Comparación filogenética de mosquitos vectores (Aedes, Culex y

Anopheles) y sus virus parásitos (Alphavirus y Flavivirus)

Aroca-Aguilera, María Camila; Jaramillo-Sánchez, Jhon Jairo; Matha-Urbano, Paula
Alejandra; Ruíz-Vega, Sebastián
Resumen
Los virus son organismos patógenos que parasitan a seres vivos y algunos emplean vectores
para propagarse. Entre los más relevantes para la salud pública se destacan los mosquitos, que
por su gran capacidad de transmisión viral han sido ampliamente estudiados. Por otro lado, la
relación entre el hospedero (mosquito) y el huésped (virus) suele presentar características
coevolutivas. Por lo que se planteó un estudio enfocado en determinar la relación evolutiva de
los mosquitos vectores y virus más importantes en la actualidad. Inicialmente, se recopilaron
secuencias del gen mitocondrial ND4 y de la proteína STAT para mosquitos (Aedes, Anopheles
y Culex), el primero como marcador molecular y la segunda por ser una proteína que interactúa
con el virus durante el proceso de infección; como también de secuencias de la proteína de
envoltura (Envelope), de virus Alphavirus y Flavivirus. Posteriormente se reconstruyeron las
filogenias de las secuencias usando el paquete de bioconductor para R phangorn; se realizó un
análisis de máxima verosimilitud para cada grupo de datos con un bootstraping no paramétrico
de 1000 repeticiones. Por último, se realizaron análisis de coevolución PARAFIT y PACo.
Finalmente, se evidenció la existencia de coevolución entre los grupos mencionados, tanto por
los análisis como por la correspondencia entre las filogenias. Se recomienda estudiar más
cercanamente las relaciones moleculares entre las proteínas para desarrollar estrategias de
prevención y tratamiento de las enfermedades.
Palabras clave: Coevolución, Mosquitos, Virus, Filogenia, Bioinformática
Introducción letal pero muy contagioso, un síntoma es la
Los virus son organismos patógenos que fiebre y se transmite fácilmente por largos
parasitan a los seres vivos, dentro de los vectores de dispersión a través de la frontera
cuales los humanos se ven afectados como como mosquitos, específicamente el género
cualquier otra especie. Infectan células y Aedes (Ministerio de Salud y Protección
utilizan el motor celular para su reproducción; Social e Instituto Nacional de Salud, 2014);
por el aire, los fluidos y el uso de otros otra enfermedad tropical resaltada es la fiebre
organismos se propagan, por lo tanto amarilla que causa la muerte de la mayoría de
proponen una amenaza mundial, ya que los pacientes infectados en aproximadamente
pueden afectar la salud de los anfitriones, por 7 a 10 días, y se transmite fácilmente por
lo tanto, las vidas humanas. Aedes aegypti, A. albopictus, Haemagogus
Colombia ha estado ampliamente expuesta a spp. (H. leucocelaenus entre otros del género)
diferentes ondas virales, como las regiones y Sabethes spp. (S. chloropterus u otros del
tropicales cálidas, el dengue, que no género) (Ministerio de Salud, n.d.).
representan una amenaza para la salud Brevemente, los virus representan una gran
humana (Ministerio de Salud y Protección amenaza para los humanos, así como los
Social, 2013); o Zika que ha causado varias vectores que los propagan (mosquitos).
advertencias en el país y en todo el mundo, Por lo tanto, teniendo en cuenta que los
principalmente debido a su vínculo con el mosquitos son artrópodos muy importantes
diagnóstico de microcefalia prenatal (Salazar, para la salud pública debido a su amplio rango
2016) (Instituto Nacional de Salud, 2017); El de dispersión, determinar su relación exacta
chikungunya es un ejemplo mucho menos con el virus tiene una importancia vital para
su control.
Por ende los análisis de coevolución nos
indican sobre las dinámicas genéticas
poblacionales y su asociación entre los
organismos de la tierra; Básicamente, las
interacciones interespecíficas y el ambiente
son factores que llevan a evolucionar, siendo
unos factores muy estudiados, destacándose
la década de los 90’s por los rigurosos
estudios desde la filogenética debido a los
avances desde la biología
molecular(Thompson, 2005). En el caso de
los virus, es importante entender que su
relación con los organismos multicelulares
como vertebrados y artrópodos con un 59% y
un 25% de relaciones con virus y el 16%
restante en asociación con plantas y otros
organismos, es por esto que el estudio de la
evolución de los virus con respecto a sus
vectores y hospederos es de vital importancia
para entender sus dinámicas e interacciones
(Shatkin, Murphy and Maramorosch, 2003).
El caso de las relaciones entre virus e insectos
(principalmente mosquitos) han sido
ampliamente estudiadas debido a su
importancia en las enfermedades causadas por
vectores (Vector-Borne Diseases) Las
principales enfermedades transmitidas por
vectores representan alrededor del 17% de la
carga mundial estimada de enfermedades
transmisibles y causan más de 700.000
muertes al año. Las zonas tropicales y
subtropicales son las más afectadas Más del
80% de la población mundial vive en zonas en
las que hay riesgo de contraer al menos una de
las principales enfermedades transmitidas por
vectores, y más del 50% de la población
mundial, en zonas en las que hay riesgo de
contraer dos o más. (Gallup JL,
2001).Centrarse en los vectores que
transmiten los patógenos es un enfoque
preventivo eficaz contra la mayoría de las
enfermedades de transmisión vectorial.
Como se mencionó anteriormente, la
coevolución es un proceso importante que
debe ser estudiado para entender el contexto
de relaciones parasitarias. La cofilogenia es
una importante herramienta para su estudio,
ya que se refiere a la aproximación
filogenética que busca procesos de
coevolución entre taxa, y demuestra su
función al presentar marcos de tiempo
calibrados (Martínez-Aquino, 2016). Existen
varias formas en las que la cofilogenia puede
ser analizada, resaltando las estadísticas y las
basadas en eventos. Las primeras tienen como
objetivo comprender la congruencia entre
árboles y el enlace entre los ancestros
comunes más recientes, y las segundas
dependen de eventos que relacionen los
árboles de los taxa comparados (que pueden
ser huésped y parásito) (Martínez-Aquino,
2016).
Por lo tanto, para poder determinar los ritmos
evolutivos y su relación mediante un método
filogenético, diferentes investigadores han
sugerido el uso del RNA mitocondrial con el
gen Nicotin Adenin Deshidrogenasa -
subunidad 4 (ND4) como base de la
construcción de árboles filogeneticos de
mosquitos (Culicidae), y ha sido utilizado
ampliamente en estudios del género Aedes
(Costa-da-Silva, Capurro, & Bracco, 2005;
Ali, El-Badry, Ali, El-Sayed, & El-
Beshbishy, 2016; Gould, Petterson, Higgs,
Charrel, de Lamballerie, 2017). Su
amplificación sencilla, no recombinación por
ser de linaje materno, no poseer intrones y sus
regiones intergénicas son cortas son algunos
de los factores que exponen su valor como
marcador (Chucatiny, 2014), siendo utilizado
en vectores del género Aedes permitiendo el
análisis de su estructura y diversidad genética
(Bracco, Capurro, Lourenço-de-Oliveira., &
Sallum, 2007).
Por otro lado, los virus suelen ser estudiados
mediante su genoma completo debido a que
su estructura es cíclica y corta, como en
procariotas (Clark & Pazdernik, 2013). Sin
embargo, para las diferentes especies de los
géneros Alphavirus y Flavivirus existen
diferentes métodos, los virus del Dengue
frecuentemente son estudiados usando el gen
de envoltura (E gen) (Holmes, Worobey &
Rambaut, 1999; Mota, Ramos-Castañeda,
Rico-Hesse & Ramos, 2002; Weaver &
Vasilakis, 2009); mientras que para la Fiebre
Amarilla se utiliza la unión de prM/E
(Mutebi, Wang, Li, Bryant & Barrett, 2001;
Auguste, Lemey, Bergren, Giambalvo,
Moncada. et al., 2015; Bonaldo, Gómez, Dos
Santos, Abreu, Ferreira-de-Brito. et al., 2017).
Los virus de Chikungunya y Zika si suelen
estudiarse con su genoma completo (Volk,
Chen, Tsetsarkin, Adams, Garcia et al., 2010;
Lanciotti, Lambert, Holodniy, Saavedra &
Signor, 2016; Gould, Petterson, Higgs,
Charrel, de Lamballerie, 2017).
Por ende se tratara de encontrar si existe una
relación coevolutiva entre vectores
(mosquitos Culicidae) y virus parásitos
(género Alphavirus y Flavivirus) la cual es
vital para generar un manejo específico del
vector y por lo tanto el virus, además en la
actualidad, se conoce que el parásito depende
metabólica y evolutivamente del hospedero;
entre ellos se establece contacto biológico e
intercambio macromolecular, mediante el
que, de forma actual o potencial, ocasiona
acciones patógenas o modificaciones del
equilibrio homeostático del hospedero y de la
respuesta adaptativa de su sistema inmune
(Rodríguez et al.2014) dando una visión en
macro sobre el comportamiento del complejo
hospedero virus y su futura contingencia y
estudio específico.
Materiales y método
Recopilación de secuencias
Inicialmente se recopilaron secuencias del
gen mitocondrial ND4 y de la proteína STAT,
de los mosquitos Aedes aegypti, Ae.
albopictus, Anopheles gambiae, An. funestus,
Culex quinquefasciatus, C. tritaeniorhynchus
y del outgroup Drosophila melanogaster; por
otro lado, igualmente se recopilaron las
secuencias de la proteína de envoltura
(Envelope), de los virus Alphavirus (Onyong-
nyong y Semliki forest), Flavivirus (Dengue
1, Fiebre amarilla, Zika, Encefalitis japonesa)
y como outgroup el virus Kallithea
(Nidiviridae no clasificado).
Alineamiento de secuencias y
reconstrucción de filogenias
Las secuencias recopiladas se alinearon
empleando los programas MAFFT v7
(Nakamura, Yamada, Tomii & Katoh, 2018)
y MUSCLE v3.8.31 (Edgar, 2004), el primero
para el alineamiento de secuencias de
proteínas (Envelope y STAT).
Posteriormente, se reconstruyeron las
filogenias en el software estadístico R v3.6.0
(R Core Team, 2019) con el paquete
Phangorn (Schliep, 2010). Se realizó un
análisis de máxima verosimilitud (selección
por AICc) para cada uno de los grupos de
datos y, finalmente, un bootstrap con 1000
repeticiones.
Análisis coevolutivos
Para la comparación filogenética se procedió
a realizar un análisis cualitativo que permite
observar la congruencia entre las filogenias,
utilizando el programa TreeMap v3
( .Después de reconstruidas las filogenias, se
emplearons las matrices de distancia y una
matriz binaria que relaciona a virus con
vectores (1 si se relaciona y 0 de lo contrario),
en los paquetes Ape 5.0 (Paradis & Schliep,
2018), específicamente la función PARAFIT
(Legendre, Desdevises, & Bazin, 2002), y
PACo (Balbuena, Poisot, Hutchinson &
Cagua, 2017). Estos fueron realizados tanto
entre el gen ND4 y la proteina de envoltura,
como entre la proteína STAT y la última.
Resultados:
Análisis filogenéticos
Después de alineadas y reconstruidas las
filogenias se encontró que los hospederos
presentan diferentes organizaciones respecto
al marcador utilizado para la reconstrucción
filogenética, algo esperado. Se observa la
formación de clados definidos para cada
género en el caso del marcador molecular
ND4 (fig. 1), mientras que para la proteína
STAT (fig. 2) la organización no sigue un
orden taxonómico. Sin embargo, se resalta
que en ambas se forma el clado del género
Aedes, así como una cercanía con el mosquito
C. tritaeniorhynchus.
Por otro lado, la filogenia de los virus (fig. 3)
se divide en dos clados principales,
Alphavirus-Nudiviridae y Flavivirus. Tanto
en esta reconstrucción como en las anteriores
se obtuvo un valor de bootstraping igual a
100, sugiriendo filogenias ajustadas a la
realidad.

Figura 1. Árbol filogenético reconstruido a partir del gen mitocondrial ND4 de los vectores (hospederos), utilizando el modelo propuesto por
Nei y Kumar (2000) (GTR) y una tasa con distribución Gamma, ML=-4423.23. Las etiquetas representan el valor del bootstraping.
Figura 2. Árbol filogenético reconstruido a partir de la proteína de los vectores (hospederos), utilizando el modelo propuesto por Jones, Taylor
y Thorton (1992) (JTT) y una tasa con distribución Gamma, y sitios invariantes, ML=-10270.26. Las etiquetas en los nodos representan el
valor del bootstraping.Las etiquetas representan el valor del bootstraping.

Figura 3. Árbol filogenético reconstruido a partir de la proteína de los virus (húespedes), utilizando el modelo propuesto por Whelan y
Goldman (2001) (WAG) con distribución Gamma, ML=-8160.124. Las etiquetas representan el valor del bootstraping.
Después de analizadas la filogenias,
independientemente de las posibles relaciones
evolutivas, se procedió a realizar una
esquematización que presenta las relaciones
entre las virus y la proteína con la que se
espera exista coevolución, por su constante
interacción de la respuesta inmune innata.
Como resultado, se obtuvo la figura 4, donde
se observa una correspondencia parcial entre
los arboles, siendo más notoria entre los
clados Aedes-C. tritaeniorhynchus y Dengue-
Encefalitis; los cuales además de mostrar
congruencia en su organización, han
presentado eventos de relación.

Figura 4. Enlazamiento de filogenias hospederos y parásitos (izquierda y derecha, respectivamente), con lineas de interacción basadas en
eventos conocidos de relación entre ambas filogenias. Construido con TreeMap v3.
Análisis coevolutivos: en PACo y la alternativa en ParaFit.
Tanto ParaFit como PACo expusieron Contrario a lo observado en la figura 4, ambas
resultados que evidencian coevolución en el pruebas mostraron una mayor relación entre
grupo (ParaFitGlobal=88.261, p=0.0319; C. quinquefasciatus y el virus del Zika, D.
PACo m² XY=5.9612, p=0.111), siendo el melanogaster y el virus Kallithea (PACo) y
primero un test de independencia de las An. Gambiae y el virus Onyong-nyong, esto
filogenias y el segundo un test de se puede evidenciar en la tabla 1.
dependencia. Aceptandose la hipótesis nula

Tabla 1. Enlaces individuales entre mosquitos y virus, valores más altos de F1 y F2 representan mayor relación y aporte al ajuste global, links
representa la relación entre los taxa por la superimposición realizada en la prueba.
 Ta x a Par aFit
Hospedero Par asito F1.stat
con
p.F1
algunos deF2.stat
los virus, pero p.F2 ese objetivo noPAColinks
Ae. ae gy pti
Ae. ae gy pti
Chikung uny a
Z ika
-16.65711
14.8871 1
se puede
0.97220 278
0.06179 382
cumplir con
-0.0 43817 34
0.03916 127
estos métodos
0.97990 201
0.05409 459
ya que las
0.72405 37
0.37807 25
Ae. ae gy pti Fieb re am ar illa 14.7841 4 relaciones
0.07849 215 moleculares
0.03889 040 entre0.06749
cada 325 virus y0.25207
el 02
Ae. ae gy pti Dengu e 14.3162 3 0.07609 239 0.03765 956 0.06749 325 0.22244 18
Ae. albopictu s Chikung uny a -16.65711 sistema
0.97300 270 inmune innato
-0.0 43817 34 son diferentes,
0.98040 196 lo que
0.72268 21
Ae. albopictu s Z ika 14.8871 1 0.06159 384 0.03916 127 0.05359 464 0.38789 36
Ae. albopictu s Fieb re am ar illa 14.7841 4 cambiaría
0.07519 248 la 0.03889
trazabilidad
040 de las335filogenias,
0.06649 0.11906 90
Ae. albopictu s Dengu e 14.3162 3 0.07469 253 0.03765 956 0.06499 350 0.34473 88
C. tr itaeniorhy nchu s Encefalitis japo nesa 14.2708 1 principalmente
0.09849 015 por007el ARNi
0.03754 (Keene
0.08649 135 et al.,
0.25580 52
C. q uinq uefasciatus Z ika 13.7639 0 0.07159 284 0.03620 663 0.06159 384 4.08957 68*
An. fu nestus Ony ong-ny o ng 10.1021 7
2004).
0.16378 362 0.02657 425 0.14268 573 0.65191 96
An. fu nestus
An. gam biae
Sem liki
Ony ong-ny o ng
10.2226 1
22.2851 5*
0.18898 110
0.03719 628*
Por otro lado
0.02689 109
0.05862 218
los vectores
0.16448 355
Anopheles,
0.03159 684*
0.48560 84
1.56035 42*
D. m e lano gaster Kallith ea 20.8138 3* no 558*
0.04419 mostraron0.05475 mayor180 correlación
0.03359 664*con algun2.64874 36*

Discusión: virus (excepto la evidenciada por el ParaFit

Los análisis coevolutivos realizados permiten
establecer que existe una relación entre ambos
grupos (virus y vectores), como es esperado
por tratarse de una relación parasito-
hospedero. Este tipo de relaciones suelen o
esperan verse reflejadas en congruencia
filogenética (por la ley de Farenhol que
establece que la filogenia del parasito refleja
la del hospedero) (Legendre, Desdevises &
Bazin, 2002; Hafner & Nadler, 1988; Avino
et al., 2018).
Los análisis globales indican una
correspondencia entre las filogenias
completas, sin embargo si se compara con los
arboles de la proteína STAT (perteneciente a
la ruta JAKSTAT) y la proteína de envoltura
(que es la primera en interactuar con el
sistema inmune del hospedero,
específicamente su respuesta innata), solo se
observa congruencia en un subarbol, que ya se
mencionó en resultados; se esperaba que la
mayor congruencia se diera entre las especies
pertenecientes a este subarbol.
Sin embargo, los taxa más
relacionados entre ellos son los menos
aparentes por las filogenias. Esto genera
dudas respecto a la aplicabilidad de estos
análisis para hospederos con multiples
huespedes, que se ha relacionado con cambios
en la formación de clados y filogenias
“reflejo” (Avino et al., 2018). De las especies
utilizadas para el estudio las más importantes
para la salud pública son las del género Aedes,
que se esperaba mostraran correlación directa
entre el Zika y An. gambiae), esto no es una
resultado inesperado, por la estrecha relación
entre estos vectores y los protozoos
Plasmodium, ya que los mecanismos de
infección no involucran el mismo tipo de
proteína (Cheng, Liu, Wang & Xiao, 2016).
Además, los virus estudiados de
Alphavirus, presentan estrategias diferentes
de infección a los Flavivirus, donde los
primeros inhiben la reproducción de células
de mieloide, y los segundos inhiben la
respuesta de mensajeros químicos de las rutas
JAKSTAT, Toll e Imd (Samuel, Adelman &
Myles, 2018). Esto se relaciona con
diferencias en la formación de clados en el
arbol STAT y ND4, que han tenido diferentes
estrategias adaptativas (y heredables).
Recomendaciones
Debido a las diferencias que presentan los
diferentes tipos de virus, así como su relación
con los vectores, no se puede establecer una
relación clara entre ambos grupos para los
casos de múltiple parasitismo (Aedes siendo
el ejemplo más claro). Por lo que se
recomienda continuar con el estudio de las
relaciones moleculares entre proteínas de
virus y vectores, así como identificar cuales
son los que presentan mayor relación y poder
desarrollar estrategias ya sea de control
biológico a nivel molecular o celular (por
competencia con otros parasitos).

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