Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

PRÁCTICA N° 14

INTRODUCCIÓN A LA MICOLOGÍA.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS

INTRODUCCIÓN

Los hongos constituyen un grupo muy numeroso de organismos (se han

descrito aproximadamente 500.000, pero se estima que pueden existir entre 1 y 1,5
millones de especies) que presentan una amplia distribución en la naturaleza,
contribuyendo a la descomposición de la materia orgánica y participando en los ciclos
biológicos. Un pequeño número son patógenos de animales y plantas.

Son organismos eucariotas típicos, presentan básicamente dos tipos de morfologías:

una multicelular denominada filamentosa y otra unicelular denominada levaduriforme,
la mayoría de ellos presentan reproducción sexual y asexual. Obtienen los nutrientes
por absorción y tienen un metabolismo quimioheterótrofo, ya que obtienen la energía y
el carbono de compuestos orgánicos sintetizados por otros organismos. Este hecho
condiciona su modo de vida, ya que en la naturaleza se encuentran asociados a la
materia orgánica en descomposición, participando en los ciclos naturales de reciclado
del carbono y otros elementos naturales o como patógenos oportunistas del hombre,
los animales y plantas.

En el laboratorio, los hongos crecen fácilmente en la mayoría de los medios de cultivo;

los hongos filamentosos (miceliares o mohos), representan el crecimiento más típico
de los hongos microscópicos. En medios de cultivo sólido y también sobre cualquier
superficie en la que se desarrollen, por ejemplo, frutas u otros alimentos, producen
colonias algodonosas o pulverulentas que son muy características. En tanto que los
hongos levaduriformes generalmente dan lugar a colonias lisas similares a las de las
bacterianas en medios de cultivo sólidos.

Muchas especies de hongos son utilizadas dentro del campo industrial, alimentario por
su gran maquinaria enzimática, sin embargo, un pequeño grupo, afectan al hombre
causando patologías que se agrupan en tres campos de estudio: las intoxicaciones
(micotoxicosis y los micetismos), en donde los síntomas varían de leves a graves, y en
ocasiones son mortales. Las alergias; causadas por inhalación o contacto de esporas
de hongos de vida libre y por último la micosis, infecciones causadas por hongos que
afectan a cualquier tejido pudiendo ser micosis superficiales o micosis profundas
(sistémicas).

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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COMPETENCIAS

 Aprenderá técnicas básicas para el cultivo y aislamiento de hongos

ambientales y de importancia clínica.

 Aplicará los métodos estandarizados para identificación y diferenciación de

especies de hongos filamentosos y levaduriformes.

MATERIALES:

Material Biológico

 Láminas preparadas con muestras de Hongos Filamentosos y levaduriformes.

 Cultivos de Hongos Dermatofitos y Especies de Candida sp.
 Muestras de frutas u otros alimentos afectados por hongos.
 Plasma de conejo o humano.

Material de Laboratorio

 Asas Micológica
 Mechero de alcohol o Bunsen
 Placas de Petri
 Incubadora a 30 °C
 Láminas y laminillas.
 Hojas de Bisturí N° 24.
 Pinzas metálicas.
 Balanza analítica.
 Microscopio eléctrico.

Medios de cultivos

 Agar Sabouraud Glucosado con Antibiótico.

 Agar Papa Dextrosa (PDA) con antibiótico.
 Agar Arroz.
 Agar Cromogénico (CHROM AGAR)

Reactivos

 Colorante de Azul de lactofenol.

 Colorante de Azul de algodón.
 Solución de KOH al 10%.
 Solución de NaOH al 40%

PROCEDIMIENTOS.

A. ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA CELULAR DE LOS HONGOS

1. Observación de láminas montadas

 Realizar la observación microscópica de láminas previamente

preparadas y fijadas. Utilizar los objetivos secos de 10X y 40X.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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 Observar y diferenciar los tipos, así como las diversas estructuras

celulares de los hongos.

Microconidias (Trichophyton rubrum) Macroconidias (Microsporum canis)

Conidioforo (Aspergillus fumigatus) Conidioforo (Penicillium spp)

Esporangios (Rhizopus spp) Levaduras

(Saccharomyces cerevisiae)

2. Preparación de montajes en fresco

 Con la ayuda de la hoja de bisturí, realizar cuidadosamente un paspado

de las superficies de las frutas y alimentos contaminados por hongos.

 Colocar la muestra sobre una lámina porta objetos, limpia y

desengrasada.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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 Agregar sobre la misma una gota de colorante azul de lactofenol o azul

de algodón y cubrir con una laminilla.

 Llevar a observación microscópica a con aumentos de 10X y 40X.

 Describir lo observado.

Para el caso de hongos patógenos de importancia clínica

 Tomar muestras de cabello, raspado de piel o uñas afectadas por

hongos.
 Colocar la muestra sobre una lámina porta objetos limpia y agregar una
gota de KOH al 10%.

 Cubrir la muestra con una laminilla y dejar en reposo por un espacio de

5 – 10 minutos.

 Llevar a observación al microscopio con objetivos de 10X y 40X.

 Esquematizar y Describir lo observado.

B. CULTIVO Y AISLAMIENTO DE HONGOS.

1. Cultivo de Hongos ambientales

 Destapar y exponer una palca de Petri con Agar Sabouraud o PDA al

medio ambiente por un lapso de 15 min.

 Transcurrido el tiempo, tapar la placa y llevar a incubación a 30 °C por

24 horas.

 Posteriormente continuar la incubación a Temperatura ambiente por un

periodo de 7 a 14 días.

 Observar y describir las características de las colonias de hongos

desarrolladas en la superficie del agar.

2. Cultivo de Hongos patógenos de importancia clínica

 Para el caso de muestras de cabello: Tomar algunos cabellos con una

pinza estéril.

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 Para el caso de Lesiones de piel: realizar un raspado de la zona

previamente desinfectada y obtener escamas de piel.

 Para el caso de Onicomicosis: Realizar un raspado de la base de las

uñas afectadas. Depositar las muestras en cuatro puntos equidistantes
en la superficie del agar sabouraud o PDA con antibiótico.

 Para el caso de secreciones vaginales: Obtener una muestra de

secreción vaginal con un hisopo estéril. Sembrar en un extremo del
medio y luego con la ayuda del asa de Kolle agotar con estrías en la
superficie del medio.

 Para el caso de Muestras de esputo: Tomando en cuenta las medidas

de Bioseguridad, obtener una muestra de esputo del paciente y luego
agregar NaOH al 40% (para fluidificar las flemas) y dejar en reposo por
15 min.

 Posteriormente centrifugar la muestra de esputo en un tubo cónico

estéril a 150 RPM por 5 minutos.

 Obtener el sedimento con la ayuda del asa de Kolle y sembrar en

superficie en agar sabouraud por técnica de agotamiento y estría.

 Llevar a incubación a 30 °C por 24 horas. Posteriormente continuar la

incubación a Temperatura ambiente por un periodo de 7 a 14 días.

 Observar y describir las características de las colonias de hongos

desarrolladas en la superficie del agar.

C. DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES Candida spp.

1. Prueba del tubo germinativo

 Con la ayuda del asa de Kolle o aguja bacteriológica, sembrar en un

tubo con 2 ml plasma de conejo o plasma humano una porción de la
colonia de Candida spp.

 Llevar a incubación a 37°C por 2 horas.

 Colocar una gota del cultivo en una lámina portaobjetos y cubrir con una
laminilla.

 Llevar a observación con objetivo de 40X.

Positivo: Candida albicans Negativo: Candida no albicans

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2. Producción de Clamidosporas

 Con la ayuda del asa de Kolle, realizar un trasplante de la colonia de la

levadura a una placa con agar arroz.

 Llevar a incubación a 37° por 24 horas.

 Tomar una porción del cultivo obtenido y realizar una suspensión en

solución salina sobre una lámina portaobjetos.

 Cubrir con una laminilla y llevar a observación con objetivo de 40X.

3. Diferenciación en Medio cromogénico

 Con la ayuda del asa de Kolle, realizar un trasplante de la colonia de la

levadura a una placa con agar cromogénico.

 Llevar a incubación a 37° por 24 horas.

 Observar el crecimiento y realizar la diferenciación de acuerdo al color

de las colonias.

Candida cruzei Candida tropicalis

Candida albicans

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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CUSETIONARIO

1. Esquematice lo realizado en práctica e interprete los resultados obtenidos.

2. Establezca las diferencias que existen entre los Mohos y las levaduras.
3. ¿Qué importancia tiene los hongos en campo Biotecnológico y cuáles son los
más utilizados?
4. Qué importancia clínica tienen las especies de Candida albicans y
Cryptococcus neoformans.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal