Biotecnologia

Profª Natália Faria Romão

Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Esp. Microbiologia de alimentos e Avançada
Doutoranda: Biotecnologia - BIONORTE
 Mutagênese

A mutação é sempre encarada como algo

negativo.
Os pesquisadores fazem de tudo para evita-
la, como se fosse possível eliminá-la
totalmente.
A mutação faz parte da vida:
Sem ela a vida seria inimaginável.
Sem mutação: não há variabilidade genética
Sem variedade não há seleção
Sem seleção não há evolução
Sem evolução não há adaptação.

Da Silva et al, 2003.

 Mutagênese

Mas...
Mutação demais pode prejudicar o indivíduo
ou até mesmo extinguir a espécie.

A mutação é
 aleatória
 cega
de ordem molecular e química
um processo desagregador

Da Silva et al, 2003.

 Mutagênese

Mutação:
Alterações no código de bases nitrogenadas nos
genes do DNA.
Podem originar novos genes que podem originar
características favoráveis ou desfavoráveis ao
indivíduo.
 Mutagênese

Mutação:
– Inserções:
5’ GGG AGT GTT AGA TGG TCC 3’
Gene selvagem:
3’ CCC TCA CAA TCT ACC AGG 5’

5’ GGG AGT GTTT AGA TGG TCC 3’

3’ CCC TCA CAAA TCT ACC AGG 5’

– Deleção:
5’ GGG AGT GTT AGA TGG TCC 3’
Gene selvagem:
3’ CCC TCA CAA TCT ACC AGG 5’
T
5’ GGG AGT G T AGA TGG TCC 3’
3’ CCC TCA C A TCT ACC AGG 5’

Prejuízo: Altera o quadro de leitura.

 Mutagênese

NO DECORRER DA VIDA
Aparecimento de mutações – alterações no DNA
Erros naturais que ocorrem durante a replicação
do DNA
Ocorre em todos os seres vivos
 Mutagênese

O DNA é bastante protegido, sendo a

única molécula biológica que apresenta
um mecanismo próprio para prevenção e
reparo de falhas em seu metabolismo.
Ainda assim está sujeito a mutações.
As mutações despertam grandes
interesses por estarem diretamente
relacionadas ao desenvolvimento de
diversas doenças degenerativas:

Câncer, envelhecimento e doenças senis.

 Mutagênese

Tipo de mutações:

Espontânea Induzida

Fatores externos: como

Ocorre naturalmente possíveis agentes
durante a replicação mutagênicos – substancias;
do DNA Radiações e Radicais livres
– proveniente de
alimentos ou gerados
pelo metabolismo celular.
 Mutagênese
 Frequência baixa: uma célula em 105 a 108
 Mecanismos:
erros na replicação do DNA
lesões espontâneas: desaminação, depurinação e danos
oxidativos (radicais superóxido-O2; peróxido de hidrogênio-
H2O2; radicais hidroxila-OH)

C→U transição GC →AT

Perda de base púrica A e G
 Mutagênese

LESÕES ESPONTÂNEAS: ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA

•PERDA DE BASES:
Depurinação: 5.000 bases púricas (A e G)/dia/célula
Desaminação: 100 bases C >U/dia/célula
•REPLICAÇÃO: DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões
pb
•REVISÃO DE PROVA: corrige 99,9% dos erros de replicação
•TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação): muito baixa 10-10 por
pb/divisão
•GENOMA DIPLÓIDE HUMANO: ~ 6x109 pb do DNA →
menos 1 mutação de pb/divisão
 Mutagênese

PREVENÇÃO DE ERROS
• Alguns sistemas enzimáticos neutralizam
compostos potencialmente danosos, antes que
reajam com o DNA
• Ex.: desintoxicação de radicais superóxido
produzidos durante os danos oxidativos.
a) Enzima superóxido dismutase  catalisa a conversão dos
radicais superóxido  peróxido de hidrogênio

b) Enzima catalase  converte peróxido de hidrogênio em

água
 Mutagênese

A mutagênese (Genética Toxicológica) avalia

os efeitos genotóxicos em potencial, uma vez
que são considerados pré-requisitos
importantes para o desenvolvimento de
efeitos adversos à saúde, como o câncer.
 Mutagênese

A toxicidade genética não é uma medida da

carcinogênese, mas é frequentemente usada
como um indicador para o câncer, uma vez
que os testes de mutagenicidade medem um
evento inicial ou intermediário da
tumorigênese.
 Mutagênese

Importância de estudos de mutagênese

• Mutação: se não mata a célula ela pode se
proliferar no corpo em crescimento (mutação
somática) ou ser transmitida para as
próximas gerações (mutação germinal).

• Estima-se que as mutações somáticas e

germinais são responsáveis por:
– 50% das mortes fetais,
– 30% dos problemas de aprendizagem,
– 20% dos defeitos congênitos, e
– 2% da infertilidade masculina
 Mutagenicidade: Produtos Naturais

• “Se bem não fizer, mal não faz?”

• Virtualmente, todas as substâncias químicas
podem causar efeitos adversos à saúde,
dependendo da quantidade absorvida e
metabolismo.
• Portaria do Ministério da Saúde/2000: todos
os fitoterápicos devem ser estudados quanto
ao seu potencial mutagênico.
• Resultados positivos:
Aloe vera (babosa)
Schinus terebintifolius (aroeira)
Ocotea dukei (louro-de-cheiro)
 Mutagenicidade: Produtos Naturais

Aloe vera (babosa)

Na dose usual, a solução de Aloe vera não foi mutagênica

para o sistema de teste. Já na dose dez vezes mais
concentrada provocou um efeito citotóxico e mutagênico.
 Mutagenicidade: Produtos Naturais

Schinus terebintifolius (aroeira)

Teste de mutagenicidade direta sugeriram que os

flavonoides aumentam a frequência de mutação em
cepas deficientes nas enzimas MutM e MutY glicosilases,
principalmente na duplo mutante, sugerindo que as
lesões predominantemente oxidativas, são substratos
destas enzimas no DNA.
 Mutagenicidade: Produtos Naturais

Ocotea dukei (louro-de-cheiro)

Induz hipotensão, devido a uma diminuição da

resistência periférica vascular, e bradicardia, devido a
uma ativação indireta dos receptores muscarínicos
cardíacos via estimulação vagal.
 Agentes Mutagênicos: Alimentos Naturais

• Compostos sintetizados pelos vegetais:

-alcalóides: morfina, papaverina e narcotina: extraídas
do ópio da papoula
-cafeína e teofilina: chás e café
-folhas e raízes de confrey: hepatocarcinoma
-aji-no-moto: glutamato de monossódico (cana-de-
açúcar)
-própolis: contém quercetina (flavonoide)
 Agentes Mutagênicos: Alimentos Processados

• Frituras de alimentos e torrefação: formam HAP

• Rancificação de óleos (aquecimento sucessivo): formam
HAP
• Armazenamento de grãos: contaminação por fungos
-aflatoxina: Aspergillus flavus
(amendoim)
Quebra a ligação entre a
base e o açúcar  sítio
apurínico

-furocumarinas: contidas em cogumelos

• Conservantes: nitratos e nitritos
 Mutagênese

Testes Genéticos em Mutagênese

Teste de Mutação Gênica em Células

de Mamífero (Mouse Lymphoma Assay
– MLA)

Teste de
Micronúcleos
 Mutagênese

Teste de Micronúcleos

Baseia-se na idéia de que quebras nas fitas de DNA ou

fibras rompidas do fuso acromático permitem a um
cromossomo inteiro ou cromossomos formar núcleos
de tamanho menor após uma rodada de divisão
celular.

- Adiciona bastante velocidade e robustez estatística à

análise;
- Validado internacionalmente;
- Aberrações numéricas e cromossômicas;
- Fácil execução e análise
 Mutagênese

Teste de Micronúcleos
In vivo
 Mutagênese

Teste de Micronúcleos
 Mutagênese

Teste de Micronúcleos
Micronuclei

Cyt-B

Cellular Binucleada

Citocinese bloqueada pelo uso da Citocalasina B

 Mutagênese

Teste de Micronúcleos

 Quebra cromossômica (clastogênese)

 Perda cromossômica (aneugênese)

 Mutagenicidade

Teste de Micronúcleos

• PCE – Eritrócito Policromático. Célula mais jovem, com maior

quantidade de RNA no citoplasma e apresenta coloração
roxa.
• NCE – Eritrócito Normocromático. Célula mais antiga, que já
perdeu o RNA do citoplasma e apresenta coloração laranja.
 Mutagenicidade

Teste de Micronúcleos

• Análise em microscópio de 500 células avaliando a

proporção de PCE e NCE – Pode indicar toxicidade,
quando o número de células jovens decai em
relação ao número de células antigas.

• Análise de 1000 PCE por lâmina avaliando a

presença de micronúcleos – Indica a indução de
dano ao DNA.
 Teste de Micronúcleos
Quando um produto apresenta um resultado positivo
• Um resultado positivo in vitro não é o final do processo
de análise.
– > 25% das drogas no mercado têm ao menos um
resutado positivo na avaliações de Genética
Toxicológica.
• Nem todos os resultados positivos são relevantes para
humanos, que frequentemente estão expostos a
compostos em baixas concentrações.
• Resultados positivos in vivo são mais problemáticos do
que resultados positivos in vitro.
• A escolha do teste e a qualidade com que é feito o
desenho experimental são muito importantes.
 Teste de Micronúcleos

Resultado positivo in vivo

• Resultados de testes de genotoxicidade in vivo,

principalmente teste de citogenética em medula óssea,
desempenha um papel vital na avaliação de risco.

• Aumento em células de medula óssea micronucleadas

tem alto poder regulatório, indicando que o composto
teste é um carcinógeno genotóxico potencial.
 Teste de Micronúcleos

Resultado positivo in vivo

• Existem novas evidências de que distúrbio fisiológicos

(alterações na temperatura corporal, aumento na
eritropoese, inibição da síntese protéica) induzidos por
compostos químicos em roedores usados nestes testes
podem ocasionar aumento em células de medula óssea
micronucleadas que não estão relacionadas ao potencial
genotóxico do composto em teste.
Foto: Natália Romão
Foto: Natália Romão
Foto: Natália Romão
 Teste de Micronúcleos

Micronúcleos: Uso de Allium cepa

Allium cepa

Anáfase normal Anáfase anormal

 Teste de Micronúcleos

Micronúcleos: Uso de Allium cepa

 Avalia o índice mitótico, o índice de

proliferação celular, metáfase e/ou anáfases
anormais, MNs e outras alterações celulares.

Alterações Genéticas em Células Meristemáticas de Allium Cepa

 Teste de Micronúcleos

Testes Citogenéticos

a) Monitoramento humano do risco de

mutagênese ocupacional e/ou ambiental.

b) Detectam alterações cromossômicas estruturais

e/ou numéricas, microscopicamente visíveis,
mas de viabilidade desconhecida, que
envolvem no mínimo 10Mb.

c) Apresentam baixo custo, praticidade e são

excelentes marcadores biológicos de
exposição à agentes clastogênicos.
 Teste de Micronúcleos

Testes Material Tempo Observações

MN Sangue
Medula Óssea Avalia a capacidade de
indução de danos
Células da Mucosa 48 - 96
cromossômicos
MT Oral horas
estruturais e/ou
Células vegetais numéricos
CHO, etc
 Teste de Micronúcleos

Testes Genéticos em Mutagênese

Quebra Cromossômica

Fragilidade Cromossômica
 Number of micronuclei by 2000 cel.

50  No organismo humano os
*** herbicidas compostos por triazina
40 são absorvidas com maior
***
facilidade pelo trato gastrintestinal
30
e após 72 horas:
20  65% é excretado pela urina
 15% é acumulado
10

0  Aumenta o fator de risco para a doença

de Parkinson; Processos carcinogênicos e
N

JP
M
C

E-
E-

teratogênicos, Desordens neurológicas.

G
G

Figura 3. Índice de Micronúcleos encontrados por grupos pesquisados. ANOVA, seguida

por teste Tukey, onde *** p<0,05.
Caso FOSFOETALONAMINA...

Substância criada pelo

pesquisador doutor Gilberto
Orivaldo Chierice do Instituto
de Química da Universidade
de São Paulo.
Resultado com o teste do
Micronúcleo
A análise pré-clínica através do teste do micronúcleo para
atestar a segurança no uso da fosfoetanolamina sintética não
apresentou efeitos citotóxicos e genotóxicos em EPC de medula
óssea de camundongos.

Assim podemos concluir que o teste do

micronúcleo tem sido uma ferramenta
Importante para demonstrar o principal
biomarcdor que pode desencadear doenças
Degenerativas.
GENOTOXICIDADE
 Genotoxicidade

• O estudo dos efeitos adversos de agentes

físicos e químicos no material genético de
células (DNA ou cromossomos) e a
subsequente expressão de tais mudanças.

• Os testes de genotoxicidade geralmente são

feitos juntamente com o mutagenicidade para
determinar os danos ao material genético.
 Genotoxicidade

• Diferente das mutações, as lesões detectadas

pelo ensaio cometa são passíveis de correção.
• Uma vez que danos no DNA são
frequentemente célula e tecido específicos,
esta metodologia, permite a detecção de
danos e seu reparo em uma única célula, e
consequentemente, em determinada sub-
população celular, é de extrema relevância
para a avaliação de compostos genotóxicos.
 Genotoxicidade

• Testes de genotoxicidade

– Diversas metodologias
– Importante pesquisa para avaliação da toxicidade
celular
– Identificar potencial carcinogênico e a
mutagenicidade
– Proteger o material genético humano
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa

• Desenvolvido por Singh e cols (1988) para detectar

o dano primário ao DNA.

• É bastante sensível, detectando quebras simples e

duplas e sítios alcalilábeis nas moléculas de DNA;

• Microeletroforese de células suspensas em uma

fina camada de agarose disposta sobre uma
lâmina e lisadas por detergentes e alta
concentração de sais.
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa
• Teste indicativo
• Simples, sensível e rápido
• Danos em células individuais
• Pequeno número de células
• Pode ser realizado em qualquer célula nucleada
• Dano e reparo no DNA
• Muito usado em estudos de genética toxicológica
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa
• Geralmente feito com células de modelos animais
teste (ratos ou camundongos).

• Estes animais são tratados com a substancia teste e

depois é recolhida o material de análise:
– Sangue, células de tecidos (coração, fígado, rins, cérebro)
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa
Procedimento
1- Células embebidas em gel de agarose
(lâminas)
2- Lisar sob condições alcalinas (ou neutras)
3- Eletroforese
4- Segmentos DNA livres migram fora do
núcleo → Fora do núcleo
5- Observação microscópica
6- Classificação das células em classes
(0-4)
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa
• Após a eletroforese as células (nucleóides)
adquirem uma morfologia semelhante a de um
cometa;
• Cabeça representa o arcabouço de DNA intacto e a
cauda, fragmentos provenientes de lesões no DNA.
Genotoxicidade

Ensaio Cometa
Teste cometa com vários
graus de dano ao DNA:

A - célula sem dano

B - célula com leves danos
C - célula danificada ou
clássico cometa
D - célula altamente
danificada
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa

Pode-se avaliar também a

antigenotoxicidade de uma
substancia através do teste ex
vivo.

A antigenotoxicidade serve para determinar o

efeito protetor de uma substancia frente ao agente
danoso (peróxido de hidrogênio)
 Genotoxicidade

Ensaio Cometa

• Para isso: as lâminas do controle negativo e

dos grupos expostos a substância teste são
submetidas a um tratamento com peróxido
de hidrogênio (H2O2) durante 5 minutos.
• Depois procede-se normalmente com a
eletroforese.
Algumas lâminas de teste Cometa
desenvolvido NO CAMPUS JI-PARANÁ
Foto Natália Romão
Foto Natália Romão
Foto Natália Romão