6.

Carbohidratos: análisis cuantitativo

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2
4 horas
personas)

OBJETIVOS

 Cuantificar el contenido de carbohidratos totales en una muestra biológica mediante métodos

colorimétricos
 Cuantificar el contenido de glucosa en una muestra biológica mediante método enzimático

Conceptos relacionados: carbohidratos, glucosa-oxidasa, método de antrona, método de ácido

dinitrosalicílico.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Existen varios métodos para determinar la cantidad de azúcares totales presentes en una
muestra biológica. Uno de los más utilizados es el de la antrona por ser un método rápido, de
alta sensibilidad y que permite la valoración de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos sin
necesidad de hidrólisis puesto que, previamente, el ácido sulfúrico concentrado, presente en el
reactivo de antrona, se encarga de este paso. El ácido sulfúrico concentrado deshidrata las
pentosas y hexosas produciendo derivados de furfural el cual, al reaccionar con la antrona,
produce un complejo verde azulado que muestra un máximo de absorción a 620 nm. La
intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentración de carbohidratos presentes
en la muestra. Tiene una limitación y es que, si en la muestra se encuentran presentes
proteínas con un alto contenido de triptófano, esto producirá una coloración roja que interfiere
con la lectura en el espectrofotómetro.

El método de Miller o DNS es otra técnica colorimétrica ampliamente utilizada, que emplea el
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para la hidrólisis y oxidación de los polisacáridos presentes en
una muestra (Figura 1) seguido de la determinación espectrofotométrica de los azúcares
reductores a una longitud de onda de 540 nm.
Figura 1. Reacción de oxidación de azúcares reductores por el método DNS.

Para los dos métodos anteriores, es necesario construir una curva de calibración con azúcares
de referencia.

No obstante, cuando se requiere cuantificar glucosa en una muestra de análisis, sobre todo
fluidos biológicos tales como sangre u orina, el método enzimático es una alternativa más viable
debido a su alta especificidad y precisión en los resultados. Para ello, la enzima “glucosa
oxidasa” es ampliamente utilizada para la cuantificación de glucosa libre no solo en fluidos
biológicos sino también en la industria de alimentos e investigación en general. Ésta se basa en
la oxidación de la β-D-glucopiranosa en ácido glucónico y peróxido de hidrógeno (H2O2) por
acción de la glucosa oxidasa (GOD). El peróxido de hidrógeno es a su vez sustrato de otra
enzima, la peroxidasa (POD), la cual en presencia de fenol y una amina aromática (como la
amino-4-antipirina) genera un compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, el cambio del
color del reactivo de incoloro a rosado indica la presencia de glucosa en la muestra y puede
cuantificarse por espectrofotometría a una longitud de onda de 500 nm. Las reacciones
enzimáticas se describen a continuación.

α -D-Glucosa + ½ O2 + H2O + GOD  Ácido Glucónico + H2O2

2 H2O2 + 4–Aminoantipirina + Fenol + POD  Quinonamina + 4 H2O
MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
Micropipetas Antrona al 0.2% en ácido sulfúrico
concentrado
Tubos de ensayo (16) Reactivo DNS: Para una solución de 200
mL, disolver 2.0 g de NaOH, 2.0 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico, 40 g de tartrato de
sodio-potasio tetrahidratado, 0.4 g de
 fenol, 0.1 g de sulfito de sodio en agua
destilada.
Gradilla para tubos de ensayo Kit glucosa oxidasa (BioSystems)
Vasos de precipitados 50 y 100 mL Solución de Glucosa al 0.01% (p/v)
Embudo Carbón activado
Gasa o algodón Muestra biológica: utilice las muestras
almacenadas de la práctica anterior
Espectrofotómetro

Centrífuga

PROCEDIMIENTO
1. Preparación de la muestra
Si la muestra presenta color, adicionar una cantidad de carbón activado, mezclar y dejar reposar
por 10 minutos. Posteriormente, centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos. Utilizar el
sobrenadante para análisis cuantitativo de carbohidratos. Si la solución no presenta color, puede
utilizarse directamente para las pruebas.

2. Cuantificación por el método de antrona

Preparación de la curva de calibración.

Utilice la siguiente tabla como guía para la preparación de las soluciones patrón (los tubos de
ensayo deben estar depositados en un baño de hielo antes de iniciar cada mezcla de reactivos):

Reactivo
Agua Glucosa Muestra Reactivo Concentración final
Tubo
destilada (µL) 0.01% (µL) biológica antrona (µL) glucosa (mM)
(µL)
Blanco 2000 - - 4000 0.000
1 1880 120 - 4000 0.011
2 1760 240 - 4000 0.022
3 1520 480 - 4000 0.044
4 1280 720 - 4000 0.066
5 800 1200 - 4000 0.110
Muestra 1700 - 300 4000 -
 Agite rápidamente después de preparar cada solución y transfiera los tubos a un baño de
agua hirviendo durante 5 minutos.
 Tape cada tubo y transfiéralos nuevamente al baño de hielo. La presencia de un color verde
azulado indica la presencia de carbohidratos. La intensidad del color desarrollado es
proporcional a la cantidad de carbohidratos presentes.
 Configure el espectrofotómetro a la longitud de onda de 620 nm y ajuste a cero utilizando el
blanco.
 Registre la absorbancia de cada una de las soluciones patrón y construya la respectiva curva
de calibración
 Registre la absorbancia de la muestra problema y determine la concentración de
carbohidratos presente. En caso de ser necesario, realice diluciones de la muestra hasta
lograr medidas de absorbancia dentro de la curva de calibración. Tenga en cuenta las
diluciones para el cálculo de concentración de carbohidratos.

3. Cuantificación por el método DNS

Preparación de la curva de calibración.
Utilice la siguiente tabla como guía para la preparación de las soluciones patrón:

Reactivo
Agua Glucosa Muestra Reactivo DNS Concentración final
Tubo
destilada (µL) 0.01% (µL) biológica (µL) glucosa (mM)
(µL)
Blanco 1000 - - 1000 0.000
1 800 200 - 1000 0.055
2 600 400 - 1000 0.111
3 400 600 - 1000 0.167
4 200 800 - 1000 0.222
5 - 1000 - 1000 0.278
Muestra 500 - 500 1000 -

 Agite rápidamente después de preparar cada solución y transfiera los tubos a baño María
durante 15 minutos. Asegúrese de tapar los tubos.
 Configure el espectrofotómetro a la longitud de onda de 575 nm y ajuste a cero utilizando el
blanco.
 Registre la absorbancia de cada una de las soluciones patrón y construya la respectiva curva
de calibración
 Registre la absorbancia de la muestra problema y determine la concentración de
carbohidratos presente. En caso de ser necesario, realice diluciones de la muestra hasta
lograr medidas de absorbancia dentro de la curva de calibración. Tenga en cuenta las
diluciones para el cálculo de concentración de carbohidratos.

4. Cuantificación por el método enzimático “glucosa oxidasa”

Lea cuidadosamente la información del inserto en el que se describe el procedimiento para
cuantificación de glucosa utilizando el Kit (Biosystems).

 Atemperar los reactivos del kit de glucosa oxidasa (Biosystems).

 Pipetear en tubos Eppendorf:

Tubo
Reactivo
Blanco Patrón Muestra
Patrón (S) - 10 µL -
Muestra - - 10 µL
Reactivo (A) 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

 Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16 a 25°C) o
durante 5 minutos a 37°C.
 Configurar el espectrofotómetro a 500 nm y ajustar a cero con el blanco.
 Leer la absorbancia (A) del patrón y de la muestra. El color de la solución es estable durante
al menos dos horas.
 Determine la concentración de glucosa utilizando la siguiente fórmula:
CM = CP * (AM/AP)
Donde,
CM = concentración de la muestra (en mM)
CP = concentración del patrón (5.55 mM)
AM = Absorbancia de la muestra
AP = Absorbancia del patrón

 Disposición final de los residuos generados en la práctica. Todos deben ser

depositados en el recipiente indicado para tal fin.
CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
1. Consulte y escriba las reacciones químicas involucradas en el método de cuantificación de
carbohidratos utilizando antrona.
2. ¿Por qué la prueba de la glucosa oxidasa es específica para la determinación de glucosa?
3. ¿Qué otros métodos se podrían utilizar para cuantificar carbohidratos?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Morrison, R.T., Boy, R.N. 1998. Química Orgánica. Addisson Wesley, México.
2. Volhart, K. P. 1.987. Organic Chemistry. W.H. Freeman and Company, N.Y.
3. Dotti, L.B., Kleiner, I.S. 1962. Laboratory Instructions in Biochemistry.The C.V. Mosby
Company.
4. Xiaochun Yu, Carl Houtman, Rajai H. Atalla. The complex of amylose and iodine.
Carbohydrate Research, 292 (1996)129-141.
https://en.wikipedia.org/wiki/Glucose_oxidase