, la selectividad estérica y la forma de la molécula en

ocasiones también pueden contribuir a la interacción. Usando el ejemplo del tapentadol, una

molécula farmacéutica típica de pequeño tamaño, podemos mostrar mejor estos tres tipos

de interacción, ya que posee componentes polares, hidrofóbicos y también iónicos.

Interacciones Hidrofóbicas
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Es el mecanismo primario en RP-HPLC y que determina el comportamiento de retención. Es

decir la interacción hidrófoba entre el ligando de fase estacionaria no polar (por ejemplo

C18) y la naturaleza hidrófoba de la molécula de muestra (por ejemplo, el esqueleto de

carbono).

Ésta es una interacción débil y transitoria entre una fase estacionaria no polar y las

moléculas, que incluye interacciones hidrofóbicas y de van Der Waals. Se puede predecir

una estimación razonable de la retención basada en el valor Log P, o coeficiente de

coeficiente de reparto octanol-agua. El Log P es la Relación entre octanol y agua en una

extracción líquido-líquido. En otras palabras, cuanto más hidrofóbica es una molécula,

mayor es el valor de Log P que tiene, lo que se traduce en mayor retención en RP-HPLC.

Interacciones Polares
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Estas son interacciones que ocurren entre los grupos funcionales polares de los analitos.

También se producen entre silanoles residuales, grupos polares incrustados, grupos polares

superficiales o grupos terminales polares en la fase estacionaria. Interactúan con el analito

a través de enlaces de hidrógeno y dipolo-dipolo. Estas interacciones son relativamente

débiles y transitorias en comparación con la interacción de intercambio iónico.

Interacciones de Intercambio Iónico

La mayoría de las fases estacionarias en RP se basa en un soporte de sílice a la que se le

ancla una fase no polar tal como C18. Los fabricantes de columnas cromatográficas como

Phenomenex, tratan de lograr la inactivación completa de todos los grupos silanol de la

sílice, sin embargo este proceso no puede eliminar el 100% de los grupos, dando lugar a

grupos silanol residuales en superficie (Si-OH) que están ocultos. Estos silanoles pueden

desprotonarse y adquirir una carga negativa, e interaccionar iónicamente con moléculas

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básicas de analito cargadas positivamente. Estas interacciones de intercambio iónico son

muy fuertes y lentas, en contraste con las interacciones hidrofóbicas y polares. Por lo tanto,

cuando ocurre intercambio de iones, los analitos experimentan diferentes tasas de

interacción (lento vs rápido), y esto puede conducir a la distorsión de pico. Este es un

ejemplo clásico de analitos básicos que interactúan con silanoles residuales, que pueden ser

controlados neutralizando el silanol o neutralizando el analito analizándolos a pH alto.

Para más información sobre HPLC/UHPLC y las diferentes columnas que pueden utilizarse,

por favor visite nuestra web.

Recursos Relacionados:
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“EFECTOS DE CAMBIAR EL DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA EN

APLICACIONES DE LC-MS – PARTE 1”

“¿ES SEGURO INYECTAR AGUA EN CROMATOGRAFÍA DE GASES?”

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¿Qué es la HPLC y Cómo Funciona?

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El Dr. Ramkumar explica qué es la HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia) y cómo

funciona. Aprenda sobre el proceso de separación y mucho más.

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Dr. Ramkumar Dhandapani