Introduccion:

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una

muestra, tales como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante la
formación de derivados coloreados de las proteínas, base de los métodos de
BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre
con el enlace peptídico; en el método de Lowry, además del complejo anterior
también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia
total.
El método utilizamos durante esta práctica se basa en un principio diferente: se
emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac.
fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del
interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir
fácilmente.
El método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un
colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la
presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos
como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear
que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a
280 nm. Para determinar la concentración de proteína total presente en una
muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una
proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovina.

Mas información:
Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una
de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante
interaccionan con los grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por
absorbancia a 595nm y también existe una relación lineal dentro de determinadas
concentraciones de proteínas.
Entre las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes
reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución, los cuales no son
compatibles con el ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo de BCA, y la
posibilidad de medir proteínas de alto peso molecular ya que el colorante no se
une a péptidos de bajo peso molecular
La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con
detergentes, los cuales se utilizan de rutina para solubilizar proteínas de
membrana. Sólo un nivel de detergente no iónico muy bajo, tal como Tritón X-100
a una concentración final de 0,008 % (v/v), puede mejorar la sensibilidad y
variabilidad del ensayo de Bradford. Los detergentes pueden ser eliminados por
cromatografía de exclusión molecular o por diálisis, lo que lleva a la dilución de la
muestra; o por precipitación con fosfato de calcio o acetona, ambos métodos que
permiten recuperar como mucho el 70 % de la cantidad inicial de proteína. En una
publicación reciente Cheng et al describen un método basado en el ensayo de
Bradford que permite la cuantificación de proteínas de manera rápida incluso
cuando la solución de proteínas contiene substancias interferentes. El método
demuestra una tasa de recuperación de proteínas mejorada después de tan sólo 1
hora de precipitación en acetona posterior a la adición de sacarosa, un componente que
no interfiere con el ensayo de Bradford.