Resolviendo el acertijo de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos

mendelianos en la era de la secuenciación de la próxima generación: de un solo

gen, paneles de genes, del exoma / genoma

Yuan Xue, PhD, FACMG 1, Arunkanth Ankala, PhD 1, William R. Wilcox, MD, PhD 2 y
Madhuri R. Hegde, PhD, FACMG 1

La secuenciación de la próxima generación está cambiando el paradigma de pruebas

genéticas clínicas. Hoy en día hay numerosas pruebas moleculares disponibles,
incluyendo las pruebas de un solo gen, paneles de genes, y la secuenciación del exoma o
la secuenciación del genoma. Como resultado, los médicos que ordenan enfrentan el
acertijo o adivinanza de seleccionar la mejor herramienta de diagnóstico para sus
pacientes con enfermedades genéticas. Pruebas de un solo gen son las más adecuadas
para condiciones con características clínicas distintivas y una mínima heterogeneidad en
el locus. Las pruebas de panel de gen basadas en la secuenciación de la próxima
generación, que pueden ser complementadas con matriz de hibridación genómica y otros
métodos auxiliares, proporciona un enfoque comprensible e integral para los trastornos
heterogéneos. La secuenciación del exoma y la secuenciación del genoma tienen la
ventaja de ser imparciales con respecto al conjunto de genes que analizan, permitiendo el
interrogatorio de casi todos los genes del genoma humano. Sin embargo, las limitaciones
actuales de la tecnología de secuenciación de la próxima generación y nuestras
capacidades de interpretación múltiple o variable nos advierten contra el ofrecimiento de
secuenciación del exoma o la secuenciación del genoma, ya sea como enfoques de
diagnóstico independiente o de primera elección. Un creciente interés en la medicina
personalizada requiere la aplicación de la secuenciación del genoma en el diagnóstico
clínico, pero los principales retos deben abordarse antes de que su pleno potencial pueda
ser realizado. En este caso, se propone un algoritmo de prueba para ayudar a que los
médicos opten por la herramienta de diagnóstico molecular más adecuada para cada
escenario.

Genet Med la publicación anticipada en línea del 18 de septiembre de 2014

Palabras clave: exoma secuenciación; panel de gen; pruebas de diagnóstico molecular;

secuenciación de próxima generación; prueba de un solo gen

INTRODUCCIÓN

La tecnología de secuenciación de la próxima generación (NGS) ha sido rápidamente

adaptada a pruebas clínicas y está cambiando radicalmente el paradigma de los
diagnósticos clínicos. En algunos casos, la tecnología ayuda a poner fin a la larga
búsqueda de una causa genética, conocida como la “odisea de diagnóstico.” Estos
cambios son evidentes a partir del rápido aumento en el número de laboratorios que
ofrecen pruebas basadas en NGS y la variedad de enfermedades para las cuales las
pruebas se ofrecen y el número de tales pruebas que se ordenan por los clínicos. En abril
de 2014, el Registro de Pruebas genéticas registró más de 450 paneles NGS clínicos
dirigidos a enfermedades que comprenden 
 múltiples genes disponibles tanto en el
sector comercial académicamente afiliado a 
 laboratorios clínicos. Actualmente, hay
aproximadamente 10 laboratorios clínicos que ofrecen
 la secuenciación del exoma (ES);
la secuenciación del genoma (GS) también está disponible
 a partir de un puñado de
laboratorios. La tecnología NGS tiene el atractivo de reducir el 
 tiempo y costo de las
pruebas, sobre todo cuando la secuenciación implica un mayor número 
 de genes, pero
es esta la mejor herramienta de diagnóstico en todos los escenarios clínicos? 
 el
objetivo del análisis de un solo gen todavía tiene un lugar? Para los paneles de genes,

incluir más genes siempre es mejor? ¿Por qué elegir la prueba del panel de genes

cuando ES puede dar información acerca de todas las regiones codificantes y es cada vez

 más ampliamente disponible? ES es la inclusión de más genes siempre mejor? ¿Por
qué
 elegir la prueba del panel de genes cuando ES puede dar información acerca de
todas las
 regiones codificantes y es cada vez más ampliamente disponibles? ES incluso
puede haberse convertido en la prueba de primer nivel para la detección de las causas
genéticas de algunos pedidos médicos. Se planteó la cuestión de qué papel juega el
médico en la realización de una evaluación clínica detallada del paciente con el fin de
elegir la mejor herramienta de diagnóstico. Por lo tanto se necesita urgentemente una
visión global comparando los diferentes enfoques de prueba y perfilando las indicaciones
para cada tipo de prueba. En esta revisión se evalúan estas opciones de pruebas
genéticas en términos de indicaciones clínicas, los retos en la interpretación, el reporte de
las variantes de secuencia y los puntos fuertes y limitaciones técnicas, también
proponemos un algoritmo de prueba que puede ayudar a organizar a los médicos para
que opten por la herramienta de diagnóstico molecular más adecuada para cada
escenario.

INDICACIONES PARA UN SOLO gen, PANEL DE GEN Y PRUEBA ES

El poder de las pruebas basadas en NGS se ha demostrado en muchos casos. Un

ejemplo extremo es un GS de 50 horas que se ofrecen en las unidades de cuidados
intensivos neonatales, estas identificaron un diagnóstico genético en dos niños, sin
embargo es importante notar que el enfoque tradicional (por ejemplo, pruebas de un solo
gen y el análisis de metilación) todavía tiene un gran valor para muchos trastornos. En un
análisis retrospectivo de 500 pacientes, casi el 50% recibió un diagnóstico genético a
través de los métodos tradicionales, con la mayoría de estos pacientes recibiendo
el diagnóstico en la primera o segunda visita a la clínica genética. Por otra parte, las
limitaciones actuales de la tecnología NGS evitan que sea una prueba independiente; no
se puede detectar con fiabilidad los cambios en el número de copias, cambios de
repetición de tripletas, y así sucesivamente. Esta situación es similar a la formación
comparativa de hibridización genómica (aCGH) en citogenética, que se ha convertido en
la prueba de primer nivel para la evaluación de las anormalidades cromosómicas
asociadas con discapacidad intelectual (ID), autismo, y múltiples anomalías congénitas
reemplazando o sustituyendo el cariotipo. Sin embargo, el cariotipo todavía se necesita
como una prueba citogenética complementaria porque aCGH no puede detectar ciertos
reordenamientos cromosómicos, tales como translocaciones equilibradas. Por tanto, es
esencial para los clínicos entender los puntos fuertes y las limitaciones de las pruebas
moleculares con el fin de elegir la más adecuada para cada paciente. Indicaciones y
ejemplos para las pruebas de un solo gen, paneles de genes, y ES se resumen en la tabla
1.
Las pruebas de un solo gen

Las pruebas de un solo gen se prefieren cuando las características clínicas y otros 

resultados de ensayo para un paciente son típicos de un trastorno particular y se ha
establecido la 
 asociación entre el trastorno y un gen específico. La sensibilidad
 clínica
de una prueba de un solo gen es alta debido a que el fenotipo y otros
 hallazgos apuntan
a un trastorno que está asociado con un gen claramente. Hay
 también una ventaja
interpretativa distinta al enfoque de un solo gen, porque la
 probabilidad de descubrir
múltiples variantes de confusión de desconocido
 significado clínico (VUS) es mínima.
No hace falta decir que la sospecha de un gen
 sobre la base de los hallazgos clínicos
requiere experiencia clínica. Por ejemplo, el FGFR3 gen es el único que se sabe está
asociado con Acondroplasia. Pruebas de un solo gen de FGFR3 detectan mutaciones en
el 99% de pacientes con Acondroplasia y por lo tanto es el método más eficiente en
términos de costos y tiempo. Sin embargo, el médico necesita tener conocimiento de los
hallazgos clínicos y radiológicos de diagnóstico de Acondroplasia con el fin de seleccionar
la prueba genética correcta.

Los paneles de genes

Para muchos trastornos, la variabilidad clínica y locus genético con heterogeneidad son lo
suficientemente significativos para un enfoque de panel de gen es apropiado para un
diagnóstico molecular eficiente y oportuno (ver
 Cuadro 1, Caso 1). La transformación de
probar un gen a la vez a un panel de genes provocada por NGS no sólo aumenta la
sensibilidad analítica de las pruebas diagnósticas de ADN, sino que también simplifica el
proceso de toma de decisiones para los médicos. Desde la introducción de NGS en la
práctica clínica, el número y variedad de trastornos para los que se ofrecen las pruebas
de panel multigen han aumentado dramáticamente. tabla 1 listado de indicaciones y
ejemplos de cuando un panel de genes es más apropiado que otras opciones de prueba.

El número de genes para indicaciones clínicas iguales o similares puede variar

significativamente entre diferentes laboratorios clínicos. Por ejemplo, hay al menos cuatro
laboratorios clínicos que ofrecen un panel de genes para la epilepsia, con un número de
genes que oscila entre 70 y 377. La diferencia obvia en el número de genes incluidos en
los paneles proviene de la evidencia de la asociación de la enfermedad y la rigurosidad de
los criterios de inclusión utilizados por los laboratorios de prueba. Aunque algunos
laboratorios pueden preferir incluir todos los posibles genes que están ni remotamente
asociados con el fenotipo de interés con la esperanza de un mejor rendimiento
diagnóstico, otros laboratorios tienen un enfoque más conservador y optan por incluir sólo
aquellos genes que tienen una fuerte evidencia de asociación con el trastorno. Los genes
asociados a un desorden o enfermedad basada únicamente en estudios de asociación o
informes individuales con frecuencia
tabla 1 Las indicaciones para un solo gen, el panel de genes, y las pruebas de ES

CDG, trastorno congénito de la glicosilación; CF, fibrosis quística; CFTR, quística transmembrana de la
fibrosis regulador de la conductancia; ES, secuenciación del exoma; FGFR3, factor de crecimiento de
fibroblastos receptor 3; GS, la secuenciación del genoma; Identificación, discapacidad intelectual; NGS, la
próxima generación de la secuencia; PAH, la fenilalanina hidroxilasa; PKU, fenilcetonuria; RASopathies, un
grupo de trastornos genéticos causados por variantes patógenas en genes que codifican

componentes de la vía Ras / mitogen-activated proteína quinasa (MAPK).
 un selección ES / GS se basa en

el precio y la capacidad de análisis de rendimiento. GS se realiza típicamente a una profundidad menor que
ES; el coste de la realización del ensayo, la realización de análisis, y el almacenamiento es más que eso para
ES.

terminan por no ser causales del fenotipo cuando se acumulan más pruebas. Sin
embargo, un médico que no es consciente de este problema puede pensar
que “más es mejor” y optar por una prueba de panel que ofrece el mayor número
de genes. Incluso para ES, la cuestión de qué genes son relevantes para el fenotipo
del paciente es fundamental. El análisis bioinformático en laboratorios que realizan
ES primero se centra en una lista de genes primarios basada en el fenotipo clínico
particular.
Se pueden tomar en cuenta varias consideraciones al decidir qué genes se incluirán
en un panel. Primero, los genes con una fuerte asociación de enfermedades
ciertamente están incluidos; la capacidad de interpretar los hallazgos de estos
genes es mucho mejor porque hay suficiente evidencia establecida.

Es posible que estos genes ya se ofrezcan en laboratorios de diagnóstico clínico

como prueba de un solo gen, pero ofrecerlos como panel puede ahorrar costos y
tiempo. En segundo lugar, los genes asociados con trastornos que tienen fenotipos
superpuestos con los de los trastornos primarios en el panel de genes pueden
incluirse con el propósito de diagnóstico diferencial. Por ejemplo, el gen SLC2A2
para el síndrome de Fanconi-Bickel puede incluirse en el panel del gen de la
enfermedad de almacenamiento de glucógeno porque cuando un paciente se
presenta con hipoglucemia en ayunas, se consideran los diagnósticos del síndrome
de Fanconi-Bickel y la enfermedad de almacenamiento de glucógeno. Por el
contrario, los criterios de exclusión también deben estar en su lugar. Por ejemplo,
los genes para los trastornos peroxisomales no necesitan ser incluidos en un panel
de genes de trastornos de almacenamiento lisosomal porque otras herramientas de
diagnóstico (perfiles bioquímico) pueden ayudar a diferenciar estos dos grupos de
trastornos.
En una nota similar, uno debe decidir si incluir genes para ciertos fenotipos
asociados con formas sindrómicas y no sindrómicas. Por ejemplo, cuando un
paciente se presenta con baja estatura, puede ser aislado o sindrómico.Existen
manifestaciones clínicas o metabólicas definidas para algunas condiciones de
estatura corta sindrómicas que las distinguen claramente de la estatura corta
aislada. Sin embargo, la existencia de fenotipos más leves o atípicos y la
penetración incompleta de algunas mutaciones pueden conducir a la inclusión de
genes sindrómicos en un panel.

Claramente, la selección de genes adecuada para los paneles requiere una

asociación entre los médicos y los genetistas de laboratorio porque el panel de
genes tiene que tener sentido para el médico que ordena desde un punto de vista
clínico.
El descubrimiento de genes avanza a un ritmo muy rápido como resultado de la
tecnología NGS. Una cantidad abrumadora de información de secuenciación ha
sido y está siendo generada actualmente por la investigación. Sin embargo, es
esencial tener en cuenta que la validación de estos genes recientemente
descubiertos asociados con un determinado fenotipo requiere análisis funcionales y
/ o genéticos, especialmente cuando la identificación se basa en unas pocas familias
o casos simplex. Incluir estos genes inmediatamente en un panel o en un análisis
de ES puede ser engañoso.

La falta de conocimiento sobre estos genes y las variantes asociadas dará como
resultado una gran cantidad de VUS (variantes de significado indeterminado), lo que
limita la utilidad clínica de la prueba. En un estudio que involucra genes asociados
con la ID ligada a X, 10 de los 100 genes inicialmente incluidos en el panel de ID
ligado a X basado en NGS parecen ser de patogenicidad dudosa tras el reanálisis,
porque las variantes truncadas y las mutaciones previamente publicadas en estos
genes de hecho tienen una frecuencia relativamente alta en la base de datos de
Exome Variant Server (http://evs.gs.washington.edu/EVS), que proporciona
información de variación de la población general.

La secuenciación del exoma

Sin lugar a dudas, ES es ahora la herramienta más utilizada para el descubrimiento
de gen de la enfermedad mendeliana. Es probable que las mejoras en la
bioinformática y la tecnología de secuenciación aumenten aún más la tasa de éxito
para el descubrimiento de genes cuando se considera para el diagnóstico clínico,
se informa que ES tiene un rendimiento diagnóstico de ~ 25-28%. De hecho, se
observó una tasa mucho más alta de ~ 50% en un estudio piloto diferente en el que
se aplicaron criterios predeterminados más estrictos para seleccionar pacientes
adecuados para ES. Desde una perspectiva económica, un estudio reciente ha
demostrado que, en comparación con múltiples pruebas de un solo gen o de bajo
rendimiento, la ES tiene el potencial de proporcionar un beneficio de costo
significativo para los pacientes que permanecen sin diagnosticar después de
algunos enfoques tradicionales.
ES ha demostrado un éxito con mayor frecuencia en los casos en los que no se
basa en un conocimiento a priori de la condición genética. Este enfoque "hipotético"
no se centra en un conjunto de genes, por lo que es una mejor herramienta de
diagnóstico para ciertos escenarios clínicos (Tabla 1).
En el informe de Yang et al, la tasa más alta de un diagnóstico positivo fue en el
grupo de pacientes con un trastorno neurológico inespecífico, lo que indica que la
ES es el último recurso para el diagnóstico cuando ningún síntoma específico
apunta a un diagnóstico específico. Independientemente de lo que motive a un
médico a remitirse a ES, es fundamental que toda la información clínica y los
hallazgos de otras evaluaciones estén disponibles para el genetista molecular
clínico para ayudar a interpretar la gran cantidad de variantes de secuencia
generadas a través de ES. Aunque ES puede pasar por alto el enfoque dirigido por
hipótesis de la secuenciación de un conjunto de genes candidatos, la interpretación
de las variantes depende en gran medida de tener un fenotipo bien caracterizado.
El componente más crucial de cualquier algoritmo de prueba es la evaluación
clínica.
ES no es un sustituto para tomar una historia completa y un fenotipo preciso. Es
posible que se requieran algunas evaluaciones adicionales después de ES para
realizar un diagnóstico final. Como lo señalaron Hennekam y Biesecker, "las
habilidades de diagnóstico de los médicos especialistas cambiarán de un modo de
diagnóstico pre-NGS-test diferencial a un modo de evaluación de diagnóstico post-
NGS-test”. Esto significa que una prueba de NGS se puede usar como una
herramienta de detección y ofrece un puñado de posibilidades, lo que permite a los
médicos realizar evaluaciones adicionales enfocadas y eficientes del paciente. Un
esfuerzo colaborativo entre médicos y laboratorios de diagnóstico será más
importante a medida que la ES se generalice en las pruebas genéticas. Aunque los
kits exome off-the-shelf están disponibles, comercialmente fueron diseñados para
cubrir todo el exoma, no ofrecen una cobertura completa de todos los exones de los
genes, incluyendo el subconjunto de los genes asociados a enfermedades
conocidas. Para que ES cambie de ser una prueba de detección a una prueba de
primer nivel independiente, primero debe ofrecer una cobertura completa de todos
los exones de al menos los genes asociados a la enfermedad conocidos.
Una verdadera prueba médica completa de ES deberá proporcionar cobertura
completa de todos los exones de todos los genes conocidos relevantes para la
enfermedad (~ 4,600 genes), mientras mantiene la cobertura de los 18,000 genes
restantes, y tener la capacidad de detectar variantes en todo el espectro de
mutaciones de cada uno de estos genes para hacer de ES la prueba de primer nivel
en genética molecular. Este enfoque centrado en el gen de la enfermedad está
destinado a reducir el costo y acortar tanto el tiempo de secuenciación como el de
informe, al tiempo que aumenta simultáneamente el rendimiento analítico.
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bajar el coste y acortar tanto la secuencia y tiempo de informes, mientras que al mismo
tiempo aumentar el rendimiento analítico. Por otra parte, ya que los resultados negativos
de la prueba, de una prueba tan completa son más definitivos, los ensayos médicos ES
también sirven como una herramienta valiosa de descubrimiento de genes; es decir, los
laboratorios de investigación pueden buscar mutaciones en los genes restantes que no
están asociados actualmente con enfermedades (ver algoritmo de prueba, Figura 1 , para
más detalles). Es importante señalar que con los nuevos descubrimientos y las
asociaciones enfermedad-genes que rápidamente vienen a la luz, la lista de objetivos de
los genes relevantes de la enfermedad crecerá, y el ensayo deberá ser actualizado
periódicamente. Un mayor esfuerzo para diseñar un ensayo exoma médica ha sido lanzado
recientemente como una colaboración entre varios laboratorios de diagnóstico clínico
(MRH, datos no publicados y AB Santani et al., Comunicación personal).

PANEL DE GENES VERSUS ES

Se puede cuestionar la necesidad de las pruebas del panel de genes en la era de NGS.
¿Por qué los médicos no simplemente seleccionan ES, dado que cubre las regiones de
codificación? Ha habido informes sobre las limitaciones y retos en la aplicación clínica de
ES, incluyendo algunos que mostraron la posibilidad de las variantes y diagnósticos
faltantes en este enfoque. Desde una perspectiva técnica y de presentación, existen
diferencias significativas entre estas dos pruebas basadas en NGS ( Tabla 2 ).

Paneles de genes dirigidos basados en NGS combinados con métodos

complementarios proporcionan un enfoque integral y viable para el diagnóstico
genético

Actualmente, ES usando kits disponibles comercialmente, selecciona ~ 92% de la exoma,

y después de la secuenciación esa cobertura disminuye a ~ 80-85%, lo que resulta en la
deserción de varios exones críticos en genes asociados a enfermedades.
Paneles de genes dirigidos normalmente cubren todos los exones de los genes incluidos
en los paneles y pueden ser complementados con otras pruebas, tales como análisis de
deleción / duplicación.

Por lo tanto, aunque ES pueden ser considerados como una prueba más de cribado, el
panel dirigido de multigenes es una prueba de diagnóstico o descarte de la enfermedad ,
con la advertencia de que las mutaciones patógenas raras pueden ocurrir fuera de los
exones.

En la búsqueda de un diagnóstico, siendo capaces de descartar los genes y las

enfermedades, puede ser útil (véase Cuadro 1, Caso 2). Una prueba del panel de genes
basados en NGS, sin embargo, no es una prueba de diagnóstico independiente desde una
perspectiva técnica. Pruebas de panel clínicamente ofrecidos a veces se complementan
con la secuenciación de Sanger para el relleno de baja cobertura y sin cobertura de exones
y para confirmar variantes detectadas por NGS, pero más a menudo se complementan con
aCGH para detectar simultáneamente los cambios en el número de copias de nivel en el
exón en determinados genes.

A pesar de que las contribuciones de este tipo de cambios pueden ser bajos para la mayoría
de las enfermedades monogénicas, ayudan a descartar el gen (s) y pueden proporcionar
un diagnóstico. Como complemento de las pruebas de NGS con la secuenciación de
Sanger es inevitable, al menos con las tecnologías actuales de captura y la secuencia-
objetivo, que consistentemente fallan en la amplificación de ciertas regiones debido a varios
factores que incluyen homología de secuencia con pseudogenes, contenido alto rico en GC,
regiones altamente repetitivas, y otras complejidades de secuencia.

La Secuenciación de Sanger también se puede utilizar para “Rellenar” los datos faltantes
de bases o regiones que son compatibles con un número insuficiente de lecturas para llamar
a las variantes con confianza. Una lista proactiva de estas regiones se genera con los
paneles de gen NGS para asegurar una cobertura completa de las regiones de interés.
Tenga en cuenta que tales rellenos son sólo factibles para las pruebas del panel debido a
que la proporción de regiones problemáticas aumenta significativamente a medida que más
bases se secuencian por ES.

A diferencia de las pruebas de panel de gen, ES se ve comprometida por la cobertura, dada

la gran cantidad de la región diana (62 Megabyte; 1-2% del genoma). Aunque la expansión
de un panel blanco al incluir más genes relacionados con la enfermedad, se ha encontrado
que mejora el rendimiento diagnóstico de paneles NGS para ciertas enfermedades, ES ha
disminuido significativamente la sensibilidad clínica y una tasa de falso negativo superior.

Se estima que un promedio de 10% de todo el exoma carece de cobertura aceptable de

20X. Una comparación a nivel de nucleótidos de la cobertura de lectura para varias
variantes patogénicas conocidas en los genes de trastorno neuromuscular indica que hasta
un 11- 18% de las mutaciones carecería de la recomendada cobertura 20X por ES, por lo
tanto resultando en falsos negativos (A. Ankala et al., datos no publicados).

Además, un análisis de homología de todo el exoma para ver la presencia de pseudogenes

o pseudo exones indica que hasta 3.000 genes tienen al menos un exón que tiene un
pseudoexón con homología de secuencia que varía de 97 a 100%. Analizar tales regiones
pueden dar falsos positivos. Por el contrario, el relleno complementario Sanger de estas
regiones genómicas refractarias a NGS confiere alta sensibilidad clínica y especificidad en
la prueba panel. Los estudios sugieren que los genes interrogados a través de pruebas del
panel tienen aproximadamente de cuatro a cinco veces mayor cobertura que ES.

Debido a las limitaciones de la tecnología, la tasa de falsos positivos para NGS,

especialmente para las inserciones y deleciones, es aún muy alta, requiriendo un segundo
método para confirmar los hallazgos de NGS. La Secuenciación de Sanger todavía se
considera el estándar de oro para la secuenciación. Las tasas de falsos positivos en las
pruebas de NGS se reportan en un rango de 14 a 27%. Estas secuencias de llamada por
lo general tienen fracciones desiguales de alelos, pobres puntuaciones de mapeo, o data
secuencial subóptima que indica la alineación a la secuencia de referencia. Por lo tanto, un
segundo método es necesario para quitar los llamadas falsos positivos, y todas las variantes
de notificación obligatoria con posible importancia clínica deben ser verificadas antes de
informarlas. El proceso de confirmación puede ser muy gravoso cuando necesita ser
confirmado, como en el caso de ES.. Como se informó por muchos estudios, la confirmación
Sanger es responsable de la mayor parte del tiempo de respuesta, lo cual es poco práctico
y no es rentable para los laboratorios clínicos.

Retos Significativos en la interpretación de la variante y su reporte

El mayor obstáculo para la aplicación clínica rutinaria de pruebas de NGS es la
interpretación del gran número de variantes de secuenciación. Dependiendo del tipo de
enriquecimiento del conjunto del exoma que es utilizado, el número de variantes
típicamente varía entre 20.000 y 50.000 por exoma.

Incluso después de la aplicación de diversos parámetros de análisis y los filtros de la

bioinformática, por lo menos 150 a 500 variantes no sinónimas o variantes de sitio de
empalme son preseleccionados como posibles variantes patógenas en cada caso ES. La
interpretación y la presentación de estas variantes en el contexto del fenotipo del paciente
es una tarea enorme para los laboratorios de diagnóstico clínico. Nuestra actual capacidad
eficiente para analizar e interpretar la información colectiva no está a la par con nuestras
capacidades de secuenciación.

Tanto las bases de datos variantes públicas y comerciales disponibles son importantes a la
hora de evaluar la patogenicidad de las variantes. Sin embargo, la información procedente
de estas fuentes y la literatura publicada puede contener ambigua e insuficiente información
que,si no se evalúa cuidadosamente, pueden conducir a una cuota excesiva de
patogenicidad, provocando así un diagnóstico incorrecto. De hecho,un estudio con una
cohorte de 1.000 personas encontró que 221 variantes únicas observadas en 566 instancias
independientes, todos los cuales han sido clasificados como causantes de enfermedades
humanas en la mutación en el gen de la base de datos, eran en realidad benignas o VUS
informó sobre la base de evidencia. Un estudio realizado por Xue et encontró que los
individuos sanos llevan 40-110 variantes clasificadas como causantes de la enfermedad en
la Base De Datos Del Genoma Humano. Reciente secuenciación a gran escala y proyectos
de genotipado han revelado un número sorprendentemente grande de lossof-función
variantes que tradicionalmente han sido vistos en el contexto de una severa enfermedad
mendeliana en los genomas de individuos aparentemente sanos. La recién estrenada
variante criterios de clasificación (2014) por el Colegio Americano de Medicina Genética y
Genómica (ACMG) lista estudios funcionales como uno de los componentes más
importantes en el caso de la variante de la clasificación. Sin embargo, estudios funcionales
deben ser evaluados cuidadosamente, especialmente cuando se utiliza una sola enzima
bacteriana o viral para el estudio de la diversidad funcional del proteoma humano. Por lo
tanto, es importante reconocer que las predicciones experimentales, como con las
predicciones computacionales, son informativos , pero con frecuencia no es definitivo.
Todos estos puntos, poner de relieve la complejidad de la variante de la interpretación y de
la necesidad de mejorar la anotación de alelos de la enfermedad tanto en bases de datos y
de mutación en la literatura primaria.
Un punto importante a considerar es el enorme aumento en VUS revelada en NGS pruebas
basadas en la novela, especialmente en el caso de variantes raras y missense. Es
razonable decir que genera es considerablemente más VUS que un grupo de genes. Incluso
con la ayuda de la variante de bases de datos y la literatura, la inmensa mayoría de
variantes de secuencia son clasificados como VUS. La clasificación de VUS se examinó si
la variante nunca ha sido reportado en ninguna de las bases de datos y no es la especie
con clara patogenicidad (frameshift, stop codon, empalme o sitio de mutaciones). Análisis
adicionales, tales como estudios para ayudar a los padres con la clasificación, está
garantizado para VUS. Sin embargo, la frontera entre lo verdadero y raras mutaciones
causantes de enfermedades no-variantes a menudo siguen siendo esquivos. Incluso si una
variante patogénica aparentemente se encuentra en un individuo afectado con un raro
trastorno mendeliana, no podrá ser causa de la enfermedad porque puede ser simplemente
una variante rara exclusivas de esa misma familia. Con más personas de diferentes grupos
étnicos secuenciado a través de NGS, más variantes raras inevitablemente será revelado.
En la mayoría de laboratorios clínicos, VUS se incluyen en un informe del paciente, incluso
aunque la notificación VUS tiene escasa utilidad clínica debido a la relevancia clínica de
VUS no es sencillo. La mayoría de los médicos no tomará ninguna acción basada
exclusivamente en una variante que es clasificado como un VUS. Sin embargo, si el fenotipo
asociado con mutaciones en el gen es similar a los del paciente y, a continuación, pruebas
de diagnóstico adicionales (como enzimáticos o metabolito) puede ser útil, cuando esté
disponible. Aunque de utilidad limitada en el tiempo, la reclasificación de un VUS para
patógenos puede ocurrir en el futuro a medida que se disponga de más información. En
ocasiones, estas variantes son utilizados como candidato mutaciones para fines de
investigación. Además, el ensayo y la presentación de informes VUS en una configuración
de diagnóstico prenatal para fines predictivos generalmente no es recomendable porque
puede provocar abortos ilícitos.

Otro desafío al realizar la secuenciación en gran escala como es o GS es el potencial para

la detección de hallazgos incidentales (IFs). IFs se definen como conclusiones ajenas a la
indicación para la obtención de la prueba de secuenciación, pero que tienen valor medicinal
para el cuidado del paciente. La tasa de notificación obligatoria IFs puede oscilar de 1 a
8.8%, dependiendo de la calidad de la secuencia, la variante de selección, sujeto cohorte,
y si el laboratorio es utilizando el gen lista recomendada por el Grupo de Trabajo
ACMG.21,22 inafectado familiares a menudo son incluidos para ES o GS análisis para
detectar cambios de novo en el proband; por lo tanto, IFs también tienen implicaciones para
estos miembros de la familia afectados. Determinar si, y cómo IFs son devueltos al paciente
es cada vez más importante y controvertido. Por ejemplo, ha habido debate sobre si debe
informar sobre las mutaciones asociadas con condiciones de aparición tardía (p. ej., cáncer
de mama) probado en un niño. Desde el punto de vista médico, no es una tarea sencilla
para aconsejar a los pacientes y sus familias antes o después de la prueba con respecto a
si las conclusiones. Actualmente, todavía existe una falta de consenso sobre lo que debe
ser devuelto al consentimiento de los pacientes (o si el consentimiento es incluso necesario)
y cómo deben ser gestionados. Hay estudios en curso para ayudar a abordar estas
cuestiones. El Consorcio de Investigación exploratoria de Secuenciación clínica establece
los criterios preliminares para la identificación de genes procesable.21,23,24 La pregunta
clave es: ¿qué clase de IFs se beneficiaría el proband y los parientes del proband sin añadir
una carga innecesaria a la familia? Las cuestiones relativas a la bioética, económicos y los
resultados sanitarios y psicosociales patientreported definitivamente debe ser
considerado.También es de esperarse que es identificar todo tipo de otras variantes, tales
como el estado de portador de trastornos autosómicos recesivos farmacogenética y
variantes. Se recomienda que los laboratorios tienen políticas específicas sobre estas
cuestiones en su lugar cuando es la realización de ensayos clínicos. Un proceso de
consentimiento informado en el pretest se recomienda la asesoría genética para alertar al
paciente de la posibilidad de dichos resultados, así como de criterios de lo que se informa.
Una estrategia de información mediante informes centrados para variantes relacionadas
con el fenotipo, médicamente mutaciones procesable, estado de portador y variantes
farmacogenética y ampliado los informes para variantes deletéreos o VUS no guardan
relación con el fenotipo de la enfermedad ha sido implementado.8 Inmediatamente después
de la reunión anual de 2014, la ACMG ACMG Junta de Directores recomendaron que los
pacientes tienen la oportunidad de optar por no recibir los fondos de inversión como parte
del proceso de consentimiento informado. Para complicar aún más este paisaje, como se
mencionó anteriormente, las pruebas ES o GS no se pueden optimizar para la cobertura de
variantes asociadas con estas IFs. Además, todas las variantes notificables de las pruebas
basadas en NGS tienen que ser validado a través de otro método. Los números de ambos
VUS y los fondos de inversión que se encuentran en ES aumentan dramáticamente la carga
de trabajo en los laboratorios clínicos, lo que lleva a problemas en el tiempo de entrega y
costo. Prueba de los paneles de genes específicos de la enfermedad puede obviar o reducir
significativamente los problemas de FI; los pacientes no recibirán ningún FI con un panel
dirigido porque sólo se analizan los genes relacionados con el fenotipo.

PRUEBAS DE ALGORITMO

Aquí, se propone un algoritmo de prueba molecular para elegir entre un análisis específico,
el análisis del panel de genes, y ES ( Figura 1 ).
Este algoritmo es una modificación de la propuesta en el estudio realizado por Shashi et al.
Este algoritmo de prueba puede ayudar a aumentar la sensibilidad clínica de la prueba
molecular y reducir el coste de prueba global y el tiempo para un diagnóstico para los
pacientes.

En nuestra opinión, las pruebas de panel de genes a través de NGS son un componente
crítico de la estrategia de la prueba por razones mencionadas anteriormente. Como se ha
comentado, una evaluación clínica minuciosa es el paso clave para la elección de qué
prueba genética es la mejor para el paciente. A través de análisis específicos (prueba de
un solo gen, el análisis de repetición de triplete, y el análisis de metilación),
aproximadamente la mitad de todos los pacientes en clínicas genéticas reciben un
diagnóstico en su primera o segunda visita. Si se trata de heterogeneidad genética, un panel
de genes es mucho más útil en casos como los que involucran trastornos neuromusculares,
displasias esqueléticas, ciliopatías, o pérdida de la audición. Los fenotipos de estos
trastornos son distintivos, especialmente a una edad temprana. A menudo, los resultados
de ensayos radiográficos y/o bioquímicos ayudarán a reducir el número de genes
candidatos y facilitaran la interpretación de variantes. Además, un número finito de genes
se sabe que causan estos trastornos de acuerdo con el conocimiento disponible en el
momento. Las variantes generadas a través de estos paneles relacionados con la
enfermedad son interpretables.

Para los casos como el autismo e ID, sin embargo, una micromatriz cromosómica más una
prueba de X frágil seguida por ES pueden ser la ruta de diagnóstico molecular más
apropiado. Estos trastornos tienen una amplia heterogeneidad genética, y las estimaciones
son que las mutaciones en más de 1.000 genes diferentes pueden causar ID.

Es importante destacar que las mutaciones de novo representan una causa importante de
ID. A través de GS, el grupo Gilissen alcanzó un estimado acumulativo (incluyendo ES) del
62% del diagnóstico genético concluyente, de los cuales el 60% se debió a eventos de
novo. Ocho casos en el estudio de Gilissen et al. Son variantes estructurales de novo
identificadas a través de GS que no puede ser recogidas por microarrays. Por lo tanto,
ES/GS con pruebas de tríos (incluyendo los padres) debe ser el enfoque preferido para la
ID después de pruebas de primer nivel, tales como microarrays y pruebas de X frágiles,
regresa con resultados negativos. Además, los pacientes con resultados ES negativos en
realidad proporcionan un gran recurso para la investigación, tales como el descubrimiento
de genes si se sospechan trastornos mendelianos y se puede obtener el consentimiento.
RESUMEN

Una variedad de pruebas de diagnóstico molecular están ahora disponibles porque la

tecnología NGS ha entrado en el campo del diagnóstico clínico, incluyendo pruebas de un
solo gen, ensayos de panel de genes, ES, y GS. Como resultado, los médicos encargados
se enfrentan al enigma de elegir la mejor herramienta de diagnóstico para los pacientes con
sospecha de afecciones genéticas. Las pruebas de un solo gen tienen un valor para
situaciones en las que hay características clínicas distintivas y una heterogeneidad mínima
del locus. La prueba de panel gen es más costo-efectiva que un enfoque de un solo gen
para trastornos en los que el diagnóstico clínico es difícil de realizar o hay múltiples genes
implicados. ES y GS tienen la ventaja de ser menos sesgados con respecto a qué conjunto
de genes probar, a diferencia de la secuenciación dirigida, que presupone que las
anomalías de relevancia clínica se limitan al panel de genes. Sin embargo, las limitaciones
técnicas de NGS y las dificultades de interpretación y presentación de informes
relacionadas con ES y GS hacen que estos enfoques sean difíciles y muy complejos. Las
IF no relacionadas con la condición de un paciente en las pruebas ES y GS complican aún
más el panorama. Además, actualmente se requiere la secuenciación de aCGH y Sanger
para complementar las deficiencias de NGS para detectar todo el espectro de mutaciones
y validar los hallazgos de NGS. Por lo tanto, es crucial que los médicos comprendan las
diferencias y dificultades en cuanto a las tecnologías, la interpretación de las pruebas, la
importancia clínica y los problemas éticos, ya que son responsables en última instancia de
ordenar y comunicar los resultados de las pruebas a los pacientes. Nuestro algoritmo de
prueba puede dar a los médicos ideas que ayudarán a resolver el enigma de las pruebas
moleculares.

VISTA FUTURO

A medida que la tecnología continúa mejorando, las pruebas basadas en NGS pueden
convertirse en independientes, sin la necesidad de confirmación a través de un segundo
método. El cien por ciento de concordancia de la detección de variante entre Sanger y NGS
se ha logrado en estudios recientes cuando se aplicaron ciertos criterios. La tecnología de
secuenciación de “Tercera generación” con lecturas más largas tiene el potencial de
detectar trastornos de expansión repetida de trinucleótidos y ofrecerá una solución más
completa para el diagnóstico molecular. GS, que evita cualquier sesgo de captura y tiene
incluso más cobertura, es probable que sustituya cualquier forma de secuencia con la
captura. Los cambios de número de copias y las variantes que se encuentran en regiones
que no codifican pueden ser detectados por GS. Esto ya se ha utilizado con gran éxito en
entornos específicos para aclarar el diagnóstico molecular e incluso para guiar la terapia.
Es probable que en un futuro próximo, un único flujo de trabajo de laboratorio aerodinámico
simplificado de GS sustituirá a la mayoría de las otras pruebas de secuenciación porque los
precios de secuenciación siguen bajando como se predijo. La única diferencia para cada
paciente sería el conjunto de genes analizados apropiados para la indicación clínica
específica. La secuenciación del genoma puede ser una prueba genética de una sola vez
que proporcionaría la base para un seguimiento de por vida. El reanálisis periódico y la
interpretación de los datos de GS basados en la condición del paciente y el conocimiento
actualizado seguramente serán la progresión inevitable. La era de la medicina genómica ha
comenzado y ofrece tremendas oportunidades y desafíos a las normas de larga data de la
práctica médica. Sin embargo, deben abordarse cuestiones como la falta de conocimiento
sobre la interpretación de variantes, el desacuerdo sobre la liberación de lF, alta demanda
de almacenamiento de datos, la insuficiencia de procedimientos de consentimiento
informado para las pruebas genéticas y una mano de obra limitada de genetistas clínicos y
de laboratorio y asesores genéticos. Antes de darnos cuenta de todo el potencial de esta
tecnología emocionante.

REVELACIÓN
YX, AA y MRH trabajar para un laboratorio de diagnóstico sin fines de lucro.
WRW declara ningún conflicto de intereses.