Sei sulla pagina 1di 117

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

EFECTO DE LA PRESIÓN Y TEMPERATURA EN LA


EXTRACCIÓN POR CO2 SUPERCRÍTICO DE CAROTENOIDES DE
ZANAHORIA (Daucus carota).

TESIS

PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE:


INGENIERO EN NDUSTRIAS ALIMENTRIAS

PRESENTADO POR LA BACHILLER:

CHAMORRO REQUENA, HELEN ROSSELLINI

HUANCAYO - PERÚ
2017
JURADO EXAMINADOR

Dra. Nora Marina Veliz Sedano


Presidenta

M. Sc. Emilio Fredy Yabar Villanueva M. Sc. Carlos Seguil Mirones


Jurado Jurado

Dra. Clara Raquel Espinoza Silva


Jurado

Ing. Wagner Vasquez Orihuela


Secretario
ASESOR

M.Sc. Norma N. GAMARRA MENDOZA

i
Dedicado a mi madre Sra. Feliciana Requena de Chamorro y hermanos quienes me impulsaron
a superarme cada día, también por su incondicional e invaluable apoyo brindado hasta el día
de hoy.

A la memoria de mi padre Jonás Chamorro Abarca.

Helen R. Chamorro Requena

ii
Agradecimientos

• A la M.Sc. Norma Gamarra Mendoza por su participación en la dirección del presente


trabajo de tesis, por su apoyo incondicional y confianza durante el tiempo que duro la
ejecución de este trabajo de investigación y sobre todo por su amistad.

• Al proyecto de investigación “EXTRACCION CON CO2 SUPERCRITICO DE


CAROTENOIDES DE RESIDUOS SOLIDOS DE ZANAHORIA (Daucus carota) Y DE
AJI ROJO-AMARILLO (C. baccatum, C. chinense) PARA LA PIGMENTACION
NATURAL DEL TEJIDO MUSCULAR DE TRUCHAS ARCO IRIS
(Ocorhynchusmykiss) EN LA REGION JUNIN”. Financiado por el canon, sobre canon
y regalias mineras.

• Al Dr. Moisés Mendoza Álvarez, por su valioso apoyo que desinteresadamente me


brindo.

• A Charly Ames por su amor y apoyo incondicional.

• A mis compañeros y amigos del laboratorio de Química de alimentos, Narda Gavilán y


Daniel Moreno por su valiosa ayuda y apoyo en diferentes momentos del desarrollo del
trabajo de tesis.

• A la facultad de ingeniería en Industrias Alimentarias de la UNCP, por la formación


académica que me brindo.

• A la empresa IMBAREX S.A. por permitirnos usar su equipo de extracción con CO2-
supercrítico.

• Y a todos aquellos que han estado junto a mí durante el desarrollo de este trabajo de
investigación

INDICE GENERAL

LISTA DE FIGURAS vii

iii
LISTA DE TABLAS ix
RESUMEN 1
I. INTRODUCCIÓN 2
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

2.1 CAROTENOIDES 4
2.1.1 Presencia y distribución de los carotenoides 4
2.1.2 Estructura de los carotenoides 5
2.1.3 Propiedades generales 8
2.1.3.1 Propiedades físicas 8
2.1.3.2 Propiedades espectroscópicas 8
2.1.4 Estabilidad de los carotenoides 10
2.1.4.1 Efecto de la oxidación 10
2.1.4.2 Efecto de la temperatura 11
2.1.4.3 Efecto de la luz 12
2.1.4.4 Efecto del pH 12
2.1.5 Biodisponibilidad de los carotenoides 13
2.1.6 Actividad biológica 13
2.2 EXTRACCION DE COMPUESTOS BIOACTIVOS ....... 14
2.2.1 Métodos de extracción 14
2.2.2 Extracción mediante fluidos supercríticos 16
2.2.3 Fluidos supercríticos 16
2.2.4 Factores que afectan el rendimiento de extracción con fluidos supercríticos 19
2.2.4.1 Preparación de la muestra 19
2.2.4.2 Tamaño de partícula 20
2.2.4.3 Parámetros: temperatura y presión 20
2.2.4.4 Humedad 20
2.2.4.5 El uso de cosolventes 21
2.2.5 El CO2 fluido supercrítico 21
2.2.6 Etapas principales del proceso de extracción supercrítica 22
2.2.7 Equipamiento para la extracción supercrítica 23
2.3 ANTECEDENTES DE EXTRACCION POR FLUIDOS SUPERCRITICOS 24
2.4 LA ZANAHORIA 28
2.4.1 Descripción 28
2.4.2 Clasificación Taxonómica 28
2.4.3 Propiedades 29
2.4.4 Aporte Vitamínico 29

iv
2.4.5 Los carotenos y el color de las zanahorias 30
III. MATERIALES Y METODOS 31

3.1 LUGAR DE EJECUCION ,31


3.2 MATERIA PRIMA 31
3.3 MATERIALES Y EQUIPOS 31
3.3.1 Equipos 31
3.3.2 Materiales 32
3.3.3 Reactivos 32
3.4 METODOLOGIA EXPERIMENTAL 33
3.4.1 Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por fluidos

supercríticos- CO2 33
3.4.1.1 Acondicionamiento de la zanahoria 33
3.4.1.2 Descripción del flujo de procesamiento 34
3.4.1.3 Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por el
método convencional (tetrahidrofurano – metanol) 35

3.4.1.4 Descripción de la extracción convencional


(tetrahidrofurano – metanol) de carotenoides de zanahoria 36
3.4.1.5 Diagrama de flujo del proceso de extracción de carotenoides con
CO2 – supercrítico . 37
3.4.1.6 Descripción del protocolo para la cuantificación de
carotenoides por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) 38
3.4.2 Diseño experimental estadístico 40

3.4.2.1 Diseño estadístico 40


3.4.2.2 Modelo estadístico 41
IV RESULTADOS Y DISCUSIONES 42
4.1 PROCESO DE EXTRACCIÓN CON SC-CO2 DE ZANAHORIA 42
4.1.1 Acondicionamiento de la Materia Prima 42
4.1.2 Determinación por Cromatografia Liquida de Alta eficiencia (HPLC) de
carotenoides extraídos por el método convencional. 45

4.1.3 Determinación por HPLC de Carotenoides de zanahoria 46


4.1.4 Espectros de los Estándares de Luteína, α-caroteno y β-caroteno 51

4.1.5 Espectros de carotenoides de zanahoria α-caroteno, β-caroteno


y Luteína extraídos por CO2-superritico 52
V. CONCLUSIONES 63

v
VI. RECOMENDACIONES 64
VII.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA 65
VIII. ANEXOS 73
LISTA DE FIGURA

Figura 1. Propiedades físicas y químicas importantes de los carotenoides. 8

Figura 2. Espectro de absorción ultravioleta/visible general para los carotenoides. 10

Figura 3. Propiedades del fluidos supercríticos. 17

Figura 4. Diagrama de fases solido/liquido/gas. PT: punto triple, PC: punto


crítico, PC: presión critica, TC: temperatura critica. 18

Figura 5. Esquema de un extractor de fluidos supercríticos. 24

Figura 6. Raíz de la zanahoria (Daucus carota). 28

Figura 7. Diagrama de flujo para el acondicionamiento de la zanahoria seca. 33

Figura 8. Diagrama de flujo, de la extracción de carotenoides por el método


convencional. 35

Figura 9. Diagrama de flujo, de la extracción con CO2- supercrítico de los


carotenoides de la zanahoria. 37

Figura 10. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria


extraídos por el método convencional (Tetrahidrofurano/metanol 1:1).

45 Figura 11. Perfil cromatográfico de los carotenoides estándar (50 ppm).

46

Figura 12. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2-supercrítico a 200 bar y 40 °C. 46

Figura 13. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos

vi
con CO2-supercrítico a 280 bar y 40 °C. 47

Figura 14. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2-supercrítico a 200 bar y 50 °C. 47

Figura 15. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2-supercrítico a 280 bar y 50 °C. 48
Figura 16. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos
con CO2-supercrítico a 200 bar y 60 °C. 48

Figura 17. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2-supercrítico a 280 bar y 40 °C. 49

Figura 18. Espectros de los estándares de carotenoides (a) α-caroteno, (b)


β-caroteno y (c) Luteína.

51 Figura 19. Espectros de los carotenoides de zanahoria.

52

Figura 20. Influencia de la presión y temperatura en la extracción con


SC-CO2 de carotenoides totales de zanahoria. 56

Figura 21. Fracciones de carotenoides extraídos por SC-CO2 de zanahoria. 58

Figura 22. Comparacion del método convencional (tetrahidrofurano y metanol)


con CO2-supercritico en la extracción de carotenoides de zanahoria. 59 LISTA DE
TABLAS

Tabla 1. Estructura y características de los carotenos comunes en los alimentos. 6

Tabla 2. Estructuras y características de las xantofilas comunes en los alimento. 7

Tabla 3. Métodos empleados para la extracción de compuestos naturales (pigmentos) 15

Tabla 4. Propiedades físicas de un gas, líquido y fluidos supercrítico 17

vii
Tabla 5. Propiedades criticas de las sustancias más comúnmente empleadas
en condiciones supercríticas

19 Tabla 6. Solubilidad del β- caroteno con CO2 supercrítico

26 Tabla 7. Extracción de carotenos con CO2 supercrítico

27

Tabla 8. Contenido total de α-caroteno y β-caroteno (mg/100g fresco) en


diferentes cultivares de zanahorias anaranjadas crudas 30

Tabla 9. Característica de la materia prima acondicionada para la extracción con


CO2-supercritica, 42

Tabla 10. Cantidad de extracto de zanahoria obtenida por extracción convencional 43

Tabla 11. Cantidad de extracto de zanahoria obtenida en diferentes tratamientos


de la extracción con SC-CO2 44

Tabla 12.Características espectrales de los carotenoides. 53

Tabla 13.Tiempos de retención, área y % de área de carotenoides estándar y


obtenidos por extracción con CO2-supercritico de la zanahoria 54

Tabla 14. Fracciones de carotenoides por extracción con CO2-supercritïco


presentes en la zanahoria 55

Tabla 15 .Análisis de varianza ANOVA de los carotenoides totales de


los seis tratamientos obtenidos con SC-CO2 en la zanahoria 60
Tabla 16. Medias de los carotenoides totales 60

Tabla 17. Comparación de rangos múltiples por Duncan de los tratamientos


obtenidos con CO2 – supercrítico en la zanahoria. 62

Tabla 18. Comparación de rangos múltiples por Duncan para las temperaturas 62

viii
RESUMEN

Los carotenoides son de interés en la industria de alimentos debido al valor nutricional


y propiedades como colorantes. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de
la presión y temperatura en la extracción por CO2-supercrítico de carotenoides de
zanahoria (Daucus carota). La muestra fue secada a 40 °C por un tiempo de 8 h, luego
fue molida y tamizada hasta obtener un tamaño de partícula de 0,250 mm con una
humedad de 10 - 12 % ± 2. Se realizó la extracción con presiones de 200 y 280 bar y
temperaturas de 40, 50 y 60 °C por 2,5 h se realizó una réplica por cada tratamiento.
La extracción se realizó en un equipo de extracción por fluidos supercríticos (TH2224X2
SUPERCRITICAL CO2 EXTRACTION DEVICE). Los carotenoides del extracto de
zanahoria fueron identificadas y cuantificados por cromatografía líquida de alta
eficiencia (HPLC). Los principales carotenoides que se identificaron en el extracto de
zanahoria fueron luteína, α-caroteno y β-caroteno. La solubilidad máxima de
carotenoides totales fue a 50 °C y 280 bar obteniendo 84,50 mg /100 g ms de
carotenoides totales, mientras que la solubilidad más baja se dio a 200 bar y 40 °C,
para efectos de comparación se realizó la extracción convencional con
(Tetrahidrofurano/metanol) obteniéndose 48,08 mg /100 g ms de carotenoides totales.
Los resultados mostraron que el rendimiento se incrementó con la presión y
temperatura debido a la interacción molecular ente el soluto y el solvente.

I. INTRODUCCION

1
A nivel mundial, la preocupación por el aprovechamiento de residuos ha tomado gran
fuerza entre la comunidad científica y a nivel industrial. Sin embargo los residuos
sólidos de zanahoria generados en las transformaciones agroindustriales y por las
pérdidas postchosecha en el Perú aún no han sido aprovechados eficientemente, en
parte por desconocimiento y por la falta de métodos apropiados para la extracción de
carotenoides.

Es importante destacar que las zanahorias, al igual que otras hortalizas, desempeñan
un papel muy importante en el equilibrio de la dieta humana, especialmente por su
composición en vitaminas, minerales y otros compuestos bioactivos, caracterizándose
además por ser pobre en grasa y rica en fibra dietética. Los estudios de calidad
nutricional de las zanahorias, muestran que tienen alto contenidos de β-caroteno
(Fraser y Bramley, 2004), que estos pueden variar con factores físicos y ambientales,
y además tienen alta capacidad antioxidante (Nicolle, Simon, Rock, Amouroux y
Remesy, 2004). Los pigmentos responsables del color de las zanahorias, son de
importancia para los científicos de alimentos y nutrición debido a su provitamina A y a
la actividad antioxidante. β-caroteno constituye una porción grande (60 – 80 %) de los
carotenoides en la zanahoria seguido de α-caroteno (10 – 40 %), luteína (1 – 5 %) y
otros carotenoides menores (0,1 – 1 %) (Sun y Temelli, 2006).

Los carotenoides son un grupo de pigmentos naturales solubles en lípidos y solventes


no polares, que el ser humano no es capaz de sintetizar y necesita adquirirlo por medio
de la dieta. Se encuentran fundamentalmente en las frutas y verduras, les proporciona
coloración amarilla, anaranjada y roja (Macías et al., 2002). El gran número de dobles
enlaces que contiene las moléculas de los carotenoides motiva la inestabilidad que
caracteriza a estos pigmentos, son sensibles a la luz y oxígeno, su degradación se
acelera por los radicales libres que se forman en la oxidación lipídica las cuales deben
ser consideradas en los procesos de extracción y cuantificación.

Por otra parte, los fluidos supercríticos han sido usados ampliamente en la extracción
de diversos compuestos naturales a partir de plantas debido a las propiedades que
presentan y principalmente porque no dejan residuos en el producto final y además por
ser amigable con el medio ambiente. El dióxido de carbono (CO2) en estado
supercrítico es uno de los disolventes más utilizados en este tipo de tecnología debido
a que su temperatura critica es baja (31,1 °C) esto permite que sea un disolvente
apropiado para la extracción de compuestos termolábiles como es el caso de los

2
carotenoides que sufren descomposición térmica por arriba de 65 °C, además es
barato, fácil de transportar y no es toxico.

Las tendencias en la legislación y el uso de pigmentos o colorantes en la industria


alimenticia apuntan hacia la exclusión progresiva de pigmentos sintéticos en favor de
los naturales considerados como inocuos y que son utilizados no solo por su poder
colorante, sino también por el valor añadido de sus propiedades nutricionales y
fisiológicas que son beneficiosas para la salud como es el caso de los carotenoides.

Es así que los objetivos del presente trabajo de investigación son:

Objetivo General:

• Evaluar los parámetros del proceso de extracción con CO2 - supercrítico y


cuantificar el contenido de carotenoides de zanahoria (Daucus carota).

Objetivos Específicos:

• Determinar el efecto de la presión y temperatura en la extracción con CO 2


- supercrítico en el rendimiento de carotenoides de la zanahoria (Daucus carota).

• Cuantificar el contenido total y fracciones de carotenoides obtenidas en la


extracción por fluidos supercríticos.

• Comparar el contenido total y fracciones de carotenoides de la extracción del


método convencional (tetrahidrofurano/metanol) y el CO2 – supercrítico.

3
II. REVISION BIBLIOGRÁFICA

2.1 CAROTENOIDES

Los carotenoides son pigmentos naturales más comunes, son los responsables de la
gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos incluidos en los alimentos
vegetales y en algunos alimentos de origen animal, también presentes en pájaros,
insectos, peces y crustáceos. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia
que se dividen en dos grandes grupos según su estructura química, los
hidrocarbonados llamados carotenos y los oxigenados denominados xantofilas
(Rodríguez- Amaya 1999). Desempeñan una gran diversidad de funciones biológicas
en las plantas sino que también son importantes para los animales y los seres
humanos. (Esteban, Moran, Berrecil y Garcia, 2015). Pero el papel más importante en
la dieta humana es su capacidad como provitamina A, sin embargo para obtener
beneficios de los carotenoides, estos deben absorberse, transportarse y ser
depositados en ciertos tejidos (Dutta, Chadhuri y Chakraborty, 2005).

2.1.1 Presencia y distribución de los carotenoides

Los carotenoides están muy difundidos en la naturaleza. Son sintetizados por


plantas y muchos microorganismos (bacterias, levaduras, hongos y microalgas).
Los carotenoides se localizan en las células vegetales en el interior de orgánulos
especializados, cloroplastos y cromoplastos; en los primeros acompañan a las
clorofilas. En el caso de los frutos maduros, los carotenoides se acumulan en los
plastoglóbulos de los cromoplastos de forma masiva y es donde la diversidad
estructural alcanza un mayor grado (Mínguez, Perez y Hornero, 2005)

En la dieta, fuentes mayoritarias de β-caroteno incluyen las zanahorias,


espinacas, acelgas, brócoli, níspero, pimiento rojo y apio verde, fuentes de luteína
representan las espinacas, acelgas, brócoli, apio verde, espárrago verde y maíz,
mientras que α-caroteno se encuentra en zanahorias, plátano, judías verdes y
aguacate. En las frutas las xantofilas son el tipo de carotenoides mayormente
encontrado. Pero en general, las mayores concentraciones de carotenoides se
encuentran en aquellos tejidos con gran cantidad de clorofilas (Burgos y
Calderón, 2009).

4
Son varios los factores que afectan el contenido de carotenoides en las plantas,
entre los cuales se pueden mencionar, los factores genéticos, el estadío de
madurez del vegetal, su procesamiento y almacenamiento; factores ambientales
como, la exposición a la luz (a mayor exposición mayor concentración de
carotenoides), condiciones del cultivo y enfermedades de los vegetales
(Fennema, 2000).

2.1.2 Estructura de los carotenoides

La estructura básica de los carotenoides es un tetraterpeno de 40 carbonos,


simétrico y lineal formado a partir de ocho unidades isoprenoides de 5 carbonos
unidas de manera tal que el orden se invierte al centro. Este esqueleto básico
puede modificarse de varias maneras como por ejemplo por hidrogenación,
dehidrogenación, ciclación, migración del doble enlace, acortamiento o extensión
de la cadena, reordenamiento, isomerización, introducción de funciones
oxigenadas o por combinaciones de estos procesos, dando como resultado una
gran diversidad de estructuras. (Rodríguez- Amaya 1999).

Los carotenoides hidrocarbonados se denominan colectivamente como


carotenos (Tabla 1) aquellos que contienen oxígeno se denominan xantofilas
(Tabla 2). Las funciones oxigenadas más comunes son los grupos hidroxi (OH) y
epoxi (epóxidos 5,6- ó 5,8-). También se encuentran los grupos aldehído (CHO),
ceto (C=O), carboxi (CO2H), carbometoxi (CO2Me) y metoxi (OMe) (Rodríguez-
Amaya, 1999).

Los carotenoides, ya sea carotenos o xantofilas, pueden ser aciclícos (ej.


fitoflueno, ξ-caroteno, licopeno), monocíclicos o bicíclicos. La ciclación ocurre en
uno o ambos extremos de la molécula, formando uno o dos anillos β de seis
miembros (a veces denominados β-ionona) o anillos ε (algunas veces
denominados α-ionona). Así, el monocíclico γ-caroteno tiene un anillo β mientras
los bicíclicos β-caroteno, βcriptoxantina, zeaxantina y astaxantina tienen dos de
estos anillos. Los bicíclicos α-caroteno y luteína tienen cada uno un anillo β y un
anillo ε (Rodríguez- Amaya, 1999).

5
Tabla 1. Estructura y características de los carotenos comunes en los
alimentos

Fuente: Rodríguez- Amaya (1999)

6
Tabla 2. Estructuras y características de las xantofilas comunes en los
alimentos

Fuente: Rodríguez- Amaya (1999)

7
2.1.3. Propiedades generales

2.1.3.1 Propiedades físicas

Captura el oxígeno singlete

Los carotenoides son solubles en disolventes apolares y su grado de


solubilidad dependerá de los grupos sustituyentes de la molécula,
propiedades que se utiliza para los procesos de extracción y purificación
de los mismos (Burgos y Calderón, 2009). Los carotenoides son
sustancias hidrofóbicas, lipofílicas y son virtualmente insolubles en agua.
Se disuelven en solventes orgánicos como acetona, alcohol, éter etílico,
tetrahidrofurano y cloroformo. Los carotenos son fácilmente solubles en
éter de petróleo y hexano. Las xantofilas se disuelven mejor en metanol y
etanol, en general los carotenoides son sensibles a la luz, oxígeno, calor,
ácidos y peróxidos (Rodríguez- Amaya, 1999).

Figura 1. Propiedades físicas y químicas importantes de los


carotenoides.

Fuente: Rodríguez- Amaya (1999)

2.1.3.2 Propiedades espectroscópicas

Dado el gran número de dobles enlaces de la cadena polienoica


central, los carotenoides puedes existir en diversas conformaciones
cis/trans, aunque la más estable y por tanto presente en la naturaleza
es la de estructura trans. (Mínguez, Perez y Hornero, 2005). El rasgo

8
estructural distintivo de los carotenoides es un sistema extenso de
dobles enlaces conjugados, el cual consiste en alternar enlaces
carbono-carbono simple y doble. Por lo general se denomina cadena
poliénica. Esta parte de la molécula conocida como el cromóforo, es
responsable de la capacidad de los carotenoides de absorber luz en la
región visible (480-780 nm) y en consecuencia su gran capacidad de
coloración. (Mínguez, Perez y Hornero, 2005) y (Rodríguez- Amaya,
1999). El color se acentúa a medida que se extiende el sistema
conjugado de dobles enlaces y la presencia de diferentes grupos
funcionales determinaran en última instancia las características
espectroscópicas propias de cada pigmento. La ciclación causa algún
impedimento, por tanto el β-caroteno y el caroteno son de color
naranja y rojo - naranja respectivamente, aunque tienen el mismo
número de enlaces dobles conjugados que el licopeno (once). La
intensidad y matiz de los colores en los alimentos dependen de que
carotenoides están presentes, sus concentraciones y estado físico.
(Rodríguez- Amaya, 1999).

El espectro visible de los carotenoides es bastante característico en el


rango de 400 a 500 nm. Se observa un máximo alrededor de 450 nm y
generalmente se aprecian dos máximos u hombros a cada lado. Para
un carotenoide específico dado, las posiciones de las bandas de
máxima absorción están en función del número de dobles enlaces
conjugados presentes en la molécula. En la figura 2. se representa un
espectro de absorción ultravioleta/visible general para carotenoides
(Burgos y Calderón, 2009)

9
Figura 2. Espectro de absorción ultravioleta/visible para los
carotenoides.

*I, II y III representan los picos de absorción de la región visible. Fuente:


Burgos y Calderón (2009)

2.1.4. Estabilidad de los carotenoides

Los carotenoides son pigmentos estables en su ambiente natural, pero cuando


los alimentos se calientan, o cuando son extraídos en disolución en aceites o en
disolventes orgánicos, se vuelven mucho más lábiles (Meléndez, Martínez,
Vicario y Heredia, 2004).

Los carotenoides, son insolubles en agua y por lo tanto las pérdidas por lixiviación
durante el lavado y procesamiento de frutos son mínimas. Otros tratamientos
empleados en las industrias alimentarias, como por ejemplo el tratamiento a alta
presión, parecen no afectar significativamente a los niveles de carotenoides en
diversos productos vegetales (Meléndez et al., 2004).

2.1.4.1 Efecto de la oxidación

La degradación de los carotenoides se debe fundamentalmente a


reacciones de oxidación, ya sean no enzimáticas o debidas a enzimas
como las lipoxigenasas, y se presenta generalmente durante el secado.
La interacción de los carotenoides con algunos constituyentes de los
alimentos ejerce un efecto protector contra dichas reacciones, de tal forma

10
que se oxidan más rápidamente cuando se extraen del fruto o se purifican,
es decir la intensidad de la oxidación de los carotenoides depende si el
pigmento se encuentra en el laboratorio y de las condiciones ambientales
(Díaz, 2008). En presencia de oxigeno se produce una degradación
oxidativa, a menudo paralela a la oxidación de lípidos. La tasa de
oxidación depende de la presión parcial de oxígeno, actividad del agua y
temperatura. Los carotenoides, en general son más estables en sistemas
con elevado grado de instauración, ya que el propio sistema acepta más
fácilmente oxígeno y radicales libres, antes que el carotenoide.
Inversamente, en sistemas con lípidos saturados los carotenoides
presentan mayor inestabilidad. (Begoña, Granado y Navarro, 2001). En
consecuencia estos compuestos pueden actuar como pro- o antioxidantes
dependiendo del potencial redox de la molécula y del entorno, entre otros
factores. Los carotenoides que contienen 9 o más dobles enlaces
conjugados pueden inactivar ciertas formas reactivas de oxígeno, como
el oxígeno singlete. En este sentido, el β-caroteno posee como
característica importante, que lo diferencia del resto de antioxidantes
solubles en grasas (como la vitamina E), la de ser más efectivo a bajas
presiones de oxígeno (Meléndez et al., 2004).

2.1.4.2 Efecto de la temperatura

La influencia de la temperatura en la inestabilidad de los pigmentos es


clara tanto para reacciones anhidras como hidratadas, siempre actúa
como acelerador de la reacción de degradación. Por lo general, los
carotenos con mayor actividad biológica son aquellos que tienen todos
sus dobles enlaces en forma de isómero trans, que se transforman
parcialmente en la forma cis durante tratamientos térmicos en ausencia
de oxígeno, esta reacción de isomerización se puede efectuar durante el
proceso de esterilización de productos enlatados, con lo que se pierde
parte del poder vitamínico de los carotenos (Díaz, 2008). El β-caroteno
pierde levemente sus propiedades a temperaturas entre 50 °C y 100 °C y
se destruye a 150 °C (Zaccari, 2010).

El efecto de diferentes formas de cocinar zanahorias en los niveles de α -


y β -caroteno han sido evaluados, comprobándose que a menor tiempo y

11
temperatura de cocinado y contacto con agua, mayor es la retención de
carotenoides. De entre las distintas formas de cocinado evaluadas (al
vapor, cocidas a presión, trituradas, etc), la cocción de las zanahorias en
agua y sin presión resultó ser la que producía una mayor retención de los
carotenoides estudiados (Meléndez et al., 2004).

2.1.4.3 Efecto de la luz

La acción intensa de la luz sobre los carotenos induce su ruptura con la


formación de compuestos incoloros de bajo peso molecular. Estas
reacciones tienen mucha importancia en la industria alimentaria ya que
los carotenos pierden, además de su función biológica de provitamina A,
su color característico. La relación existente entre la pérdida de
pigmentos, la exposición a la luz y la presencia de ácidos grasos
encontrándose que la instauración de los ácidos grasos protege en estas
condiciones a los pigmentos. (Díaz, 2008 y Meléndez et al., 2004).

La degradación del β-caroteno debida a la iluminación con luz


fluorescente sigue un modelo de primer orden, favoreciendo dicha
iluminación la formación de 13,15-di-cis- β -caroteno. En cuanto al
αcaroteno, la reacción también sigue una cinética de primer orden, siendo
la fotoisomerización mayor que en el caso del β-caroteno. El principal
isómero que aparece como consecuencia de la iluminación con luz
fluorescente es el 13-cis-α-caroteno (Meléndez et al., 2004).

2.1.4.4 Efecto del pH

Aunque los carotenoides extraídos o no, son relativamente resistentes a


valores de pH extremos, los ácidos y álcalis pueden provocar
isomerizaciones cis/trans de ciertos dobles enlaces, reagrupamientos y
desenterificaciones, lo cual se debe tener en cuenta a la hora de
manipularlos en laboratorios con fines analíticos (Meléndez et al., 2004).
Los carotenos y la vitamina A en medios neutros y básicos son más
estables mientras que en pH ácido son altamente inestables (Zaccari,
2010)

12
2.1.5. Biodisponibilidad de los carotenoides

La importancia de los carotenoides en los alimentos va más allá de su rol como


pigmentos naturales, de los más de 600 carotenoides conocidos actualmente,
aproximadamente 50 de ellos serían precursores de vitamina A (Rodríguez-
Amaya, 1999). Que están disponibles en la alimentación para ser absorbidos,
metabolizados o utilizados por el organismo humano, una cantidad apreciable
puede absorberse mediante difusión pasiva por la mucosa intestinal (Begoña
et al., 2001) y son convertidos en vitamina A por medio de una o dos
reacciones oxidativas. (Goodman, 2004).

2.1.6. Actividad biológica

La provitamina A más importante es el β-caroteno tanto en términos de


bioactividad como de amplia ocurrencia. Virtualmente todas las muestras de
alimentos carotenogénicos de plantas analizados hasta la fecha contienen
βcaroteno como constituyente principal o menor. Estructuralmente, la vitamina

A es esencialmente la mitad de la molécula de β-caroteno con una molécula


adicional de agua en el extremo de la cadena lateral. Así, el β-caroteno es una
potente provitamina A, a la cual se le asigna un 100 % de actividad. Un anillo
β no sustituido con una cadena poliénica de 11 carbonos es el requerimiento
mínimo para la actividad de la vitamina A. Por lo tanto, no son provitaminas A,
el fitoflueno, -caroteno y licopeno, los cuales carecen de anillos β; y
zeaxantina, luteina, violaxantina y astaxantina en los cuales ambos anillos β
tienen sustituyentes hidroxi, epoxi o ceto. Sin embargo, el -caroteno, α-
caroteno, β-criptoxantina y α-criptoxantina, los cuales tienen un anillo β no
sustituido, tienen actividad de vitamina A y poseen aproximadamente la mitad
de la bioactividad del β-caroteno, la β-criptoxantina también merece atención
dado que es el principal carotenoide de muchas frutas como duraznos,
nectarines, papayas con pulpa naranja, caqui, mombin, y la fruta del árbol del
tomate. (Rodríguez- Amaya, 1999 y Mínguez et al., 2005).

13
Los carotenoides también se han relacionados con un aumento del sistema
inmune y una disminución del riesgo de enfermedades degenerativas tales
como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, degeneración macular

(trastorno ocular) relacionadas a la edad y formación de cataratas (Mínguez


et al., 2005; Begoña et al., 2001; Rodríguez- Amaya, 1999; Burgos y calderón,
2009 y Macías et al., 2002).

Como se ha indicado , la principal función fisiológica de los carotenoides es su


actividad como provitamina A, función que por causas estructurales solo
pueden desarrollar algunos carotenoides junto a esta función, se describe la
capacidad antioxidante como la más representativa de los carotenoides y que
se hace extensiva a todo ellos (con o sin actividad provitamínica). Los
carotenoides inhiben el proceso de auto-oxidación lipídica, por lo que su
presencia en las membranas celulares evita los consecuentes procesos
negativos. Reaccionan además con otros radicales de múltiple naturaleza
como por ejemplo formados durante el metabolismo de compuestos
xenobióticos. En el estrés oxidativo y la génesis de radicales libres están
basados la aparición de procesos degenerativos como ciertos canceres y
tumores (Mínguez et al., 2005).

Los carotenoides son compuestos de gran importancia dietética, no solo como


precursores de vitamina A, sino también como molécula que interviene en la
protección celular y atracción para los consumidores (Hornero - Méndez y
Mínguez - Mosquera, 2001).

2.2. EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS

2.2.1. Métodos de extracción

En la Tabla 3. se describe técnicas de extracción desde la más conocida hasta


las nuevas técnicas que se usan para extraer. Cada una de las técnicas está
descritas de manera que puedan ser comparadas y utilizadas de acuerdo a la
necesidad o tipo de extracción que se desea realizar.

14
Tabla 3. Métodos empleados para la extracción de compuestos naturales
(pigmentos).
Técnicas de
extracción Descripción
La muestra se coloca en el recipiente de extracción y se
mantiene en contacto con el disolvente extractante en el
tiempo necesario a una temperatura determinada. Se hace
Maceración necesaria una filtración de la muestra
La muestra se coloca en un recipiente de extracción y se
lixivia con el disolvente caliente en un extractor soxhlet
Soxhlet durante un tiempo determinado. La evaporación del se hace
convencional por separado.
La muestra se coloca en un recipiente de extracción y es
introducida en el disolvente hirviendo durante 30 - 60 min.
El recipiente es entonces sometido a la extracción soxhlet
Soxhlet con el reflujo del disolvente. Es posible hacer una
Automatizada evaporación del disolvente.
La muestra es tratada con enzimas para degradar los tejidos
y paredes celulares para facilitar de esta forma el proceso
Enzimático de extracción
La muestra a extraer se coloca en un recipiente de
extracción y se le aplica ultrasonido, pudiendo controlar la
Asistida por temperatura se hace necesario la filtración y en ocasiones
ultrasonido la centrifugación del material
La muestra se coloca en una cámara de alta presión y es
extraída con el fluido supercrítico que puede circular a
través de la muestra en circuito cerrado o abierto (CO2), a
presiones mayores a 72 atm y a temperaturas mayores de
31,1 °C. Después de la despresurización los analitos son
Fluidos recogidos en un pequeño volumen de disolvente orgánico
supercríticos o en una trampa sólida
Asistida La muestra se coloca en un recipiente abierto o cerrado y se
por le adiciona el disolvente de extracción. Seguidamente se le
microondas suministra energía en forma de microondas.
Fuente: Coronel (2012)

15
2.2.2 Extracción mediante fluidos supercríticos

La extracción supercrítica es una operación unitaria de transferencia de masa


que explota la capacidad de disolución de los fluidos supercríticos en condiciones
por encima de su temperatura y presión critica, donde no puede haber
liquefacción al elevar la presión o vaporización al aumentar la temperatura (Ruiz,
1996). Es posible obtener extractos libres de disolventes utilizando fluidos
supercríticos y la extracción es más rápido que el uso de disolventes
convencionales (Del Valle y Aguilera, 1999). Su poder disolvente es el más alto
para los componentes no polares o ligeramente polares y disminuye al aumentar
el peso molecular (Brunner, 2005).

El hecho de que las propiedades puedan ajustarse variando la presión y la


temperatura tiene ventajas para la aplicación de estos fluidos como agentes de
extracción. Utilizar un fluido supercrítico para la extracción de un material
determinado a partir de una materia prima supone el reparto del material en el
líquido supercrítico, seguido de un cambio de temperatura y presión que tiene
como resultado el aislamiento del soluto puro por vaporización del CO2.
Finalmente, el fluido supercrítico puede reciclarse invirtiendo el cambio en las
condiciones de temperatura y presión (Velasco, Villada y Carrera, 2007).

2.2.3 Fluidos supercríticos

Un fluido supercrítico posee propiedades de disolvente que se parecen a las de


un líquido, pero también exhibe propiedades de transporte parecidas a las de
un gas. De esta manera, un fluido supercrítico no solo puede disolver solutos
sino que también es miscible con los gases ordinarios y puede penetrar en los
poros de los sólidos. Los fluidos supercríticos tienen una viscosidad más baja y
un coeficiente de difusión más elevado que los líquidos. La densidad de un fluido
supercrítico aumenta al incrementar la presión y, al aumentar la densidad, la

16
solubilidad de un soluto en el fluido supercrítico aumenta (Velasco, Villada y
Carrera, 2007). Para una temperatura constante, a bajas presiones se
favorecerá la disolución de analitos no polares o poco polares, mientras que a
presiones más altas se disolverán los polares y los de peso molecular más alto
(Luque de Castro, Valcarcel y Tena, 1993). En la figura 3. se presenta las
propiedades más importantes de un fluido supercrítico.

Figura 3. Propiedades del fluidos supercríticos


Fuente: Luque de Castro et al. (1993).

Tabla 4. Propiedades físicas de un gas, líquido y fluidos supercrítico

Densidad Viscosidad Difusividad


Fluido (g/mL) (Pa.s) (cm2/s)
Gases 103 10-5 10-1
F. Supercrítico 0,2-0,9 10-4 10-4
Líquido 0,6-1,6 10-3 10-5
Fuente: Velásquez (2008)

Al analizar el diagrama de fases de una sustancia pura (Figura 4), se observa


que los tres estados de la materia están separados por líneas que representan
los equilibrios sólido-líquido o de fusión, sólido-gas o de sublimación y
líquidogas o de vaporización. También aparecen dos puntos característicos: el

17
punto triple (PT), donde coexisten los tres estados, y el punto crítico (PC), al
final de la curva de vaporización. Se advierte, además, que la línea de
vaporización, línea PT – PC, tiene la singularidad de desaparecer en el punto
PC, el punto crítico, a unos valores termodinámicos de presión y temperatura
que se denominan presión crítica (Pc) y temperatura crítica (Tc),
respectivamente (Luque de Castro et al., 1993).

Cuando una determinada sustancia se encuentra a valores superiores a los de


su punto crítico se le conoce como fluido supercrítico. Bajo estas condiciones
no se licua por más que se aumente la presión ni se vaporiza por más que la
temperatura se eleve. Por consiguiente, la fase líquida es indistinguible de la
fase vapor. En este punto la sustancia no puede considerarse ni como gas ni
como líquido. Este comportamiento se ve reflejado en las características que
poseen los fluidos supercríticos, ya que algunas de ellas son inherentes a los

gases y otras a los líquidos (Valverde, 1995 y Nagy y Simandi, 2008).

Figura 4. Diagrama de fases sólido/líquido/gas.


*PT: punto triple, PC: punto crítico, Pc: presión critica, TC: temperatura critica
Fuente: Luque de castro et al., 1993).

En la tabla 5, se puede ver las condiciones de presión y temperatura que definen


el punto crítico de las sustancias más estudiadas.

18
Tabla 5. Propiedades criticas de las sustancias más comúnmente
empleadas en condiciones supercríticas

Peso Densidad
molecular Presión Temperatura critica
Compuesto (g/mol) critica(bar) critica (°C) (g/mL)
Dióxido de carbono 44,01 72 31,1 0,47
Agua 18,02 214,8 374,2 0,32
Amoniaco 17,03 109,8 132,5 0,23
Argón 39,95 48,6 -122,4 0,73
Acetona 58,08 47,0 235,0 0,28
Etanol 46,07 72,0 243,4 0,28
Metanol 32,04 78,9 239,0 0,27
Metano 16,04 46,0 -82,6 0,17
Etano 30,07 47,6 32,3 0,20

Fuente: Rozzi y Singh (2002)

Mukhopadhyay (2000) reporta que el punto crítico posee diversas propiedades


muy peculiares:

• No existe interfase gas- líquido


• La compresibilidad isotérmica se hace infinitamente positiva
• El coeficiente de expansión térmica es infinito y positivo
• La entalpia de vaporización es cero
• Si la densidad se mantiene constante, e igual a la densidad critica, la
capacidad calorífica a volumen constante tiende al infinito.

Al igual que ocurre con el punto crítico, la región supercrítica también tiene unas
propiedades que la hacen peculiar (Shi, 2004 y Mukhopadhyay 2000)

• La densidad por encima del punto crítico depende de la presión y la


temperatura, pero en cualquier caso está más cercana a la de los líquidos
que a los de gases. La densidad aumenta si lo hace la presión a temperatura
constante o si disminuye la temperatura a presión constante.

19
• La viscosidad es mucho más baja que la de los líquidos, lo que confiere
propiedades hidrodinámicas de menor viscosidad si se comparan con los
líquidos.
• La bajísima tensión superficial permite una alta penetrabilidad a través de
sólidos porosos y lechos empaquetados.

• Los coeficientes de difusión (difusividad) son mayores que en líquidos, por lo


que la transferencia de materia es más favorable.

2.2.4 Factores que afectan el rendimiento de extracción con fluidos


supercríticos

2.2.4.1 Preparación de la muestra:

El secado de las muestras antes de la extracción es necesario, la


molienda también es necesario para lograr el tamaño de las
partículas pequeñas, para la extracción de compuestos bioactivos
por SC – CO2. (Ahluwalia, Shivhare y Basu, 2013)

2.2.4.2 Tamaño de partícula

El rendimiento de extracción aumenta con la disminución del tamaño


de partícula, como la molienda antes de la extracción no sólo
incrementa el área interfacial, pero también libera solutos mediante la
destrucción de las estructuras internas de las partículas, lo que
resulta en una mayor velocidad de extracción. La resistencia a la
difusión entre partículas es más pequeño para el tamaño de partícula
más pequeño debido a la trayectoria de difusión más corta. Una
cantidad creciente del extracto frente a tamaño de partícula se ha
notado y en sus estudios que concluyeron que las estructuras
celulares deben romperse para obtener una extracción completa de
las sustancias (Ahluwalia et al., 2013).

2.2.4.3 Parámetros: temperatura y presión

20
La extracción con CO2 - supercrítico aumenta la densidad con la
presión constante y la solubilidad aumenta con la temperatura por
encima del cruce de presión. La temperatura afecta en gran medida
la tasa de extracción a presiones superiores a la adhesión (Sun y
Temelli, 2006).
2.2.4.4 Humedad

Otorga diferentes efectos sobre el rendimiento de los carotenoides, el


rendimiento de los α - β caroteno aumenta con la disminución del nivel
de humedad, esto se puede explicar por el hecho de que el agua
puede actuar como un disolvente auxiliar para la extracción
relativamente de compuestos polares, como la luteína, mientras que
la presencia de agua no es favorable para el licopeno y los carotenos
que son relativamente no polares (Ahluwalia et al., 2013).

2.2.4.5 El uso de cosolventes

La acetona, etanol, metanol, hexano, diclorometano y el agua han


sido comparados como cosolventes en extracción con CO2
supercrítico por la mezcla de cosolvente con la muestra (Sun y
Temelli, 2006) los cosolventes aumentan el rendimiento y acortan el
tiempo de operación pero pueden dejar residuos o dificultar la
recuperación de los bioactivos extraídos (Jaren, Nienaber y Schwartz,
1999).

Existe una alternativa al uso de condiciones tan extremas que


consiste en la adición de pequeñas cantidades (≤ 10 %) de
modificadores, es decir, sustancias polares como etanol o agua, que
añadidas al CO2 varían enormemente la polaridad del fluido
extractante. En ocasiones los modificadores no solo sirven para
aumentar la polaridad de CO2 si no que se emplean con el objetivo
de aumentar su capacidad solvente, por lo que también se emplean
sustancias apolares (Mendiola, 2008).

2.2.5 El CO2: fluido supercrítico

21
La mayoría de los sistemas utilizan dióxido de carbono supercrítico como
disolvente, ya que es inerte, gaseoso en condiciones de presión y temperatura
ambiente, no tóxico, no inflamable, reciclable, disponible en alta pureza, no
deja residuos, y opera a temperaturas y presiones seguras (Corbin, 2014). Es
más inocuo para el medio ambiente (se puede considerar como un disolvente
verde en todas sus aplicaciones), a pesar de que este gas es la principal causa
del efecto invernadero, cualquier aumento del efluente de CO2 derivados de la
extracción con fluido supercrítico industrial seria insignificante, plantas
comerciales recirculan CO2 por lo que su uso como un disolvente de extracción
no aumenta la cantidad ya presente en la atmosfera (Barbosa, Tapia y Cano,
2005). Tiene un bajo costo, lo que hace que su uso no sea muy costoso una
vez que se tiene el equipamiento de extracción, presenta además una alta
capacidad de solvatación, selectividad y una gran efectividad de extracción,
en muchas ocasiones superiores a los métodos tradicionales que utilizan
disolventes orgánicos (Mustapa, Manan, Mohd, Setianto y Mohd, 2011)

La no polaridad de dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) limita la


extracción y solubilidad de los compuestos polares. Los métodos comunes
han utilizado co-disolventes (tensioactivos) que aumentan la solubilidad de
grupos polares / compuestos. Esto permite la extracción de ambos materiales
hidrofóbicos e hidrofílicos (Corbin, 2014 y Mustapa et al., 2011).

El cosolvente más empleado es el etanol, debido a que es un disolvente inocuo

en determinadas proporciones, con el medio ambiente (Peralta, 2010). 2.2.6 Etapas

principales del proceso de extracción supercrítica

El sistema de proceso de extracción con fluidos supercríticos se rige por cuatro


pasos claves: extracción, expansión, separación y acondicionamiento del
disolvente, los pasos son acompañados por cuatro componentes primarios
genéricos: columna extractora (recipiente de alta presión), las válvulas de
control de presión, separador de columna e intensificadores de presión
(bomba) (Shi, 2004).

La finalidad de la presurización es alcanzar la presión necesaria del solvente


para la extracción, ya sea por medio de un compresor o de una bomba, el

22
ajuste de temperatura remoción o adición de energía térmica, por medio de
intercambiador de calor o resistencias eléctricas, para que el fluido comprimido
alcance la temperatura requerida, la extracción se lleva a cabo en un recipiente
extractor a alta presión, el cual contiene la matriz que será procesado, en esta
etapa el fluido entra en contacto con la matriz y arrastra el soluto de interés, la
fase móvil que consiste en el fluido CO2-supercrítico y los componentes
solubilizados se transfiere al separador donde el poder de solvatación del
fluido se reduce mediante el aumento de la temperatura y / o disminuyendo la
presión del sistema, el extracto se precipita en el separador, mientras que el
fluido CO2-supercrítico se libera ya sea a la atmósfera o se recicla de nuevo al
extractor (Mendiola, 2008 y Shi, 2004).

2.2.7 Equipamiento para la extracción supercrítica

1. Tanque de almacenamiento, se almacena el fluido a utilizar como solvente


en condiciones de presión y temperatura normales. 2. Intercambiador de
calor, el fluido se enfría hasta alcanzar una temperatura tal que pueda pasar
sin problemas por la bomba, para esto se requiere el solvente en estado
líquido. 3. Bomba, se eleva la presión del fluido por encima de la presión
crítica. 4. Intercambiador de calor se calienta el fluido comprimido hasta una
temperatura por encima de la crítica, alcanzándose las condiciones
necesarias para la extracción. 5. Cámara extractora el fluido supercrítico
pasa a través de la materia prima disolviendo y arrastrando las componentes
de interés. 6. Válvula el fluido disminuye su presión por debajo de su presión
crítica. 7. Intercambiador de calor el fluido expandido se enfría por debajo de
su temperatura crítica, de manera tal que pierde sus propiedades como
solvente y los componentes extraídos pueden separarse fácilmente. 8.
Separador se extrae el gas por la parte superior, y el extracto por la parte
inferior (Reglero, Señoráns y Ibañez, 2005).

23
Figura 5. Esquema de un extractor de fluidos supercríticos
Fuente: Reglero, Señoráns y Ibañez (2005).

2.3 ANTECEDENTES DE EXTRACCIÓN POR FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Los productos de origen biológico, tales como conservadores naturales de alimentos o


ingredientes funcionales, son algunas veces termolábiles y fácilmente oxidables;
consecuentemente, ellos requieren procesos a bajas temperaturas y si es posible,
atmósferas libres de oxígeno, el CO2 no es oxidante y tiene temperatura crítica de

31,1 °C lo cual hace conveniente para la extracción de esos productos (Reglero,


Señoráns y Ibañez., 2005).

Nascimento et al., (2009) evaluaron dos procesos de extracción mediante fluidos


supercríticos y la extracción con disolventes orgánicos para carotenoides (β-caroteno).
Se compararon los resultados obtenidos por ambos métodos y se observó que los
resultados obtenidos por fluidos supercríticos eran similares que los obtenidos con

24
disolventes orgánicos, llegaron a la conclusión de que la extracción de carotenoides a
partir de zanahoria con fluidos supercríticos es una técnica de separación viable porque
este fluido es inerte y no deja ningún residuo final no genera residuos al medio
ambiente.
Sun y Temelli (2002) estudiaron la extracción de carotenoides de zanahorias secas
Daucus carota L. con CO2 - supercrítico, empleando temperaturas de 40, 55, 70 °C y
presiones de 276, 413 y 551 bar, los principales carotenoides en el extracto de aceite
de zanahoria cruda fueron α-caroteno, β-caroteno y luteína. Comprobaron que el
rendimiento de la extracción de carotenoides totales aumentaron trabajando a
condiciones de a 55 °C y a 276 bar, obteniendo (738,9 µg/g). No hubo tendencia clara
para el cambio en el rendimiento de la luteína con la temperatura y presión.

La extracción supercrítica con CO2 tiene también inconvenientes. Por ejemplo (Daood
et al., 2002) han descrito dificultades de extracción de los diésteres de las xantofilas en
determinadas condiciones, así como el riesgo de isomerización de trans a cis de los
carotenoides.

La extracción supercrítica con CO2 también puede ser utilizada para extraer pigmentos
clorofílicos (Del Valle y Aguilera, 1999; Uquiche, Del Valle y Orriz, 2004). También
puede disminuirse la solubilidad de estos pigmentos a 45 °C y 36 MPa con un aumento
de humedad de los pelets. Además, esta solubilidad depende más de la presión (con
un aumento de rendimiento del 82 % desde 22 a 50 MPa) que de la temperatura (con
un aumento máximo de rendimiento del 29 % de 35 a 45 – 65 °C)

La solubilidad del β- caroteno en dióxido de carbono supercrítico ha sido ampliamente


determinada con diferentes métodos experimentales en la Tabla 6. se muestran el
resumen de la solubilidad del β- caroteno a diferentes condiciones de temperatura y
presión, así como la incertidumbre para cada variable. Debido a la degradación del β-
caroteno por temperatura, exposición a la luz y auto-oxidación, es posible tener
desviaciones en los resultados de solubilidad con respecto a la literatura.

25
Tabla 6. Solubilidad del β- caroteno con CO2 supercrítico
Temperatura Presión Solubilidad
Autor (K) (Mpa) (Y2 x 10-7 (mol/mol)
(313-343) ± (6,2-34,3) ± (0,01-23,03) ±
Hansen et al., (2001) 0,2 0,2 30%-50%a
(308-323) ± (9,9-29,8) ± (0,22-5,0) ±
Sakaki, (1992) 0,1 NR 10%a
(310-340) ± (9,7-26,0) ± (0,15-17,0) ±
Subra et al., (1997) NR 0,1-1,5 0,02-0,7
(313-333) ± (12,0-29,9) ± (0,02-6,27)
Mendes et al., (1999) NR NR ±5%-10%a
(313-343) ± (25,7-43,9) ± (0,09-25,4) ±
Cygnarowicz et al., (1990) NR NR NR

a: Incertidumbre portada como reproducibilidad


NR: Incertidumbre no reportada Fuente:
Elizalde (2008).

La extracción con fluidos supercríticos se ha empleado para la obtención de productos


de alto valor añadido a partir de subproductos procedentes de la industria alimentaria
como, la obtención de licopeno y otros carotenoides a partir de residuos de tomate
(Baysal, Ersus y Starmans, 2000). Los carotenoides son pigmentos termolábiles y
fotodegradables cuyas propiedades antioxidantes fueron investigadas por (Careri et
al., 2001) y lo que la extracción con CO2 ha sido ampliamente utilizada.

26
Tabla 7. Extracción de carotenos con CO2 supercrítico

Alimento Proceso Condiciones de proceso Efectos/Resultado


Zanahoria (pulpa Extracción Muestra 6 g (diámetro medio de Los porcentajes de extracción más elevada (cercana al 100 bar %)
residual de carotenos partícula 0,93 mm) Extracción: se encuentran utilizando el 10 % de etanol y temperatura de 55 y
βcaroteno P: 207, 276 y 345 bar T: 40, 55 70 °C. La concentración de etanol y la temperatura son los dos
67±200ug/g y 70 °C cosolvente Etanol (5 y
pulpa) Barth et 10 %) factores más importantes para incrementar el grado de extracción.
al., Volumen total de CO2 250 L La variación de la presión no tiene consecuencias sobre el
(1995) Caudal CO2 ≈ 1.5 L/min Porcentaje de extracción.

Zanahoria Extracción Muestra 0,5 g Extracción P: Las condiciones óptimas se obtienen a 50 °C 342 bar y 10 % de
(deshidratada para de carotenos 342, 456 y 570 bar T: 30, 40 y etanol. En estas condiciones se obtienen una extracción de 605 µg/g
congelación 50 °C µL/min t:1 h de α- caroteno y 485 µg/g de β-caroteno sobre peso seco
) Vega et al.,
(1996)
Boniatos Spanos Extracción de
et al., (1993) βcaroteno Extracción
Pretratamientos
P: 138, 276 y 414 bar T: 38 °C y
48 °C Las muestras crudas presentan poca eficiencia de extracción a
causa de su alto contenido de humedad.
con 414 bar T: 38 °C y 48 °C
Caudal de CO2 14-18 min Entre las muestras deshidratadas presentan mayor rendimiento las
deshidratadas por congelación (228 ug/g muestra) que por horno de
Volumen de CO2: 200 L aire forzado (77 ug/g muestra) Un 50 % de los carotenoides se pierde
durante el secado en el horno a causa de reacciones oxidativas.

Fuente: Smith y Charter (2010)

27
2.4 LA ZANAHORIA

2.4.1 Descripción

La zanahoria científicamente llamada (Daucus carota) es una raíz vegetal,


típicamente anaranjado. Pertenece a la familia de las Umbelíferas, también
denominas Apiaceas (Díaz, 2008).

Es una hortaliza de gran importancia alimenticia, aunque manifiesta notables


diferencias de composición entre las distintas variedades y ejerce notable
influencia la temperatura, la humedad y la naturaleza del suelo, no solo sobre el
valor alimenticio, sino también sobre la forma en la relación entre corteza y
corazón (Vasco, 2008).

Figura 6. Raíz de la zanahoria (Daucus carota)


Fuente: Sierra Exportadora (2010)

2.4.2 Clasificación Taxonomíca

Morales (1995) reporta la siguiente clasificación taxonómica:

Reino: Vegetal
Clase: Angiospermae
Subclase: Dicotyledoneae Orden:
Umbelliflorae

Familia: Umbelliferae
Género: Daucus
29
Especie: Carota L.
2.4.3 Propiedades

Su característico color naranja se debe a la presencia de carotenos entre ellos el


beta caroteno o provitamina A pigmento natural que el organismo transforma en
vitamina A, así mismo es fuente de vitamina E y vitaminas del grupo B. En cuanto
a los minerales destaca el aporte de potasio y cantidades discretas de fosforo,
magnesio, yodo y calcio (sierra exportadora, 2010). La parte comestible de una
zanahoria es anaranjada, este vegetal es muy rico en caroteno, eficaz
antioxidante con propiedades anticancerígenas. (Díaz, 2008).

2.4.4 Aporte vitamínico

La zanahoria es la hortaliza más rica en pro vitamina A, además contiene


notablemente cantidades de vitaminas C, B1, B2, B5 y poseen β-caroteno un
compuesto que el hígado transforma en vitamina A, una molécula de caroteno da
lugar a dos moléculas de vitamina A clave como antioxidante que ayuda
aumentar la resistencia del organismo a las enfermedades. (Díaz, 2008 y
Romero, 2007).

La característica de la zanahoria es su elevado contenido de caroteno. 100 g de


zanahoria contiene de 1,8 a 7,2 miligramos de caroteno. La cocción, la exposición
de vapor de agua y el sistema de conservación influye prácticamente en el
contenido de caroteno y vitamina A (Romero, 2007).

2.4.5 Los carotenos y el color de las zanahorias

La cantidad de carotenos en vegetales es muy variable dependiendo del material


genético o cultivar, forma de cultivo, de la temperatura y contenido de agua en el
suelo, estado de madurez en el momento de cosecha, momento de consumo, así
como de las condiciones de almacenamiento y forma de preparación (Southon y
Faulks, 2003). Los principales carotenoides en zanahorias de color anaranjado
son β-caroteno, α-caroteno y luteína siendo los dos primeros los dominantes en
una relación promedio de 2:1 respectivamente. Las zanahorias anaranjadas
tienen un 45 % a 80 % de β-caroteno acompañado de α-caroteno. Los dos
constituyentes un 95 % de los carotenoides. (Baranska, Baraski, Schulz y
Nothnagel, 2006). (Southon y Faulks, 2003) citan en zanahoria cruda rangos de

30
1,1 a 64,0 mg/100g fresco de β-caroteno 0,53 a 36,0 mg/100g fresco de
αcaroteno y 0,27 mg /100g fresco de luteína

En la Tabla 8. se puede observar el contenido de α y β carotenos cuantificados en


trabajos de investigación para diferentes cultivares.

Tabla 8. Contenido total de α-caroteno y β-caroteno (mg/100g fresco) en


diferentes cultivares de zanahorias anaranjadas crudas

Cultivar α-caroteno β-caroteno Referencias


B6274 3,2 5,2 Simon y Wolf (1987)
B9692 6,6 11,7 Simon y Wolf (1987)
HCM 20,6 25,1 Simon y Wolf (1987)
Cellobunch 3,3 a 3,9 8,9 a 12,5 Warman y Havard (1987)
Beta 3 (SM-
III) 0,98 1,76 Almeida- Muradian et al (1997)
Brasilia (ADB) 1,69 2,79 Almeida- Muradian et al (1997)
Nantes 1,7 3,3 godoy y Rodriguez- Amaya (1998)
Sd 11,6 Niuzu y Rodriguez Amaya (2005)
Sd 5,2 13,0 O Neill et al (2001)
Nantes 3,5 6,5 Niuzu y Rodriguez Amaya (2005)
Mokum 6,3 Niuzu y Rodriguez Amaya (2005)
New Kuroda 3,6 Nicole et al (2004)
Nantes 9,6 Olives Barba et al (2006)
Fuente: Zaccari (2010)

III. MATERIALES Y MÉTODOS

31
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN

• Laboratorio de investigación de química de alimentos de la Facultad de


Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro
del Perú. Huancayo-Perú.

• Empresa de extracción de colorantes IMBAREX, S.A. Lurín- Lima Perú.

3.2. MATERIA PRIMA

Se trabajó con zanahoria (serranas) procedente de la provincia de Chupaca

• Unidad experimental: harina de zanahoria

3.3. MATERIALES Y EQUIPOS

3.3.1. Equipos

• Sistema de extracción por fluidos supercríticos SFE (TH22-24x2 Supercritical


CO2 Extraction Device)

• Equipo de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) Shimadzu calibrado


a un longitud de onda de 450 nm.

• Rotavapor R – 200/205 Buchi (Temperatura : 20-100 ±1 °C/100 – 180 ± 2 °C;


capacidad máxima del matraz: 500 mL)

• Balanza analítica Adventurer OHAUS AR 130 (capacidad 410 g; legibilidad:


0,001 g; linealidad: ± 0,002 g)

• Secador de bandejas tipo cabina


• Estufa esterilizadora EDS – 32 SOLFARMA (Temperatura: 20 – 220 °C)
• Tamizador Sieve US Estandar Tyler
• Bomba de vacío de doble pistón
• Centrifuga refrigerada Eppendorf-Centrifuge 5430R
• Vortex Maxi Mix Ii- Thermo Scientific
• Congeladora ULTRA FRIO UF 19 (temperatura: -25 a -40 °C
• Columna para carotenoides: Pinacle C 18 (150 x 9 mm, 5 um) detector de UV-
Vis.
3.3.2. Materiales

32
• Fiolas volumétricas
• Balón de destilación de 250 a 500 mL
• Matraces erlenmeyer
• Cápsulas de porcelana
• Matraces Kitazato 250 a 500 mL
• Micro pipetas de 50-100 µL y de 100 - 1000 µL
• Paletas y utensilios de plástico
• Papel filtro Watman # 4
• Pipetas graduadas 1, 2, 5, y 10 mL
• Pinzas metálicas
• Pizeta
• Probetas graduadas de 10, 50, 100, 250 mL
• Placas petri
• Termómetro (-10 °C – 100 °C)
• Vasos de precipitación 10, 50, 100, 250, 600, 1000 mL
• Viales para HPLC
• Jeringas de plástico de 3 mL
• Acrodisco de 0,45 µm
• Tips para 50 - 100 µL y de 100 - 1000 µL.

3.3.3. Reactivos

• Etanol p.a
• Hexano p.a
• Patrón de carotenoides (α caroteno, β-caroteno, luteína)
• Dióxido de carbono al 99,995% de pureza
• Diclorometano grado HPLC
• Metanol grado HPLC
• Acetonitrilo grado HPLC
• Acetato de etilo grado HPLC
• Agua de grado HPLC
• BHT (Hidroxitolueno Butilado).
• Agua destilada
• Tetrahidrofurano Metanol p.a.

• Carbonato de magnesio.
33
3.4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.4.1. Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por CO2 supercríticos

3.4.1.1. Acondicionamiento de la zanahoria

Se diseñó un diagrama de flujo Figura 7 para el acondicionamiento de


la zanahoria seca.

Zanahoria

Lavado

Desinfectado 5 mL de lejía en 10 L de agua

En rodajas de 5 mm de espesor
Cortado

Secado 40 ºC hasta que alcancen una


humedad entre 10 - 12 % ± 2

Molienda y Tamizado Tamaño de la partícula: Ø ≤ 0,250 mm

Figura 7. Diagrama de flujo para el acondicionamiento de la


zanahoria seca

3.4.1.2. Descripción del flujo de procesamiento

34
a. Se trabajó con zanahorias procedentes de la provincia de Chupaca.

b. Las zanahorias (Daucus carota) se lavaron y desinfectaron (5 mL de


lejía en 10 L de agua) y se dejó orear por unos minutos.

c. Cortado, el corte de la zanahoria se realizó con un cuchillo de acero


inoxidable en rodajas de 5 mm de espesor.

d. Secado, estos fueron secados por convección de aire caliente a 40


°C por un tiempo de 8 horas, para el control de la humedad, se colocó
una muestra de 3 g y se realizó controles de peso cada hora hasta
alcanzar una humedad final de 10 - 12 % ± 2.

e. Molienda, se realizó una molienda fina con un molino de martillos


para obtener la muestra al tamaño de partícula deseada.

f. Se utilizó un tamizador eléctrico Sieve Shaker US Estandar Tyler,


con diferentes tamaños de malla, obteniendo el tamaño de partícula
deseada (Ø ≤ 0,250 mm).

3.4.1.3. Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por el método


convencional (tetrahidrofurano - metanol)

35
Se utilizó el método (Widman, 2004) modificado de acuerdo a las
condiciones de la materia prima. En la figura 8. se muestra el
diagrama de flujo del proceso de extracción, este procedimiento se
realizó con propósitos comparativos.

Extracción
Metanol /Tetrahidrofurano (50:50)
convencional

2 g de muestra con 10 % (w/w) de


carbonato de magnesio y
Homogenizar metanol/tetrahidrofurano

Centrifugar Por 10 min a 7319 rpm y 4°C

A vacío a través de papel wathman


Filtrar N°42

Con metanol donde el tetrahidrofuano


Diluir represente < 10 %

Cuantificación de
Los carotenoides fueron monitoreados
carotenoides con usando un detector UV-VIS a 450 nm

HPLC

Figura 8. Diagrama de flujo, de la extracción de carotenoides por


el método convencional (metanol – tetrahidrofurano)

3.4.1.4 Descripción de la extracción convencional (tetrahidrofurano y


Metanol) de carotenoides de zanahoria.

36
Para la extracción directa de muestras de alimentos que no contienen
ésteres de xantofilas, clorofila o tienen bajo contenido de grasa y alto
contenido de carotenoides (zanahoria), se utilizó este método.

a. Homogenizar, de la harina ya deshidratada de la zanahoria se


peso 2 g de muestra con 10 % (w/w) de carbonato de magnesio
se usa para mantener el pH y 10 mL de 50:50 de metanol/THF
(tetrahidrofurano).

b. Centrifugar, se realizó durante 10 minutos a 7 319 rpm y a 4 °C


y se separó el sobrenadante, se repitió el procedimiento hasta
que el disolvente de extracción sea incoloro.

c. Filtrar, se combinó los extractos y se filtró a vacío a través de


papel wathman N°42 para eliminar las partículas.

d. Diluir, para este proceso se diluyo con metanol de modo que el


tetrahidrofurano represente < 10 % de la solución total,

e. Cuantificación, se filtró la dilución obtenida (usando el filtro


acrodisco para jeringa con membrana de 0,45 µm), el producto
filtrado se usó para el análisis por HPLC.

3.4.1.5 Diagrama de flujo, del proceso de extracción de carotenoides con


CO2-Supercrítico.

37
Se utilizó el método (Nascimento et al., 2009), modificado de acuerdo
a las condiciones de la materia prima. En la figura 9. Se muestra el
diagrama de flujo del proceso de extracción.

Extractor: TH22-24X2 SUPERCRITICAL


CO2 EXTRACTION DIVICE
Presión: 200 y 280 bar
Extracción Temperatura: 40, 50 y 60 ºC
CO2- supercrítico Tiempo: 150 min
Flujo de CO2: 5 g/min
Muestra: 1 kg

Despresurización a 12 bar y 40 ºC
Separación

Temperatura = 40 °C
Evaporación Presión = 0,67 bar

Almacenamiento Temperatura: - 40 °C

Cuantificación de Los carotenoides fueron monitoreados


usando un detector UV-VIS a 450 nm
carotenoides con HPLC

Figura 9: Diagrama de flujo para la extracción con


CO2 - supercrítico de carotenoides de la zanahoria
(Daucus carota)

3.4.1.6 Descripción del protocolo para la cuantificación de carotenoides


por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

38
 Preparación de las muestras para la cuantificación de
carotenoides por HPLC

Se usó el método de Sun y Temelli (2002), con algunas


modificaciones de la siguiente forma: se tomó 50 µL del extracto
de zanahoria en un frasco color ambar y se disolvió en 1,950 µL
de metanol/diclorometano (1:1, v/v), antes de la inyección de la
muestra se filtró con un acrodisco para jeringa con membrana de
0,45 µm.

 Cuantificación de carotenoides totales por HPLC ( método


Rodrigez – Amaya, 2001)

El contenido de carotenoides se determinó con el método de


cromatografías líquida de alta resolución (HPLC) el fundamento
del método, consiste en establecer un equilibrio entre una fase
estacionaria y una fase móvil, es una técnica que permite
separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla. La
muestra es distribuida entre dos fases, una estacionaria y otra
móvil, de tal forma que cada uno de los componentes de la
mezcla es selectivamente retenido por la fase estacionaria.

(McNair y Esquivel, 1973). (Hernández, 2005).

La muestra es inyectada en el seno de la fase móvil, donde es


soluble, y es transportada a través de una columna por el flujo
continuo de fase móvil a alta presión. La fase estacionaria está
formada por partículas de pequeño diámetro, por tanto, con una
gran superficie de interacción, contenidas en la columna. Este
proceso cinético es conocido con el nombre de elución. La
velocidad a la que un analito se mueve a través de la columna,
con respecto a los demás presentes en la mezcla, está
determinada por el tiempo que permanece en la fase móvil
(McNair y Esquivel, 1973 y Hernández, 2005). Las propiedades
más importantes a considerar en la selección de la fase móvil son
la polaridad, la viscosidad, volatilidad y toxicidad.

(Rodriguez- Amaya y Kimura, 2004).

39
Para la identificación de carotenoides se utilizó un equipo de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) SHIMADZU, con
detector de arreglo de diodos.

Los análisis fueron desarrollados usando, una columna C18, con


partículas de 5 µm de diámetro, 150 mm de longitud y diámetro
interno de 4.6 mm. Fase móvil: metanol 20 %, acetonitrilo 73 % y
acetato de etilo 7 %, se manejó la elución con un flujo de 1,5
mL/min en condiciones isocráticas, los carotenoides fueron
monitoreados usando un detector UV-VIS a 450 nm, se
inyectaron 20 µL de cada extracto en la columna de separación
para carotenoides a temperatura de 25 °C y el tiempo de análisis
para cada muestra fue de 30 min.

La cuantificación de carotenoides se hizo en base a las curvas


patrón correspondiente a los estándares de β-caroteno,
αcaroteno y luteína, los resultados de expresan como mg/100g
de muestra seca.

Los estándares se prepararon en concentraciones de β-caroteno


(25; 37,5; 50; 62,5 ppm), α-caroteno (5; 12,5; 27; 37,5; 50 ppm)
y luteína (3; 10; 12; 33 ppm), solubilizados con
metanol/diclorometano (1:1, v/v).

3.4.2 Diseño experimental

40
PARTICULAS SECAS DE
ZANAHORIA

P1 P2

T1 T2 T3 T1 T2 T3

Donde:
P1 = Presión de extracción por CO2 - supercrítico a 200 bar.
P2 =Presión de extracción por CO2 - supercrítico a 280 bar.
T1 = Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 40 °C.
T2 =Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 50 °C
T3 =Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 60 °C

3.4.2.1 Diseño estadístico

Para cuantificar la cantidad de extracto y concentración de carotenoides de


zanahoria se probaron dos variables operacionales como la presión (2 niveles)
y la temperatura (3 niveles) de extracción con CO2-supercrítico, donde se
utilizara un diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial 2x3 y un
análisis de varianza (ANOVA) con α = 5 % y prueba de comparación múltiple
según DUNCAN. Se aplicó 6 tratamientos con 2 repeticiones. Se realizó la
prueba de normalidad de Shapiro Wilk. Para el análisis estadístico se usó el
programa estadístico SAS v 9.2.

• FACTOR A: presión de extracción por CO2 supercrítico

P1=.200 bar.
41
P2=.280 bar.

• FACTOR B: temperatura de extracción por CO2

T1=40 °C.
T2=50 °C.
T2=60 °C.

3.4.3.1. Modelo estadístico

Yijk = u + Pi + Tj + (PT) ij + ε

Donde:

Yijk = Cantidad de extracto y concentración de carotenoides. u


= Media general

Pi = Efecto de la presión de extracción por CO2, i = 1,2.


Tj = Efecto de la temperatura de extracción por CO2, j = 1,2,3.
(PT) ij = Efecto de la interacción de Pi y Tj Ε
= Error aleatorio.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1 PROCESO DE EXTRACCIÓN CON CO2-SUPERCRÍTICO DE ZANAHORIA

4.1.1 Acondicionamiento de la materia prima


42
En la tabla 9, se observa las características de la zanahoria seca antes del
proceso de extracción con CO2-supercrítico. La humedad, tamaño de partícula
son parámetros que determinan un mayor o menor rendimiento de obtención del
extracto (Flores, Rodriguez, Romero y Barradas, 2012).

Tabla 9. Característica de la materia prima acondicionada


para la extracción con CO2-Supercrítico,

Características Zanahoria
Humedad de equilibrio (%) 8±0,04
Humedad de trabajo (%) 10±0,09
Diámetro de la partícula (mm) 0,250 <Ø<1

Para llegar a la humedad de trabajo, la temperatura de secado fue de 40 °C por


8 a 10 h, (Uurrea, Eim, Rosello y Simal, 2012) un su trabajo de investigación
seco zanahoria sometiendo desde 40 hasta 90 °C, analizando el efecto de la
temperatura de secado en la degradación de carotenoides totales en (mg/gss)
obteniendo resultados aceptables que el secado a 40 °C, la pérdida de
carotenoides fue de 17,3 %, los carotenoides son relativamente estables
cuando el secado trascurre a temperaturas bajas (40-60°C) pero muy sensibles
a temperaturas más altas (Belén, Moreno, Aleman y Alvarez, 2004). La
humedad de trabajo fue de 9 – 11 % ± 2, Nagy y Simandi (2008) mencionan que
el contenido de humedad entre el 7 y el 18 % tiene un efecto insignificante sobre
la capacidad de extracción, sin embargo, por encima de 18 % la presencia de
agua afecta la extracción de compuestos naturales, mediante el aumento del
contenido de humedad disminuye la eficiencia. En consecuencia la zanahoria
tuvo una humedad adecuada para la extracción supercrítica.

El tamaño de partícula para la muestra fue de 0,250 <Ø<1mm, Ahluwalia,


Shivhare y Basu (2013) mencionan que el rendimiento de extracción aumenta
con la disminución del tamaño del partícula. Este fenómeno es apoyado por la
teoría de la difusión de solutos en partículas, cuanto mayor sea la distancia de
que un soluto tenga que viajar desde el interior de la partícula a la superficie la
extracción es más lenta, a su vez la mayor superficie de contacto disponible se
da cuando la partícula es más pequeña y la cantidad de carotenoides extraídos
será mayor (Sun y Temelli, 2006). Se retira fácilmente de muestras molidas con
tamaño de partícula característico entre 0,1 y 0,7 mm (Nagi y Simandi, 2008).
43
Las muestras molidas a partir de laminados, luego peletizados y acondicionados
a baja humedad tienen un rendimiento mayor que aquellas no molidas
previamente, ello se debe a que la extracción de fracciones de interés aumenta
con una mejor distribución y conectividad de los poros (Fernández, 2008).

Tabla 10. Cantidad de extracto de zanahoria obtenida por


extracción convencional

Extracción Extracto total Extracto


Convencional (g) g /100 g ms

Tetrahidrofurano/metanol 0,046 2,3 ±0,04

En la tabla 10, se muestra la cantidad de extracto y el rendimiento obtenido por


la extracción convencional de la muestra de zanahoria. El resultado obtenido
por el método convencional se aproximan a lo obtenido en su trabajo de
investigación de (Sun y Temelli, 2006) que reporta 2,46 g/100g de zanahoria
seca en la extracción con hexano/acetona (6: 4, v / v). Los carotenos son
hidrofóbicos, lipofílicos y son virtualmente insolubles en agua. Se disuelven en
solventes orgánicos como acetona, alcohol, éter etílico, tetrahifdrofurano y
cloroformo (Rodríguez- Amaya, 1999).

Tabla 11. Cantidad de extracto de zanahoria obtenida a diferentes


condiciones temperatura y presión CO2-Supercritico.

Presión Temperatura Tiempo Extracto


Tratamiento (Bar) (°C) (h) g /100g ms
T1 200 40 2,5 0,88 ±0,03
T2 280 40 2,5 2,09 ±0,72
T3 200 50 2,5 1,06 ±0,39
44
T4 280 50 2,5 1,28 ±0,22
T5 200 60 2,5 0,94 ±0,13
T6 280 60 2,5 0,84 ±0,06

El rendimiento de extracto de zanahoria que se extrajo con CO 2-supercritico


bajo diferentes combinaciones de temperatura y presión se presenta en la
(Tabla 11) el mayor rendimiento se obtuvo en el T2 (280 bar, 40 °C), sin embargo
una variación de temperaturas de (40 a 60 °C) provocó una disminución en el
rendimiento del extracto durante la extracción supercrítica. La solubilidad de
extracción de fluido supercrítico y la selectividad dependen en gran medida del
equilibrio entre la densidad del fluido y la presión de vapor del soluto que se ve
afectado por la presión y temperatura (Durante, Salvatore y Mita, 2014 y
Velasco, Villada y Carrera, 2007)

En la tabla 11, se observa que el T2 fue superado en 1,1 veces en la obtención


del extracto de zanahoria frente a la extracción con (tetrahidrofurano/metanol).
El rendimiento obtenido con la extracción CO2- supercrítica se encuentra dentro
de los rangos reportados por Flores, Rodriguez, Romero y Barradas (2012) que
obtuvieron 2,53 g/100 g de aceite de zanahoria con CO2-supercrítico a 40 °C y
276 bar. Sun y Temelli (2006), lograron solubilizar y extraer 1,83 a 2,69 g/100 g
de zanahoria seca en la extracción con CO2-supercritico.

4.1.2 Determinación por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) de carotenoides


extraídos por el método convencional.

Se realizó una extracción convencional a fin de comparar el contenido de carotenoides


totales y sus fracciones con el método de extracción en estudio, esta

45
extracción se realizó con tetrahidrofurano y metanol (1:1)

Figuras 10. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


por el método convencional (Tetrahidrofurano/metanol 1:1). 1) α-
caroteno, 2) β-caroteno.

En la figura 10. se puede observar dos picos cromatográficos bien definidos que al ser
comparados con el cromatograma del patrón de carotenoides, espectros y tiempos de
retención, se puede asegurar la presencia de dos carotenoides siendo el pico
cromatográfico (1) α-caroteno y (2) β-caroteno. La luteína no fue identificada eso nos
señala que no fue extraída por el método convencional (tetrahidrofurano/ metanol) a
diferencia que con la extracción con CO2- supercrítica si se logra solubilizar y extraer
la luteína. Velasco, Villada y Carrera (2007) señalan que la selectividad durante la
extracción puede ser manipulada dada la variación de las diferentes condiciones de
operación temperatura y presión afectando la solubilidad de varios componentes en el
fluido supercrítico. Los carotenoides son pigmentos estables en el ambiente natural,
pero cuando los alimentos se calientan o cuando son extraídos en disoluciones,
aceites o en disolventes orgánicos se vuelven mucho más lábiles (Rodríguez- Amaya,
1999 y Hernández, Candelas, Meza y Minjares, 2010).
4.1.3 Determinación por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) de carotenoides
de zanahoria.

En la Figura 11, se observa los perfiles cromatográficos de los estándares de

46
carotenoides.

Figuras 11 . Perfil cromatográfico de los carotenoides estándar (50 ppm) . 1)


Luteína, 2) α-caroteno, 3) β-caroteno.

0
T1

Figuras 12. T1 (presión: 200 bar y temperatura de 40 °C) Perfil cromatográfico de


los carotenoides de zanahoria extraídos con CO2 – supercrítico

Figura 12. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2 – supercrítico a condiciones de: presión 200 bar y
temperatura de 40 °C.

47
T2

Figura 13. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2 – supercrítico a condiciones de presión 280 bar y
temperatura de 40 °C

48
T3

Figura 14. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2 – supercrítico a condiciones de: presión 200 bar y
temperatura 50 °C.
T4

Figura 15. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2 – supercrítico a condiciones de: presión 280 bar y
temperatura 50 °C.

49
T5

Figura 16. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2 – supercrítico a condiciones de: presión 200 bar y
temperatura 60 °C.
T6

Figura 17. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos


con CO2 – supercrítico a condiciones de: presión 280 bar y
temperatura 60 °C.

En la Figura 11, se muestra los perfiles cromatográficos de los estándares de


carotenoides los cuales permitió identificar los tiempos de retención de cada pico
50
cromatográfico que corresponde luteína (1), α- caroteno (2) y β-caroteno (3). Asi
mismo haciendo uso de las áreas de estos estándares se cuantifico la concentración
de los carotenoides de los extractos de zanahoria; además los espectros de estos
estándares fueron comparados con los carotenoides de la zanahoria.

En las figuras 12, 13, 14, 15, 16 y 17, se muestra los cromatogramas de los seis
tratamientos aplicados para la extracción de carotenoides de zanahoria. Al comparar
los perfiles cromatográficos de los carotenoides de zanahoria, con el estándar
(Figura 11), se observa la presencia de tres picos plenamente identificados de la
siguiente manera; Luteína (1), α- caroteno (2) y β-caroteno (3) y comparando los
tiempos de retención y espectros se puede asegurar la presencia de estos tres
carotenoides mayoritarios en la zanahoria del valle del Mantaro. Los picos
cromatograficos 2 y 3 indican que son los carotenoides de mayor concentración
presentes en la zanahoria, donde β-caroteno 50,88 %, α- caroteno 36,86 % y la
luteína se encuentra en menor proporción de 1,16 %. También aparecen trazas de
otros carotenoides como el ζ-caroteno en porcentaje de 0,1 al 1 %. Los tres picos
cromatográficos de mayor área son similares a los encontrados por (Alzate, 2013 y
Rodríguez-Amaya, 2001) quienes muestran cromatogramas con fracciones de
carotenoides de zanahoria con similares tiempo de retención y porcentaje de area.
La presencia de otros picos o crestas en el perfil cromatografico de la muestra se
debería a la solubilidad de carotenoides en las condiciones de extracción y
cuantificación.

Los cromatogramas reflejan la calidad de extracción con CO2-supercrítico las cuales


no presentan interferencias. (Nascimento et al., 2009) señala que la extracción de
carotenoides por fluidos supercríticos es una técnica de separación viable para la
industria de alimentos y farmacéutica, ya que este fluido es inerte, no deja ningún
residuo final y no genera residuos medioambientales.

Los cromatogramas de carotenoides en el extracto de zanahoria que se obtuvo


respaldan la integridad estructural de los pigmentos al compararse con el
cromatograma patrón, por medio de los tiempos de retención y espectros han sido
identificados.

51
4.1.4 Espectros de los estándares de luteína, α-caroteno y β-caroteno

En la figura 14. se observa la imagen espectral de los estándares de carotenoides

52
de luteína, α-caroteno y β-caroteno.

(a)

(b)

(c)

53
Figura 18.
Espectros
de los

estándares de carotenoides (a) α-caroteno, (b) βcaroteno y (c) luteína


4.1.5 Espectros de carotenoides de zanahoria α-caroteno, β-caroteno y luteína
extraídos por CO2-superritico

Figura 19. Espectros de los carotenoides de zanahoria

Los espectros de absorción de los carotenoides obtenidos del análisis por


cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) del extracto de zanahoria se
muestran en la (Figura 19), donde se observa tres espectros de absorción con una
longitud de onda máxima y dos hombros ubicadas a cada lado respectivamente que
comparadas con los espectros de absorción de los estándares de β-caroteno,
αcaroteno y luteína (Figura 18), se observa que tienen características similares, los
cuales nos asegura la presencia de estos tres compuestos en la zanahoria, extraida
54
con CO2-supercrítica. Esta raíz se caracteriza por su contenido en α-caroteno,
βcaroteno, ζ-caroteno, γ-caroteno, ξ-caroteno, σ-caroteno y luteína (Hurts,
2007). El sistema de doble enlace conjugado constituye el cromóforo de absorción
de luz que da a los carotenoides su color atractivo y proporciona el espectro de
absorción visible que sirve como base para su identificación y cuantificación
(RodriguezAmaya, 2001). Para un carotenoide específico, las posiciones de las
bandas de máxima absorción están en función del número de dobles enlaces
conjugados presentes en la molécula (Burgos y Calderón, 2009). La mayoría de los
carotenoides absorben máximo a tres longitudes de onda, lo que resulta en los
espectros de tres picos (Burgos y Calderón, 2009 y Rodriguez-Amaya, 2001).

Tabla 12. Características espectrales de los carotenoides.

Estándar Zanahoria
Carotenoides Picos de absorción Picos de absorción α-
caroteno 423 446 474 424 447 475 β-caroteno 426 451 479
427 452 479 luteína 423 446 474 423 446 474

En la tabla 12, se muestra las longitudes de onda máximas que corresponden a los
tres picos o bandas características, obtenidas del estándar y del extracto de
zanahoria. Los valores de longitud de onda máxima en los tres espectros de
absorción del estándar y zanahoria se encuentran dentro de un rango de 423 nm479
nm. El α-caroteno absorbe una longitud de onda máxima de 447 nm, el βcaroteno
es el carotenoide más característico encontrado en la zanahoria absorbe una
longitud de onda máxima de 452 nm, y la luteína absorbe una longitud de onda de
446 nm, las longitudes de onda obtenidas resultan ser muy similares a las reportadas
por (Rodriguez-Amaya, 2001). El espectro en la región visible de los carotenoides
es bastante característico en la longitud de onda comprendida entre 400 y 500 nm
por lo cual suelen ser sustancias coloreadas (Burgos y Calderón, 2009). El bicíclico
β-caroteno, aunque poseen el mismo número de dobles enlaces conjugados como
el licopeno, es de color naranja amarillo y λmax a 450 y 477 nm y una inflexión
(hombro) a 425 nm, el doble enlace en el anillo ε de α-caroteno es de conjugación,
dejando 10 dobles enlaces conjugados (9 en la cadena de polieno y 1 en el β anillo);
por lo tanto, este carotenoide es amarillo claro y su espectro de absorción es más

55
definido con λmax a longitudes de onda ligeramente más cortas (422, 445 y 473 nm)
que los de β-caroteno (Rodriguez-Amaya, 2001).

56
Tabla 13. Tiempos de retención, área y % de área de carotenoides estándar y obtenidos por extracción con CO 2 –supercrítico y
convencional en la zanahoria
Zanahoria
CO2- Zanahoria
Estándar (50 ppm ) supercritica Convencional
Tiempo
Tiempo de Tiempo de de
Retención Área %de Retención Área %de Retención Área %de
Carotenoides (min) (mAU2) Área (min) (mAU2) Área (min) (mAU2) Área

alfa-caroteno
17,08-17,19 2382157 34,58 17,62 5723881 36,86 21,53 205067 28,62
beta-caroteno 19,07-19,50 3830787 55,61 19,15 7776121 50,88 23,47 439769 61,38

luteina 1,79-1,85 231560 3,36 1,81 180250 1,16

Donde: mUA2 = Unidades de área al cuadrad

En la Tabla 13, se observa, el tiempo de retención, el área y el % de área de los picos de los cromatogramas, se observa claramente la
presencia mayoritaria de β-caroteno y α- caroteno y en menor cantidad la luteína en la zanahoria extraído por CO2-supercrítica, también se
observa que el área obtenida por la extracción convencional (tetrahidrofurano/metanol) es menor tanto para el β-caroteno y α- caroteno y no
hay presencia de la luteína.

54
Tabla 14. Fracciones de carotenoides por extracción con CO2-supercrítico presentes en el extracto de zanahoria

Carotenoides
Presión Temperatura Tiempo α-caroteno β-caroteno Luteína (mg/100g Totales
Tratamiento (Bar) (°C) (h) (mg/100g ms) (mg/100g ms) ms) (mg/100g ms)

T1 200 40 2,5 5,99±1,76 14,60±0,01 0,51±0,02 21,10±1,74


T2 280 40 2,5 7,58±0,49 32,38±5,79 0,61±1,00 40,57±5,28
T3 200 50 2,5 11,64±0,30 62,87±6,80 0,64±0,30 75,15±6,20
T4 280 50 2,5 12,27±1,80 71,34±1,67 0,89±0,55 84,50±3,42
T5 200 60 2,5 6,14±1,41 42,28±10,89 0,47±0,004 48,89±12,3
T6 280 60 2,5 4,20±0,66 22,80±2,44 0,47±0,08 27,47±3,19

55
Las fracciones de α-caroteno, β- caroteno, luteína y carotenoides totales obtenidos en
la extracción con CO2 -Supercrítico bajo diferentes combinaciones de temperatura y
presión se muestran en la Tabla 14, para α-caroteno fue de 4,20 a 12,27 mg/100g ms,
β-caroteno de 14,60 a 71,34 mg/100g ms, luteína 0,51 a 0,89 mg/100g ms y
carotenoides totales fue 21,10 a 84,50 mg/100g ms.

La solubilidad de α-caroteno, β-caroteno y carotenoides totales, aumentaron al


incrementar la presión de 200 a 280 bar a una temperatura de 40 °C, lo mismo sucede
a 50 °C cuando se varía la presión de 200 a 280 bar. La solubilidad de extracción con
CO2-supercritico y la selectividad dependen en gran medida del equilibrio entre la
densidad del fluido y la presión de vapor del soluto que se ve afectado por la
temperatura y presión (Durante et al., 2014). Sin embargo los rendimientos de
extracción de α-caroteno, β- caroteno y carotenoides totales mostraron una caída con
un aumento de temperatura de 50 °C a 60 °C manteniendo la presión a 280 bar.
Generalmente a presión constante, el aumento de temperatura reduce la densidad del

CO2-supercritico reduciendo así su poder de solvatación (Durante et al., 2014)

59
La mayor cantidad de carotenoides totales se obtuvo en el T4 (280 bar y 50 °C) seguido
del T3 (200 bar y 50 °C) siendo los tratamientos donde al aumentar la presión de 200 a
280 bar y manteniendo la temperatura de 50 °C se observa un incremento en el
rendimiento de α-caroteno, β-caroteno y carotenoides totales como se puede apreciar
en la tabla 16 y Figura 20, a temperatura constante con el aumento de la presión la
densidad del fluido supercrítico se incrementa y por consiguiente la solubilidad del
analíto en el fluido supercrítico aumenta (Velasco, Villada y Carrera, 2007 y Durante,
Salvatore y Mita, 2014). Sun y Temelli (2002) en su trabajo de investigación reportaron
que a 55 °C y 276 bar de presión obtuvieron 73,89 mg de carotenoides totales /100 g
ms. Nacimiento et al., (2009) en la extracción de carotenoides de zanahorias liofilizadas
con CO2-supercritico a 40 °C y 400 bar obtuvo 24,57 mg de β-caroteno/100 g ms.
Durante et al., (2014) en su trabajo de investigación utilizaron diferentes temperaturas
de 40 a 70 ° C y presiones de 25 a 35 MPa en la extracción con CO2supercritica de
carotenoides de calabaza, ellos encontraron que el rendimiento de carotenoides
aumentó con el aumento de presión y temperatura.

La cantidad de carotenos en vegetales es muy variable dependiendo del material


genético o cultivar, de la temperatura y contenido de agua en el suelo, estado de
madurez en el momento de la cosecha, momento de consumo, así como de las
condiciones de almacenamiento y formas de preparación (Southon y Faulks, 2003).

La inestabilidad de los carotenoides se debe al hecho de que son compuestos


altamente insaturados, degradándose fundamentalmente debido a procesos
oxidativos, otros factores como la temperatura, la luz o el pH, también puedes producir
cambios cualitativos en estos compuestos debido a reacciones de isomerización en su
estructura, los carotenoides están sujetos a cambios químicos inducidos por las
distintas condiciones de extracción y cuantificación, por ello es importante conocer que
factores intervienen en la degradación de estos compuestos (Minguez - Mosquera,
Hornero- Mendez y Perez - Galvez, 2002)

60
80.0
70.0
60.0
alfa-caroteno
50.0
beta-caroteno
40.0
Luteina
30.0
20.0
10.0
0.0
T1 T2 T3 T4 T5 T6

Figura 21. Fracciones de carotenoides extraídos por CO2-supercrítco de


zanahoria.

La solubilidad de los carotenoides en CO2 - supercrítico está determinado por la presión


y temperatura a 40 °C y presión de 200 bar son menores a causas de una solubilidad
limitada por la baja presión, al incrementar la presión a 280 bar y 50 °C se incrementa
el poder solvatante. En la (Figura 21), se observa que no hubo una tendencia clara para
el cambio en el rendimiento de la luteína con la temperatura y la presión. La solubilidad
del β-caroteno es mejorada con el incremento de la temperatura y presión, sin embargo
estos incrementos de temperatura pueden causar degradación por efecto de las altas
temperaturas exposición a la luz y autooxidación (Elizalde, 2008)

Los carotenoides son estables en su ambiente natural, pero se vuelven sensibles a la


luz y temperatura y se descomponen con facilidad después de la trituración y
extracción. La cadena polieno es responsable en gran, medida a la inestabilidad del
carotenoide, es decir, su susceptibilidad a la oxidación por el oxígeno o a los peróxidos
y la isomerización causada por el calor, la luz o productos químicos (Burgos y Calderón,
2009).

61
90

80

70

60

50

40 convencional
SC-CO2
30

20

10

0
α-caroteno β-caroteno luteina carotenoides
totales
(mg/100g ms)

Figura 22. Comparación del método convencional (tetrahidrofurano y


metanol) con CO2 - supercrítico en la extracción de
carotenoides de zanahoria.

La cantidad de carotenoides totales de la zanahoria obtenida con la extracción con


CO2-supercritíco frente a la extracción convencional fue mayor en 1,8 veces como
se observa en la (Figura 22), esto probablemente se debería a la presencia de
carotenoides no identificados que son solubles frente a ciertas condiciones o
sufren modificaciones en su estructura al ser aislados. Los solventes alternativos
producen a menudo menos recuperación debido a una afinidad molecular
disminuida entre el solvente y el soluto así como los costos de los solventes
alternativos pueden ser superiores (Li et al., 2004), la extracción con disolventes
tradicionales requieren múltiples pasos, mucho tiempo y consumen grandes
cantidades de disolvente orgánico (Barth et al., 1995). La extracción con solventes
orgánicos siempre dejan residuos inherentes en el biocomponente extraído. La
extracción con CO2- supercrítico resulta una alternativa interesante para la
extracción y fraccionamiento de carotenoides porque no es tóxico, no deja residuos
en los productos, así como la capacidad selectiva para extraer ciertas sustancias
al realizar pequeños cambios de presión y temperatura (Velasco et al., 2007).

62
Tabla 15. Análisis de varianza ANOVA de los carotenoides totales de los seis
tratamientos obtenidos con CO2 - SC en la zanahoria.

Fuente DF Anova SS Cuadrado F-valor Pr>F


de la media
P 1 18,3274 18,3274 0,45 0,5257NS
T 2 5583,9913 279,.9956 69,11 <.0001*
P*T 2 906,7588 453,3794 11,22 0,0094*
error 6 242,3839 40,3973
11 6751,4614
Dónde: P=presión; T=temperatura
NS: No hay diferencia significativa; * Existe diferencia significativa

Tabla 16. Medias de los carotenoides totales

nivel de nivel de
P T N Media
200 40 2 21,10
200 50 2 75,15
200 60 2 48,88
280 40 2 40,57
280 50 2 84,50
280 60 2 27,47

Se realizó la prueba de shapiro-wilk para verificar la distribución normal (ver


ANEXO III) donde el análisis estadístico para los carotenoides totales de zanahoria
refleja una diferencia significativa en la cantidad extraída a diferentes presiones y
temperaturas los cuales influyen en forma individual y cuando interactúan entre sí.

En la Tabla 15, se observa la interacción de cada nivel presión (P), temperatura


(T), y la interacción de estos parámetros (P*T), de acuerdo con el ANOVA factorial
se puede identificar que no existe diferencia significativa para el efecto de la
presión, sin embargo existe diferencias significativas en la variable dependiente
(carotenoides totales), con la temperatura (F: 69,11; p<.0001) y la interacción de
la presión de 280 bar y temperatura de 50°C ejercen un efecto significativo
(F: 11,22; p<0,05), así mismo el coeficiente de variabilidad (CV) es de 12,81 %,
de acuerdo con lo anterior se acepta la hipótesis de trabajo.
En la extracción de α-caroteno se reporta a través del análisis estadístico un R2 =
0,92 y un coeficiente de variabilidad de 15,45 % se identifica que existe diferencia
significativa para el efecto de la temperatura (p<0,05) durante la extracción

63
resumido en el (ANEXO VII). Realizado el test de Duncan con un nivel de
significancia de 0,05 se encontró que la diferencia es significativa para el efecto de
la temperatura, resultando mejor el trabajo a la temperatura de 50 °C.

Para el caso del β-caroteno de acuerdo con el análisis estadístico ANOVA se


reporta un R2 = 0,96 con un coeficiente de variabilidad de 14,38 % se identificó que
existe diferencias significativas para el efecto de temperatura (F:62,33; p<.0001) y
la interacción de presión - temperatura (F:10,44; p<0,05) ver el (ANEXO VIII).
Realizado el test de Duncan con un nivel de significancia de 0,05 se encontró que
la diferencia es significativa para la interacción, temperatura de 50 °C y presión de
280 bar.

En la extracción de la luteína, a través del análisis factorial ANOVA presento


diferencia significativa para el efecto de la temperatura (p<0,05), con un R2 = 0,72
esto indica que no hubo suficiente correlación entre la presión y temperatura y el
rendimiento de la luteína durante la extracción. (ANEXO IX). Realizado el test de
Duncan con un nivel de significancia de 0,05 se encontró que la diferencia es
significativa para el efecto de la temperatura, resultando mejor el tratamiento a 50
°C.

De acuerdo al análisis de la cantidad de α-caroteno, β-caroteno y luteína que se


lograron solubilizar son los responsables de la variación existente en la cantidad
de carotenoides totales, además las características propias de cada compuesto
conlleva a que exista una interacción particular propia de cada compuesto lo que
influye en su solubilidad al estar en contacto con el CO2-supercritico que por la
modificación de la presión y temperatura ocasionan estas diferencias en la
cantidad de carotenoides.

Tabla 17. Comparación de rangos múltiples por Duncan para carotenoides


totales con CO2-supercrítico en la zanahoria.

64
Agrupamiento Media N Tratamiento
A 84,50 2 4
A 75,15 2 3
B 48,88 2 5
B 40,57 2 2
C 27,47 2 6
C 21,10 2 1
*letras diferentes significa diferencia significativa

En la tabla 17, se observa que el efecto combinado de los niveles de presión y


temperatura en los diferentes tratamientos. Realizado el test de Duncan con un
nivel de significancia de 0,05 se observa no significancia entre T 4 y T3, no hay
diferencias significativas en el T5 y T2 y no significativas para el T6 y T1. De este
estudio podemos mencionar que el T4 (280 bar y 50°C) es el tratamiento frente a
los otros tratamientos analizados el que presento el valor más alto de carotenoides
totales, seguido del T3 (200 bar y 50°C) que presento también niveles altos de
carotenoides totales.

Tabla 18. Comparación de rangos múltiples por Duncan para las


temperaturas

Temperatura
Agrupamiento Media N (°C)
A 30,83 4 40

A 31,18 4 60
B 79,81 4 50
*letras diferentes significa diferencia significativa

En la tabla 18, se observa el efecto de la temperatura en los diferentes


tratamientos. Realizado el test de Duncan con un nivel de significancia de 0,05 se
observa que trabajando a temperaturas de 40 °C y 60°C no hay diferencias
significativas, a la temperatura de 50 °C si hay diferencia significativa ya que a esta
temperatura de trabajo se obtuvo la mayor cantidad de carotenoides totales.
V. CONCLUSIONES

65
1. En el tratamiento 2 (40 °C y 280 bar) se obtuvo mayor rendimiento del
extracto de zanahoria que fue de 2,09 g /100 g ms.

2. En la extracción de carotenoides de zanahoria (Daucus carota) con


CO2- supercrítico, el contenido de carotenoides principales que se identificó
fue el β-caroteno (14,60 - 71,34 mg/100 g ms), α-caroteno (4,20 - 12,27
mg/100 g ms) y luteína (0,47 - 0,89 mg/100 g ms) en todos los tratamientos.

3. En el tratamiento 4 (50 °C y 280 bar) y tratamiento 3 (50 °C y 200 bar) se


obtuvo la mayor cantidad de carotenoides totales que fue 84,50 mg/100 g ms
y 75,15 mg/100 g ms respectivamente.

4. El β-caroteno es el compuesto que se encuentra en mayor porcentaje en


todos los tratamientos (22,80 – 62,87 mg/100 g ms)

5. En el análisis estadístico de los carotenoides totales en la extracción con CO2


– supercrítico nos reporta que hay diferencia significativa con la temperatura,
la interacción de presión – temperatura y que no hay diferencia significativa
entre presiones de trabajo.

6. En la extracción convencional con (tetrahidrofurano/metanol) se obtuvo


48,08 mg/100 g ms. Y solo se extrajo compuestos hidrocarbonados tales
como α y β caroteno a diferencia de la extracción por CO2- supercrítico se
obtuvo 84,50 mg/100 g ms de carotenoides totales y se extrajo α, β caroteno
y luteína.

66
VI. RECOMENDACIONES

• Es necesario que se continúe con las investigaciones, potencializar la


extracción con SC-CO2 con el fin de ampliar el proceso para su posible
producción industrial de compuestos bioactivos de alta calidad para utilizar en
la industria farmacéutica, nutracéutica y cosmética.

• Realizar estudios de biodisponibilidad para conocer la efectividad del


aprovechamiento de los carotenoides en el consumo de vegetales.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS

67
- Ahluwalia, S., Shivhare, U., Basu, S. (2013). Supercritical CO2 extraction of
compounds with antioxidant activity from fruits and vegetables waste-a review.
Departament of Food Engineering. Focusing on Modern Food Industry (FMFI).

2(2).

- Alzate, L. (2013). Aprovechamiento de residuos agroindustriales para la producción


de alimentos funcionales: una aproximación desde la nutrición animal. Tesis para
optar el titulo como Magister en Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias.

Universidad de Antioquia. Colombia.

- Association of Official Analytical Chemists [A.O.A.C.] (1990). Official Method of


Analysis. 15ª ed. Washington, DC.EUA.

- Baranska, M., Baranski, R., Schulz, H., Nothnagel, T. (2006). Tissue- specific
accumulation of carotenoids in carrot root. Planta 224(5).

- Barbosa, G., Tapia, M., Cano, M. (2005). Novel food processing technologies. Edit
CRC Press Taylor & Francis Group, Llc.

- Barth, M., Zhou, C., Kute, K., Rosenthal, G. (1995). Determination of optimum
conditions for supercritical fluid extraction of carotenoids from carrot (Daucus carota
L.) tissue. J.Agric. Food Chem 43(11).

- Baysal, T., Ersus, S., Starmans, D. (2000). Supercritical CO2 extraction of βcaroteno
amd lycopene from tomato paste waste. Journal of Agricultural and Food
Chemestry 48.

- Begoña, A., Granado, F. y Navarro, B. (2001). Carotenoides y salud humana.


Unidad de vitaminas, Fundación Española de la Nutrición (F.E.N.).
Recuperado el 17 de setiembre del 2014. Disponible en:
www.fen.org.es/imgPublicaciones/1522007542.pdf

- Belén, D., Moreno, M., Aleman, R., Alvarez, F. (2004) Effect of drying temperatura
on degradation of carotenoids in coroba (Jessenia polycarpa karst) fruit.

Ciencia y tecnología Alimentaria. 4(3).

68
Brunner, G., (2005). Supercritical fluids: technology and application to food processing.
IV Iberoamerican Congress of Food Engineering (CIBIA IV).

Journal of Food Engineering, 67.

- Burgos, J., Calderon, F. (2009). Determinación del contenido de carotenoides


totales en ocho especies de frutas y verduras comercializadas en la zona
metropolitana de San Salvador. Tesis para optar el título de Licenciado en Química
y Farmacia. Universidad de el Salvador. Facultad de Química y Farmacia, San
Salvador.

- Careri, M., Furlattini, L., Mangia, A., Musci, M., Anklam, E., Theobald, A., Holst, C.
(2001). Supercritical fluid extraction for liquid chromatographic determination of
carotenoids in (Spirulina pacifica algae): a chemometric approach. Journal of
chromatography 936.

- Corbin, R. (2014). The effect of temperatura and extraction technique binding


interactions and hydrolysis of β-lactoglobulin with milk fat globule membrane
(MFGM). Thesis presented to Master of Science in Agriculture, with Specializations
in Dairy Products Technology. The Faculty of California Polytechnic State
University. San Luis Obispo.

- Coronel, E. (2012). Extracción por acción biocatalitica y dióxido de carbono


supercrítico de capsaicinoides y carotenoides del Capsicum chinese y análisis por
cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC). Tesis para optar el título de
Ingeniero en Industrias Alimentarias. Universidad Nacional del Centro del Perú.
Perú.

- Daood, G., Illés, V., Gnayfeed, H., Mészaros, B., Horvath, G., Biacs, P. (2002).
Extractión of pungent spice paprika by supercritical carbón dioxide and subcritical
propane. The Journal of Supercritical Fluids. 23.

- Del Valle, J., Aguilera, M., (1999). Extracción con CO2 a alta presión fundamentos
y aplicaciones en la industria de alimentos. Food Sci. 5(1).

69
-

- Díaz, M. (2008). Obtención de un colorante natural para alimentos a partir de la


zanahoria. Tesis para optar el título de Ingeniero Químico, Universidad Rafael
Urdaneta, Facultad de Ingeniería Química, Venezuela.
- Duran, M., Moreno, M. (2000).Evaluación de Algunas mezclas de solventes en la
extracción de carotenoides del pericarpio de tamarillo (Cyphomandra betacea
Sendt). Ciencia y Tecnología de Alimentos.3 (1).

- Durante, M., Salvatore, M., Mita, G. (2014). Dióxido de carbono supercrítico de


extracción de carotenoides de calabaza (Curcubita spp). Ciencia y Tecnología de
Alimentos.15 (4).

- Dutta, D., Chaudhuri, U., Chakraborty, R. (2005). Structure, health benefits,


antioxidant property and processing and storage of carotenoids. Department of
food technology and Biochemical Engineering. University, Kolkata. India. African
Journal of Biotechnology, Vol.4 (13). Recuperado el 23 de junio del 2014.
Disponible en: www.ajol.info/index.php/ajfand/article/.../60730

- Elizalde, O. (2008). Solubilidad de la capsaicina y pigmentos liposolubles


(carotenoides) del chile poblano en CO2 supercrítico. Tesis para optar el Título de
Doctor en Ciencias e Ingeniería Química. Instituto Politécnico Nacional.

Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas. México.

- Esteban, R., Moran, J., Becerril, J., Garcia, J. (2015). Versatility of carotenoids: An
integrated view on diversity, evolution functional roles and environmental
interactions. Institute of Agrobiotechnology, id AB-CSIC- UPNA. Pamplona, Spain.

- Fennema, O. (2000). Química de alimentos 2da edición, Zaragoza, España.


Editorial Acribia..

- Fernández, J. (2008). Extracción con CO2 - supercrítico de oleorresina y otras


fracciones de pimentón dulce y picante. Departamento de Ingeniería de Alimentos
y Equipamiento Agrícola. Universidad Politécnica de Cartagena.

Colombia.

70
- Flores, A., Rodriguez, G., Romero,G.,Barradas, D.(2012). Evaluación del
rendimiento del aceite de zanahoria (Daucus carota L.) a diferentes condiciones
de operación empleando CO2 en estado supercrítico. VII congreso Internacional
de Ingeniería Bioquímica. Instituto Tecnológico de Veracruz. México.
Fraser, P. Bramley, P. (2004). The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids.
Review. Progress in Lipid Research. 43(3).

- Goodman, G. (2004). The beta-carotene and retinol efficacy trial; incidence of lung
cáncer and cardiovascular disease mortality during 6-year follow-up after stopping
β-carotene and retinol supplements, J. Nalt. Cancer Inst.

- Han, B., Zhang, J. (2009). Supercritical CO2 –continuous microemulsions and


compressed CO2- expanded reverse microemulsions. Journal of Supercritical
Fluids. 47(3).

- Hernández, J. (2005). Cromatografía de alta eficiencia (HPLC). Servicio de


Bioquímica. Hospital Universitari Germans Trias Pujol, Badalona.

- Hernández, R., Candelas, C., Meza, V., Minjares, F. (2010). Estabilidad en el color
y la concentración de carotenos en zanahorias escaldadas a diferentes
temperaturas. XII Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos.
Universidad de Guanajuato. México.

- Hornero-Méndez, D. Mínguez-Mosquera, M. (2001). Rapid spectrophotometric


determination of red and yellow isochromic carotenoid fractions in paprika and red
pepper oleoresins. J. Agric. Food Chem.

- Hurst, W. (2007). Methods of analysis for functional foods and nutraceuticals


series. 2da ed. Estados Unidos. Editorial Taylor & Francs Gropup.

- Jaren, G., Nienaber, U., Schwartz, S. (1999). Paprika oleoresin extraction with
supercritical carbón dioxide. Department of Food Science and technology. The
Ohio State University, Columbus, Ohio. USA.

- Li, H., Pordesimo, L.,Weiss, J. (2004). High intensity ultrasoundassisted extraction


of oil from soybeans. Food Research International.

71
-

- Luque de Castro, M., Valcarcel. M., Tena, M. (1993). Extracción con fluidos
supercríticos en el proceso analítico. 1ra ed. España. Editorial Reverte S.A.

- Macias,C., Schweigert, F., Serrano, G., Pita, G., Hurtienne, A., Reyes, D., Alonso,
J. (2002). Carotenoides séricos y su relación con la dieta en un grupo de adultos
cubanos. Instituto de Nutricion e Higiene de los Alimentos. Cuba.
Revista Cubana. 16(2).

- McNair, H., Esquivel, B. (1973). Cromatografía liquida de alta presión. Programa


Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico. Departamento de Asuntos

Científicos. Secretaria General de la Organización de Estados Americanos.


Estados Unidos

- Meléndez, A., Martínez, I., Vicario, F. y Heredia. J. (2004.) Estabilidad de los


pigmentos carotenoides en los alimentos. Universidad de Sevilla, Sevilla, España.
Archivos Latinoamericanos de nutrición.54 (2). Recuperado el 8 de noviembre del
2015. Disponible en: http//www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0004-
06222004000200011.

- Mendiola, L. (2008). Extracción de compuestos bioactivos de microalgas mediante


fluidos supercríticos. Tesis para optar el grado de Doctor en Ciencia y Tecnología
de los Alimentos. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. España

- Minguez- Mosquera M., Hornero – Mendez D. y Perez –Galvez A. (2002)


Carotenoids and provitamin A in fuctional foods. Taylor &Francis Group New York
Washington, D.C.

- Minguez, M., Perez, A., Hornero, D. (2005). Grupo de química y bioquímica de


pigmentos. Departamento de biotecnología de alimentos. Instituto de la grasa
(CSIC). Sevilla. España.

- Morales, J. (1995). Fundación de desarrollo agropecuario, INC. Ed Centro de


información FDA. República Dominicana.

- Mukhopadhyay, M. (2000). Natural extracts using supercritical carbon dioxide.


Florida, Editorial CCR Press.

72
- Mustapa, A., Manan, Z., Mohd, C., Setianto, W., Mohd, O. (2011), Extraction of
βcarotenes from palm oil mesocarp using sub-critical R134a. Food Chimestry, 125.
Nagy, B y Simandi, B. (2008). Effects of particle size distribution, moisture content,
and initial oil content on the supercritical fluid extraction of paprika. J
Supercritical Fluid, 46.

- Nascimento, E., Silva, L., Alvarenga, D., Patto, C., Duarte, A., Santos, C. (2009).
Estudo dos métodos de extracão de carotenoides em cenoura por fluido
supercrítico (EFS) e convencional. Departamento de Química. Universidad Federal
de Lavras. Brasil.

- Nicolle, C.,Simon, G., Rock, E., Amouroux, P., Remesy, C. (2004). Genetic
variability influences carotenoid, vitamin, phenolic, and mineral content in whitw,
yellow, purple, orange, and dark-orange carrot cltivars. Journal of the American
Society for Horticultural Science. 129 (4).

- Peralta, A. (2010). Desodorización y despigmentación de pulpa de Guayaba (P.


guajava L.). Tesis para optar el grado de Ingeniero Quimico. Universidad Nacional
de Colombia.

- Reglero, G., Señoráns, J., Ibañez, E. (2005). Supercritical fluid extraction: an


alternative to isolating natural food preservatives. Novel Food Processing
Technologies. CRC Press, Boca Raton . EE.UU.

- Reyes, G., Gómez-Sánchez, P. I., Espinoza, B. C., Bravo R. F. y Ganoza, M. L.


(2009). Tablas Peruanas de Composición de Alimentos. Perú: Hecho el Depósito
Legal en la Biblioteca Nacional del Perú Nº 2009-02091 (8.vª ed.)

- Rodriguez- Amaya, D.B., Kimura (2004). Harvestplus handbook for carotenoid


analysis. Departamento de Ciencia de Alimentos, Facultad de Engenharia de
Alimentos Universidad Estadual de Campiñas, Brasil.

- Rodriguez-Amaya, D.B. (1999). Carotenoides y preparación de alimentos: La


retención de los carotenoides provitamina A en alimentos preparados, procesados
y almacenados. Universidad estadual de Campiñas, Brasil, primera impresión en
Ingles: Enero 1997, impreso en español: Diciembre 1999.

73
-

- Rodriguez-Amaya, D.B. (2001). A guide to carotenoid analysis in foods.


Universidad estadual de Campinas, Brasil, printed in the United States of America
2001.
- Romero, J. (2007). Utilización del bagazo de zanahoria (Daucus carota) en la
elaboración de harina. Tesis de pregrado. Universidad Nacional del centro del
Perú. Facultad de ingeniería en industrias alimentarias, Perú.

- Rozzi, N., Singh, R. (2002). Supercritical fluids and the food industry. Dept. of Food
Science and Technology. University of Georgia.1.

- Ruiz, P. (1996). Aplicación del dióxido de carbono supercrítico al procesado de


alimentos: nata, subproducto del refinado de aceites vegetales y zumo de naranja.
Tesis para optar el título de Doctor en Farmacia. Facultad de farmacia. Universidad
Complutense de Madrid. España.

- Shi, J. (2004) Functional food ingredients and nutraceuticals processingg


technologies.2da edición, Edit CRC Press Taylor & Francis Group.

- Sierra exportadora. (2010). Perfil comercial de la zanahoria. Recuperado el 17 de


junio del 2014. Disponible en:

www.sierraexportadora.gob.pe/perfil_comercial/Zanahoria.pdf

- Smith, J., Charte, E. (2010) Functional food product developmente.Prince Food


technology Centre. Charlottetown, Canadá.

- Southon, S., Faulks, R. (2003). Phytochemical functional foods. 1ra Ed. Cambridge,
Inglaterra, Edit. CRC Press LLC.

- Sun, M., Temelli, F. (2002). Supercritical CO2 extraction of carotenoids from carrots
and evaluation of products. Departament of Agricultural, Food and Nutritional
Science, University of Alberta, Edmonton, Alberta Canada.

- Sun, M., Temelli, F. (2006). Supercritical carbón dioxide extraction of carotenoids


from carrot using canola oil as a continuous co- solvent. Departament of
Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, Edmonton, Alberta
Canada.

74
- Tirador, M. (2011). Caracterización del contenido de nitratos y nitritos y la
composición nutricional en zanahoria (Daucus carota) cultivada con diferentes
dosis de fertilización NP. Tesis para optar el título de Bromatóloga. Facultad de
Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Cuyo. Argentina.
Uquiche, E., Del Valle, J., Orriz, J. (2004). Supercritical extraction of red pepper (C.
annun L.) oleoresins, Journal. of Food Engineering 65.

- Uurrea,D., Eim, V., Rosello, C., Simal, S (2012). Modelos cinéticos de degradación
de carotenoides, polifenoles y actividad antioxidante durante el secado convectivo
de zanahoria (Daucus carota) variedad nantesa. Revista de la Asociacion
Colombiana de ciencia y tecnología de Alimentos.21 (27).

- Valverde, G. (1995). Extracción con fluidos supercríticos: principios y aplicaciones


al análisis de residuos de plaguicidas. Universidad de Rioja. México.

- Vasco, V. (2008). Determinación de parámetros físico- químico de zanahoria


amarilla (Daucus carota) como base para el establecimiento de la norma de
requisitos. Tesis para optar el grado de Bioquímico Farmacéutico. Facultad de
Ciencias, Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Riobamba- Ecuador.

- Velasco, R., Villada, H., Carrera, J. (2007). Aplicaciones de los fluidos supercríticos
en la Agroindustria. Facultad de ciencias agropecuarias. Grupo de investigación,
aprovechamiento de subproductos de origen agroindustrial. Universidad del cauca.
Colombia. Revista científica ASUBAGROIN.18(1).

- Velásquez, A. (2008). La tecnología de fluidos supercríticos, un proceso limpio


para el sector industrial. Facultad de Ingeniería Química. Grupo de investigación
GRIAL. 3(2).

- Widman, R. (2004). Handbook of food Analytical chemistry. CRC Press Boca Raton
London New York Washington, D.C.

- Zaccari, F. (2010). Caracterización de seis cultivares de zanahorias (Daucus


carota, L), crudas y cocidas al vapor, por color y contenido y bioaccesibilidad in
vitro de β- carotenos y minerales. Tesis para optar el grado de Magister en Ciencias
Agrarias.. Universidad de la Republica. Uruguay.

75
-

VIII. ANEXOS

76
77
ANEXO I

1. ORIGEN E HISTORIA

La zanahoria (Daucus carota L.) ha sido cultivada hace más de 3000 años en Asia,
en la región que hoy ocupa Afganistán, si bien algunos autores consideran como
lugar de origen la zona templada del Mediterráneo en ambas regiones se encuentra
en estado silvestre, las primeras zanahorias eran blancas, violetas y amarillas
(Tirador, 2011).

El año 600 a.c se cultivaban zanahorias de color morado en Afganistán. Durante los
siglos IX y X se desarrolló zanahoria de raíz amarilla en Siria y que el cultivo fue
introducido en china a fines del siglo XIII. Las variedades amarillas llegaron a Europa
en el siglo XIV, reportándose el cultivo de la zanahoria en casi todo el continente
europeo. Las variedades de raíz anaranjada se reportaron por primera vez en
Holanda en el siglo XVII, de donde se distribuyeron y popularizaron por toda Europa
y pasaron al continente americano donde los indios de Norteamérica adoptaron la
zanahoria como alimento y la consideraban de gran valor (Morales, 1995).

La zanahoria antes de utilizarse como alimento fue usada como planta medicinal
para curar problemas digestivos y heridas. (Morales, 1995). Durante la edad media
la zanahoria se utilizaba como tinte para la mantequilla y en Francia la hoja se
utilizaba para decorar peinados y sombreros (Tirador, 2011).

2. TIPOS DE ZANAHORIA

La clasificación más generalizada de zanahorias atiende a factores de forma y tamaño de los


ejemplares, pudiendo encontrar:

a) Cortas. Se trata de variedades de cultivo temprano que tienden a formas


redondeadas. Su longitud suele ser menor de 10 cm.

b) Semi-largas o intermedias. Son las más comunes, de forma cilíndrica y gruesa


con piel lisa en tonos naranjas intensas. Miden entre 10-20 cm y se incluyen en
esta clasificación la mayoría de las cultivadas.
c) Largas. Acaban en punta y superan los 20 cm de longitud. Habitualmente se
utilizan para la comercialización.

78
Existen más de 50 variedades de zanahoria, algunas de ellas son:

• Parisina: raíz redonda, precoz.


• Ámsterdam: cilíndrica, fina, medio-larga.
• Chantenay: cónica alargada, a veces con el corazón rojo, aguanta al agrietado.

• Guerande: cónica corta.


• Nantesa: cilíndrica alargada.
• Antares: cilindro cónica, resistente a la rotura.
• Carson F1: híbrido tipo chatenay.
• Nippón: híbrido tipo nantesa.

(Sierra exportadora, 2010)

3. PRODUCCIÓN NACIONAL POR REGIONES

En los últimos años se ha dado una mayor importancia al cultivo de productos con
alto valor nutritivo es por eso que en el Perú se ha visto un crecimiento en la
producción de zanahoria, debido a la existencia de diferentes zonas agroecológicas
que ofrecen condiciones favorables para el cultivo de esta hortaliza. En la (Tabla 2)
se aprecia los principales departamentos productores de zanahoria en el 2010,
liderando en la producción los departamentos de Junín y Lima. En Junín se produce
anualmente un promedio del 60% del total de la producción de zanahoria, la cual
abastece principalmente a Lima y otras regiones como la selva central (Sierra
Exportadora, 2010).

Tabla 1. Producción Nacional de Zanahorias en superficie cosechada

79
Producción de zanahorias 2010
superficie % particip.
cosechada (HA) 2012
Departamento
Junín 2,559 30,14
Lima 2,036 23,98

Arequipa 920 10,84

Ancash 500 5,89

Cusco 492 5,80

Amazonas 373 4,39

Cajamarca 367 4,32

Libertad 340 4,01

Huánuco 257 3,03

Lambayeque 204 2,40

Ayacucho 203 2,39

Apurímac 114 1,34

Ica 39 0,46

Piura 34 0,40

Moquegua 23 0,27

Puno 11 0,13

Pasco 7 0,08

Huancavelica 5 0,06

Tacna 5 0,06

Total 8,489 100,00

Fuente: Sierra Exportadora (2010)

80
Tabla 2. Composición química de 100 g de parte comestible de zanahoria sin
cascara.

Componente Contenido
Agua 89,0 g
Carbohidratos totales 9,2 g
Carbohidratos disponibles 6,4 g
Fibra cruda 1,2 g
Fibra dietética 2,8 g
Proteínas 0,6 g
Grasa total 0,5 g
Calcio 33 mg
Fosforo 16 mg
Zinc 0,24 mg
Hierro 0,5 mg
Retinol 1696,0 ug
Vitaminas equivalentes totales 841,0 ug
Vitamina c 17,4 ug
Tiamina 0,04 ug
Riboflavina 0,04 mg
Valor energético 41 kcal
Fuente: Reyes et al. (2009)

81
ANEXO II

1. CROMATOGRAMAS DE LOS ESTANDARES DE CAROTENOIDES

a) Cromatograma de alfa-caroteno (50 ppm)

Curva Estandar α-caroteno


12000000

10000000 y = 203767x - 505082


R² = 0.9932
8000000

6000000

4000000

2000000

0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración ppm

82
b) Cromatograma de beta-caroteno (62,5 ppm)

Curva Estandar β - caroteno


2500000
y = 41896x - 416725
2000000 R² = 0.9987

1500000

1000000

500000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentración ppm

83
c) Cromatograma de Luteína (33 ppm)

Curva Estandar Luteina


300000
y = 8592.1x - 1624.1
250000 R² = 0.9997

200000

150000

100000

50000

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración ppm

d) Rendimiento del extracto de zanahoria obtenida por CO2- supercrítico


84
2.50

2.00

1.50

1.00

0.50

0.00
T1 T2 T3 T4 T5 T6
Tratamientos

Tabla 3. Cantidad de fracciones y carotenoides totales obtenidas por la extracción


convencional y CO2- supercrítico.

CO2-
Carotenoides Convencional Supercritico
α-caroteno (mg/100 g ms) 7,22 ±0,08 12,27 ±1,80
β-caroteno (mg/100 g ms) 40,86 ±0,51 71,34 ±1,67
Luteína (mg/100 g ms) - 0,89 ±0,051
carotenoides totales (mg/100g ms) 48,08 ±0,81 84,50±12,3

*promedio de dos repeticiones

ANEXO III

PRUEBA DE DISTRIBUCIÓN NORMAL

3.1 Contenido total de carotenoides – extracción por CO2 - supercrítica

Estadístico P- valor
Shapiro-Wilk W 0,984256 Pr>w 0,9954
85
Kolmogorov-Smirnov D 0,10335 Pr>D >0,1500
Cramer-von Mises W-Sq 0,027212 Pr> W-Sq >0,2500
Anderson- Darling A-Sq 0,174807 Pr> A-Sq >0,2500

 Se toma en cuenta la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk porque la cantidad de


datos a analizados fue menor que 50.

 El P-valor (0,9954) es mayor que el nivel de significancia (0,005) entonces se acepta


la Ho (hipótesis nula) esto significa que los datos tienen una distribución normal.

ANEXO IV.

4.1 Acondicionamiento de la zanahoria Seca

86
87
ANEXO V.

5.1 Extracción de carotenoides de zanahoria por CO2-Supercritico ANEXO VI.

6.1. Cuantificación de Carotenoides por Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia

88
ANEXO VII

7.1. Análisis estadístico de alfa- caroteno de zanahoria

89
90
91
92
ANEXO VIII. 8.1.
Análisis estadístico de beta- caroteno de zanahoria

93
94
95
96
97
ANEXO XI

9.1. Análisis estadístico de Luteína de zanahoria

98
99
100
ANEXO X.

10.1 Análisis estadístico de carotenoides totales de zanahoria

101
102
103
104
105
106
ANEXO XI

103