INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE LOS RIOS

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN

PROYECTO DE RESIDENCIA PROFESIONAL

Título del proyecto:

CRIO-PRESERVACIÓN DE PROTOPLASTOS DEL HONGO Mycosphaerella fijiensis

Presenta:

KEVIN JESIEL GUTIÉRREZ MORENO

No. de Control: 10E20400

Asesores Externos:

DRA. BLONDY CANTO CANCHÉ

M.C MIGUEL ALONSO TZEC SIMA

Asesora Interno:

DRA.TERESITA DE JESÚS CELIS ARÁMBURO

Carrera:

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

BALANCÁN, TABASCO. ABRIL 2015.

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ÍNDICE

I.  INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 7 
II.  PROBLEMÁTICA A RESOLVER ................................................................................................ 9 
III.  JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 9 
IV.  OBJETIVOS ............................................................................................................................. 11 
4.1. Objetivo general ....................................................................................................................... 11 
4.2. Objetivo particulares ................................................................................................................ 11 
V.  Caracterización del área en que participó ............................................................................... 12 
5.1. Antecedentes de la empresa ................................................................................................. 12 
5.1.1. Misión ..................................................................................................................................... 12 
5.1.2. Visión ...................................................................................................................................... 12 
5.1.3. Política de Calidad ............................................................................................................... 12 
5.1.4. Logo de la Empresa ............................................................................................................. 12 
5.1.6. Descripción del área: Unidad de Biotecnología (UBT) ................................................... 14 
VI.  ALCANCES Y LIMITACIONES ............................................................................................. 15 
VII.  MARCO TEORICO .................................................................................................................. 16 
7.1 El banano ................................................................................................................................... 16 
7.1.1 Países productores de plátanos y banano ........................................................................ 16 
7.1.2 Valor nutricional del banano ................................................................................................ 18 
7.2 El hongo Mycosphaerella fijiensis .......................................................................................... 19 
7.2.1. Distribución de la Sigatoka negra ...................................................................................... 20 
7.2.2. Desarrollo de los síntomas de infección de la Sigatoka negra ..................................... 21 
7.2.3. Ciclo de vida de Mycosphaerella fijiensis ......................................................................... 22 
7.3 Protoplastos ............................................................................................................................... 23 
7.4 Pared celular fúngica ................................................................................................................ 23 
7.5 Componentes de la Pared Celular ......................................................................................... 24 
7.5.1 Manoproteínas ....................................................................................................................... 24 
7.5.2 Quitina ..................................................................................................................................... 25 
7.5.3 Glucanos ................................................................................................................................. 25 

2 
 
   

7.6 Criopreservación ....................................................................................................................... 26 
7.6.1 Factores que afectan la criopreservación .......................................................................... 27 
7.7 Crioprotectantes ........................................................................................................................ 27 
7.7.1 Crioprotectantes penetrantes .............................................................................................. 28 
7.7.2 Crioprotectantes no penetrantes ......................................................................................... 29 
7.8 Métodos de criopreservación de protoplastos...................................................................... 29 
VIII.  DIAGRAMA EXPERIMENTAL ............................................................................................... 33 
IX.  MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 34 
9.1 Material fúngico ......................................................................................................................... 34 
9.2 Cultivo del hongo en medio PDB ........................................................................................... 34 
9.3 Digestión enzimática de micelio ............................................................................................. 34 
9.4 Lavado de la digestión ............................................................................................................. 34 
9.5 Cuantificación de protoplastos ................................................................................................ 35 
9.6 Efecto de crioprotectantes en la criopreservación de protoplastos .................................. 35 
9.7 Tinción vital (viabilidad celular) ............................................................................................... 35 
9.8 Generación de protoplastos .................................................................................................... 36 
9.9 Cuantificación de protoplastos regenerados ........................................................................ 36 
X.  RESULTADOS ............................................................................................................................. 37 
10.1 Material biológico .................................................................................................................... 37 
10.2 Crecimiento del hongo Mycosphaerella fijiensis cultivado en medio líquido (PDB) ..... 37 
10.3 Digestión enzimática .............................................................................................................. 38 
10.4 Producción de protoplastos del hongo Mycosphaerella fijiensis ..................................... 38 
10.4 Tinción vital (viabilidad celular) ............................................................................................. 39 
10.5 Regeneración de protoplastos .............................................................................................. 40 
XI.  DISCUSIÓN .............................................................................................................................. 44 
XII.  CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES ........................................................................... 45 
XIII.  BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 46 
 

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LISTA DE CUADROS
Cuadro Página

Cuadro 1. Distribución de Musáceas en México (Vásquez., et al 2005). ................................... 17 

Cuadro 2. Valor nutritivo de la fruta del plátano (Vásquez., et al 2005). .................................... 18 
Cuadro 3. Estadios del desarrollo de la enfermedad de Mycosphaerella fijiensis (Fouré 1985).
 ................................................................................................................................................................ 21 
Cuadro 4. Crioprotectantes usados en la criomicrobiología (Zdenek Hubaek, 2003). ............. 28 

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LISTA DE FIGURAS

Figura Página

Figura 1. Logo del centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C………………..12

Figura 2. Organigrama de CIY…………………………………………………………….13
Figura 3. Estructuras de reproducción en Mycosphaerella fijiensis : A) Estructura
asexual; B) Estructura de reproducción sexual (Merchán, 1997) .............................. 20
Figura 4. Ciclo de Vida de M. fijiensis. Modificada de Bennett y Arneson (2003)...... 22
Figura 5. Esquema de la pared celular (Panton, 2008). ............................................ 24
Figura 6. Morfología del hongo M. fijensis cultivado en un medio solido PDA después
de cuatro semanas de cultivo .................................................................................... 37
Figura 7. Producción de micelio de M. fijensis en media liquido PDB ....................... 38
Figura 8. Digestión enzimática. ................................................................................. 38
Figura 9. Protoplastos observados n el microscopio Nikon Eclipse (20X), A)
protoplastos y pequeñas cantidades de hifas parcialmente digeridas sin ningún
lavado, B) protoplastos de calidad lavado con OM ................................................... 39
Figura 10. Protoplastos observados con el microscopio Nikon Eclipsé E200 (20x)
para determinar viabilidad celular con (FDA) ............................................................ 40
Figura 11. Protoplastos regenerados después de 4 semanas de crioperservación a
80°C. En medio "soft agar": A) Tratamiento 1 , B)Tratamiento 2, C) Tratamiento 3, D)
Control sin crioprotectante......................................................................................... 41
Figura 12. Regeneracion de protoplastos de cuatro semanas de criopreservación A)
Primera repetición. B) Segunda repetición. C) Tercera repetición.  Primer tratamiento:
20 % Dimetilsulfóxido DMSO + 1 M sorbitol. Segundo tratamiento: 10 %
Polivinilpirrolidona PVP + 2 M sorbitol. Tercer tratamiento: 10 % Dimetilsulfóxido +
20% glucosa. Control sin crioprotectante………………………………………………...42

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LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviaturas Significado

SN Sigatoka Negra

DMSO Dimetilsulfóxido

PEG Polietilenglicol

PVP Polivinilpirrolidone

PROH Propanidiol

EG Etilenglicol

PDA Papa dextrosa agar

PDB Caldo de papa dextrosa,

OM Medio osmótico

FDA Diacetato de fluoresceína

PBS Tapon Fosfato salino

ml Mililitros

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I. INTRODUCCIÓN

El banano es una planta herbácea, monocotiledónea adaptada a regiones

tropicales y subtropicales (Arosemena, 2007). Sin embargo, este cultivo es afectado
por plagas y enfermedades producidas por hongos, parásitos, gusanos, virus, entre
otros factores, que limitan su producción. En la actualidad las enfermedades se
controlan por medio de aplicaciones de fungicidas  del grupo de los benzimidazoles,
triazoles, morfolinas y estrobilurinas que resultan muy costosas (Orozco-Santos,
1998). La enfermedad denominada Sigatoka Negra (SN) es causada por el hongo
Mycosphaerella fijiensis la cual provoca grandes pérdidas en plantaciones de
bananos a nivel mundial. Las plantas enfermas de SN presentan necrosis en las
hojas, reduciendo el área fotosintética y en consecuencia generando una maduración
prematura de los frutos, lo cual provoca pérdidas devastadoras en el cultivo.
En el CICY se realizan diversos proyectos encaminados al combate de la SN,
y para ello se ha aislado al hongo M. fijiensis para estudiarlo y conocer puntos
vulnerables para combatirlo. Una de las herramientas utilizadas para su estudio es la
transformación utilizando protoplastos. Sin embargo, para estos estudios se requiere
de grandes cantidades de protoplastos de calidad y ajustados a concentraciones
determinadas por lo que se requiere que estén disponibles para cada ensayo. La
preparación de estos consume gran parte del tiempo del experimento y no siempre
se obtiene la cantidad y la calidad deseadas.

En la actualidad solamente existen pocos datos experimentales que ofrecen

información sobre criopreservación de protoplastos de hongos. No obstante, los
protoplastos son utilizados en los métodos de transformación más comunes de los
hongos como la electroporación y por polietilenglicol (PEG), para sus estudios en el
laboratorio.
La criopreservación es la estabilización de las células a temperaturas
criogénicas, o estudio de la vida a bajas temperaturas, un aspecto aplicado en
criobiología. Los avances en la tecnología de criopreservación han llevado a la
búsqueda de nuevos o mejorados métodos que permitan el mantenimiento a bajas

7 
 
   

temperaturas de una variedad de tipos de células. Esta técnica está disponible para
la criopreservación de microorganismos, células de tejidos aisladas, pequeños
organismos multicelulares, y organismos a un más complejos, tales como embriones.
El proceso de criopreservación está clasificado de acuerdo a la velocidad de
congelamiento y descongelamiento, estos factores tienen un papel importante para la
preservación de células. Los métodos de criomicroscopia se utilizan para estudiar el
proceso de congelación y descongelación de los cultivos fúngicos. La
criopreservación depende en gran medida, de los agentes crioprotectores, los cuales
cumplen varias funciones durante el proceso de congelación. La elección de un
agente crioprotector depende del tipo de célula que se desea preservar. En la
actualidad, entre los más utilizados se encuentran el dimetilsulfóxido (DMSO) que
sirve para fomentar una mayor deshidratación de las células antes de la congelación
intracelular, el glicerol, que es un agente de selección que resulta menos tóxico para
la célula.
Con base en lo anteriormente expuesto, en el presente proyecto se generó un
método experimental para la criopreservación de protoplastos del hongo
Mycosphaerella fijiensis, con el objetivo de obtener protoplastos disponibles para la
realización de experimentos de transformación genética.

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II. PROBLEMÁTICA A RESOLVER

 

El cultivo de banano se enfrenta a diversas plagas y enfermedades, siendo la

SN la enfermedad foliar más limitante a nivel mundial, causada por el hongo M.
fijiensis. Hoy en día, en el grupo de la Dra. Blondy Canto Canché (UBT del CICY), se
realizan experimentos de transformación genética utilizando protoplastos del hongo
M. fijiensis. La producción de protoplastos consume gran parte del tiempo del
experimento y en ocasiones no se obtienen la cantidad y calidad requeridas para la
transformación. Contar con un stock de protoplastos de buena calidad y ajustados a
la concentración necesaria, listos para ser utilizados en cada evento de
transformación, permitirá ahorrar tiempo, homogeneizar y eficientizar los
experimentos de transformación. Por lo anterior, se propone establecer un método
experimental para la criopreservación de protoplastos de M. fijiensis.

III. JUSTIFICACIÓN
 

Actualmente, la transformación de especies de hongos es fundamental para el

estudio del comportamiento y función de genes. Diversos métodos de transformación
de especies de hongos son realizados a partir de protoplastos de calidad
“transformable” (Rodríguez y Schmoll, 2015). Los métodos de transformación más
comunes como la electroporación y polietilenglicol (PEG), entre otros, requieren de la
obtención de gran cantidad de protoplastos.

En el CICY, se estudia la interacción de planta-patógeno para contribuir al

combate a la SN, ocasionado en el banano por el hongo M. fijiensis; para tal fin, se
utiliza la estrategia de transformar al hongo para conocer genes “blanco”. Hoy en día,
en los experimentos de transformación del hongo se requiere gran cantidad de
protoplastos, estos protoplastos son producidos cada vez que se realiza un
experimento de transformación, lo que a su vez consume gran parte del tiempo del
experimento y a veces no se alcanza el número requerido de protoplastos. En este

9 
 
   

sentido, la criopreservación de protoplastos, resultaría de gran utilidad y eficiencia de

tiempo para la realización de los experimentos de transformación cada vez que se
requiera.

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IV. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

 Crio-preservar protoplastos del hongo Mycosphaerella fijiensis.

4.2. Objetivo particulares

 Obtener protoplastos de Mycosphaerella fijiensis.
 Evaluar el efecto de crioprotectantes en la criopreservación de protoplastos a
-80 °C.
 Evaluar la viabilidad y regeneración de los protoplastos criopreservados.
.

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V. Caracterización del área en que participó

5.1. Antecedentes de la empresa
El proyecto se realizó en el Centro de Investigación Científica de Yucatán,
A.C. (CICY, A.C.), ubicada en la Calle 43, N° 130, Colonia Chuburná de Hidalgo,
C.P. 97200.

El CICY encontró su origen en julio de 1980 por iniciativa de CONACYT, como

parte de los programas de descentralización de la actividad científica y tecnológica, e
inicialmente orientados hacia la búsqueda de soluciones tecnológicas a los
problemas regionales. (Castillo, 2010).

5.1.1. Misión
Realizar investigación científica, formar recursos humanos, divulgar
conocimiento, desarrollar y transferir tecnología e impulsar el desarrollo de la
sociedad en armonía con el medio ambiente.

5.1.2. Visión
Ser una institución líder, reconocida local, nacional e internacionalmente,
innovadora en la generación y aplicación del conocimiento en beneficio de la
humanidad.

5.1.3. Política de Calidad

Tender hacia la excelencia en la formación de recursos humanos, la
investigación y la transferencia de desarrollos tecnológicos, y la innovación, como
parte de su quehacer científico y tecnológico.

5.1.4. Logo de la Empresa

El logo oficial de Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Se
muestra en la figura 1.

Figura 1. Logo del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

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5.1.5. Organigrama del CICY

A continuación se muestra el organigrama del CICY (figura 2).

Tabla de significados de las

abreviaturas
PACYT: Parque Científico y Tecnológico.
UBT: Unidad de Biotecnología
UBBMP: Unidad de Bioquímica y Biología
Molecular de Plantas
URN: Unidad de Recursos naturales
UMAT: Unidad de Materiales
UER: Unidad Energías Renovables
UCIA: Unidad de Ciencias del Agua
OTT: Unidad de Transferencia de
Tecnología.
CADE: Consejo de Asuntos de
Estudiantes.
MEB: Microscopia Electrónica de Barrido.
GemBio: Grupo de Estudios Moleculares
Aplicados a la Biología

Figura 2. Organigrama de CICY. (http://www.cicy.mx/organo-interno-de/control/

organigrama).

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5.1.6. Descripción del área: Unidad de Biotecnología (UBT)

 

La biotecnología es una de las áreas de investigación científica prioritarias

para el desarrollo del país y de amplia expansión a nivel mundial. La Unidad de
Biotecnología (UBT) lleva a cabo proyectos de investigación creativos e innovadores
dirigidos a la manipulación y uso de seres vivos para producir bienes o servicios de
relevancia para la sociedad mexicana, la protección del medio ambiente y el
crecimiento económico del país.

La UBT ha logrado posicionarse como un grupo de investigación sólido que trabaja

principalmente en tres líneas de investigación:

 Agrobiotecnología
 Farmacobiotecnología
 Biotecnología de Combustibles Alternos

Todos los investigadores tienen el grado de doctor y participan de manera activa en

proyectos financiados, docencia, formación de recursos humanos a nivel de
licenciatura y posgrado, así como en publicaciones científicas de revistas de
reconocido prestigio nacional e internacional. Además, cuenta con un apoyo técnico
capacitado al más alto nivel.

Otra de las fortalezas de la UBT radica en la colaboración intrainstitucional con las

otras Unidades del Centro e interinstitucional que mantiene con diversos centros de
investigación de reconocido prestigio, tanto a nivel nacional como en el extranjero.
Tal es el caso del Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad
(LANGEBIO), el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y
Pecuarias (INIFAP), la Universidad Autónoma de Yucatán (UADY), el Instituto
Tecnológico de Mérida (ITM), el Instituto Tecnológico de Conkal (ITC), Instituto
Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT), University of Texas
(USA), North Carolina State University (USA), Queen Mary University of London
(UK), por mencionar algunos ejemplos. Asimismo, investigadores de la UBT forman
parte de consorcios internacionales para la secuenciación genómica de diferentes
organismos (http://www.cicy.mx/unidad-de-biotecnología/introducción).

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VI. ALCANCES Y LIMITACIONES

6.1. Alcances:

Dentro de los alcances de esta investigación está la de proporcionar una alternativa

en la problemática de generación de material biológico para experimentos, por medio
de mantener criopreservados protoplastos a un largo tiempo en temperaturas
criogénicas, para ser usados para diversas transformaciones genéticas. Estos
resultados fortalecerán los estudios científicos del agente causal de la SN. Esta
contribución será muy importante en los estudios interacción M. fijiensis-Musa.

6.2. Limitaciones:

Para la realización de este estudio, las principales limitantes presentadas fueron que,
el hongo M. fijiensis tiene un crecimiento lento, por lo tanto para, obtener suficiente
biomasa se requiere largo periodo de tiempo, cerca de un mes para tener 1 cm de
diámetro. Además, no se conocen los factores determinantes para tener una
concentración óptima de protoplastos, (edad de cultivo, número de resiembra, la
cepa); esto fue variable.

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VII. MARCO TEORICO

7.1 El banano
Los bananos y los plátanos son originarios del sureste Asiático, incluyendo el
norte de India y sur de China. En tiempos prehistóricos fueron introducidos en África,
después llevados a las Islas Canarias por las portuguesas y de ahí fueron
introducidos en el Nuevo mundo (Ecuador) en los años 200 A.C (Soto, 1998).
Los bananos son plantas herbáceas, perennes, comprendidas dentro de las
monocotiledóneas. Pertenecen a la familia Musáceae del orden Scitamineae. En el
caso de los plátanos, deriva de la combinación de dos especies progenitoras, Musa
acuminata (genoma A) y Musa balbisiana (genoma B) (Vázquez et al., 2005)
El banano es un frutal de regiones tropicales y subtropicales; esta planta
monocotiledónea está formado por un cormo o rizoma subterráneo, con un sistema
de raíces fibrosas, hojas, hijuelos, pseudotallos y flores. Las variedades de banano
varían de acuerdo a su tamaño, disposición y dimensiones de las hojas, morfología,
color del fruto, al tamaño del racimo y resistencia a enfermedades (Crane y Balerdi,
2005).

7.1.1 Países productores de plátanos y banano

Aproximadamente 10 millones de hectáreas de plantaciones de banano y
plátano se siembran al año y alcanzan una producción de 84 millones de toneladas
de fruta, de las cuales más del 10 % de frutas de banano y plátano se exportan a
nivel mundial (FAO, 2014 a).
Los países con mayor índice de producción de bananos son India, Filipinas,
China, Ecuador, Brasil, Indonesia, y. México se ubica a nivel mundial en los diez
países productores de banano (FAO, 2014 b).
En el continente americano, el banano se encuentra distribuido en la parte sur,
centro y norte de América. Los países latinoamericanos y del Caribe son los que
producen una mayor cantidad de exportación de banano en todo el mundo, siendo
Brasil el máximo productor (Vásquez., et al 2005).

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En México, las plantaciones de banano se localizan en las regiones tropicales

del Océano Pacífico y el Golfo de México. Los tres estados con mayor plantación de
banano son: Tabasco, Chiapas y Veracruz. El cuadro 1 muestra los principales
bananos y plátanos cultivados en México.

Cuadro1. Distribución de Musáceas en México (http://www.siap.gob.mx/cierre-de-la-

produccion-agricola-por-estado/,2013)

Región (Estado) Grupo taxonómicos Superficie (hectáreas)

Golfo de México:

Tabasco AAA, AABp, AA 10,654

Veracruz AAA, AABp 14,867

Oaxaca AAA, AABp, AAB 3,369

Pacífico sur:

Chiapas AAA, AABp 24,427

Pacífico centro:

Nayarit AAA, AAB, AABp, ABB 6,701

Jalisco AAA, AABp 2,872

Colima AAA, AABp, AAB, ABB, 4.981

AA

Michoacán AAA, AAB, AABp, ABB, 4,073

AA

Guerrero AAA, AABp, AAB 3,143

17 
 
   

7.1.2 Valor nutricional del banano

Como alimento, el banano es considerado unos de los cultivos más
importantes en el mundo, ocupando el cuarto lugar en el mundo y en México el 2o
lugar. Nutricionalmente es considerado un alimento altamente energético, con
hidratos de carbonos fácilmente asimilables y pobres en lípidos. El banano es rico en
tiamina, riboflavina, niacina, minerales, carbohidratos y aminoácidos (Cuadro 2). De
acuerdo al consumo, los bananos se comen de manera cruda o fresca y los plátanos
requieren ser cocinados (Vásquez et al., 2005).

Cuadro 2. Valor nutritivo de la fruta del plátano (Vásquez et al., 2005).

Composición de la pulpa Vitaminas Minerales

de plátano en 100 g

Calorías 80-100 Vitamina A 190 unidades Potasio 370 mg

Vitaminas 1.1 g Vitamina C 10 unidades Calcio 8 mg

Triptófano 13 unidades Vitamina E 100 mg Fósforo 26 mg

Treonina 38 unidades Vitamina K .45 unidades Magnesio 33 mg

Isoleucina 32 unidades Vitamina B-6 2 mg Sodio 1mg

Leucina 53 unidades Tiamina 0.05 mg Hierro 0.7 mg

Lisina 46 unidades Riboflamina 0,06 mg Cobre 0.11 mg

Fenilalanina 44 unidades Niacina 0.7 mg Magnesio 0.13 mg

Tirosina 29 unidades Folacina 28 mg Zinc 0.15 mg

Valina 45 unidades “Ác.” pantoténico 0.25 Selenio 0.95 mg

mg

Metionina 22 unidades Biotina 4.4. mg Cromo 0.015 mg

Grasas 0.2 g

Fibras naturales 0.5 g

Agua 75%

18 
 
   

7.2 El hongo Mycosphaerella fijiensis

El género Mycosphaerella comprende más de 10,000 especies, muchas de las
cuales son fitopatógenos que atacan a cultivos agrícolas, por ejemplo,
Mycosphaerella fijiensis y musicola que atacan al banano, Mycosphaerella
graminicola causa daños al trigo, Mycosphaerella citri ataca a los cítricos,
Mycosphaerella fragaria que infecta a las fresas, entre otras (Kema et al., 2007).
El hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis es el agente causal de la enfermedad
conocida como Sigatoka negra que afecta al banano y plátano.
Este hongo es un hemibiótrofico, ya que durante su ciclo de vida en el
hospedero presenta dos comportamientos (biotrófico, necrotrófico). La fase biotrófica
ocurre cuando las esporas han germinado en la superficie abaxial de las hojas a
partir de 3-4 semanas, en la cual establece una relación en la que toma nutrientes sin
causar daños a la planta. En la fase necrotrófica el hongo tiende a ser más agresivo,
devastando el tejido vegetal del banano y ocasionando la muerte celular mediante
toxinas (Orozco-santos et al., 2001).
Clasificación taxonómica de Mycosphaerella fijiensis, (Herrera y Ulloa, 1990).
Reino Fungi
División Ascomycotina
Subdivisión Ascomycotina
Clase Loculoascomycetes
Orden Dothideales
Familia Dothideales
Género Mycosphaerella

Especie Mycosphaerella fijiensis

El ciclo biológico de Mycosphaerella fijiensis produce dos tipos de

fructificaciones los conidios y las ascosporas (Figura 2). Los conidios (fase asexual o
fase imperfecta), se producen en la superficie abaxial de las hojas, son más
abundantes en los estadios dos, tres y cuatro de los síntomas de la enfermedad. Las

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ascosporas son provenientes de ascas producidas en peritecios durante la fase

sexual o fase perfecta. 
 

A B

      
Figura 3. Estructuras de reproducción en Mycosphaerella fijiensis: A) Estructura
asexual; B) Estructura de reproducción sexual (Merchán, 1997).

7.2.1. Distribución de la Sigatoka negra

La Sigatoka negra fue descubierta en los año 1963, en la costa sudeste de Viti
Levu en las islas Fiji (Rhodes, 1964). Luego se detectaron en Asia y en el Pacífico.
En el continente americano se detectó en el año 1972 en Honduras (Stover y
Dickson, 1976) y de allí la Sigatoka negra se extendió al resto de los países
(Fullerton y Stover, 1990).
En México, la Sigatoka negra se detectó en 1981, en los estados de Chiapas y
Tabasco (Contreras, 1983). Luego se manifestó en el estado de Colima en el año
(1989) y más tarde en Michoacán, Jalisco y Guerrero. En 1994, en Nayarit (Orozco-
Santos et al., 1996). Actualmente se encuentra distribuido en todos los cultivos de
plátanos y banano en México (Marín et al., 2003).

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7.2.2. Desarrollo de los síntomas de infección de la Sigatoka negra

La Sigatoka negra ataca directamente a las hojas del banano y plátano (Musa
spp); se caracteriza por presentar rayas y manchas necróticas. Los síntomas que
ocasiona a las hojas fueron detallados en los años 1969 por Meredith y Lawrence.
Posteriormente, Fouré (1985) clasificó en 6 etapas los síntomas de la enfermedad de
la Sigatoka negra (Cuadro 3). El desarrollo de la enfermedad en las hojas aparecen 2
a 3 semanas después de la penetración por la estoma (Craenen, 1998).

Cuadro 3. Estadios del desarrollo de la enfermedad de Mycosphaerella fijiensis

(Fouré 1985).

NOMBRE ETAPAS DESCRIPCIÓN

Pequeños puntos o pizcas despigmentadas, de

Pizca color blancuzco o amarillo en el envés de las
hojas.

Rallas Son rayas o estrías de color café-rojo en el

envés de las hojas.

Estrías Las rayas o estrías aumentan en grosor y

longitud. Son de color café oscuro.

Manchas Las manchas aparecen de color café en el

envés de la hoja y color negro en el haz de la
hoja.

Manchas Manchas elípticas negras en todo en el envés

totalmente negras de la hoja, rodeado de un halo amarillento y
empieza a aplanarse.

Necrosis El centro de la mancha se seca de color cris

claro, rodeado por un anillo de color negro.

21 
 
   

7.2.3. Ciclo de vida de Mycosphaerella fijiensis

M. fijiensis tiene la capacidad de infectar las hojas del banano con ascosporas
y conidios, desplazándose a través del viento y lluvias, las cuales son las principales
fuentes de infecciones (Marín et al., 2003; Meredith y Lawrence, 1969; Stover, 1980).
Las ascosporas y conidios germinan en la superficie de las hojas del banano (Figura
3), en condiciones favorables de humedad, introduciéndose a través de las estomas
e invadiendo el tejido intercelular de la hoja del banano (Meredith Lawrence, 1969).
En la fase sexual de M. fijiensis las ascosporas germinan en un periodo de 2 a
6 horas formando tubos germinativos que se extiende y ramifican buscando estomas.
De este modo inicia el proceso de penetración que tarda 2 a 3 días si las condiciones
son favorables (Belalcázar et al., 1991). Mientras que los conidios, de origen asexual,
se producen sobre los conidióforos y se desprenden desde el estadio 2 al 6, en la
escala de Fouré (Augura - Cenibanano, 2007).

 
Figura 4. Ciclo de Vida de M. fijiensis. Modificada de (Bennett y Arneson, 2003).

22 
 
   

7.3 Protoplastos
Los protoplastos son células desnudas, sin la pared celular, únicamente
rodeados por la membrana plasmática; son aislados por eliminación mecánica o
enzimática de la pared celular. Tienen la capacidad de regenerar su pared celular,
formar colonias e incluso regenerar al organismo completo.
Una de las aplicaciones fundamentales de los protoplastos es su utilización en
diferentes manipulaciones genéticas. Además sirven como herramienta en
investigación fisiológica, biofísica y bioquímica.
En 1891 el Dr. Krierchle aisló por primera vez protoplastos mediante
tratamiento mecánicos a partir de cebolla, luego en el año 1960 el investigador
Cocking estableció el protocolo para el aislamiento de protoplastos en raíces de
tomate por método enzimática utilizando celulosa del hongo Myrothecium uarrucaria.
El primer aislamiento de protoplastos por actividad enzimática se realizó en células
de levaduras utilizando jugo gástrico de caracol, en el año 1996 (Purohit, 2012).
Por otro lado, no es lo mismo obtener protoplastos de células vegetales que
de hongos. Esto se debe a que contienen diferentes compuestos en la pared celular,
por lo que requiere diferentes enzimas para degradarlas; las más utilizadas en
plantas son: celulasas y en el caso de los hongos: Driselasa, enzimas líticas
(Ovando-Chacón y Waliszewsk, 2014).

7.4 Pared celular fúngica

La pared celular es una matriz pericelular de las células bacterianas, plantas,
algas y hongos, y se localiza en el exterior de la membrana plasmática.
La pared celular fúngica es una estructura rígida formada por multicapas y una
coraza protectora dinámica (Kantún-Moreno et al., 2012). Le brinda a la célula fuerza
mecánica para soportar los cambios provocados por el medio ambiente, protección
de otros microorganismos, mantiene la forma de las células, e interviene en el
apareamiento y funciona como el centro de señalización para activar vías de
traducción de señales dentro de la célula fúngica (Free et al., 2013).

23 
 
   

La mayoría de las paredes celulares de los hongos consisten en una

estructura compleja formada por cinco componentes: 1,3-β-glucano, glicoproteínas
1,6-β-glucano, 1,3-α-glucano y quitina (Figura 4). Existe una gran variabilidad en su
composición (proporción de estos cinco componentes) y organización.

 
Figura 5. Esquema de la pared celular fúngico. Los polisacáridos de la pared están
representados en diferentes colores; quitina (rojo) ß-1,3-D-glucano (verde), ß-1,6-D-
glucano (azul) y mananos (negro). Las proteínas están representadas por
rectángulos de color naranja. Las subunidades de la ß-1,3-D-glucano sintetasa en la
membrana plasmática están coloreadas en verde. (Pontón, 2008).

7.5 Componentes de la Pared Celular

7.5.1 Manoproteínas
Las manoproteínas determinan la porosidad y regulan el transporte de las
proteínas del espacio periplasmático y la entrada de macromoléculas del ambiente
(Damveld et al., 2005); Muchas de las proteínas funcionan integralmente, en
conjunto, en una matriz entrecruzada importante para la biogénesis de la pared; otras

24 
 
   

proteínas de pared han demostrado diversas funciones tales como sensores de la

pared, adhesinas, adquisición de hierro, destoxificación de radicales libres de
oxígeno, participan en procesos como el apareamiento y floculación (Free et al.,
2013).
Las manoproteínas pueden dividirse en tres tipos: manoproteinas extraíbles
con dodecil sufato de sodio, extraíbles mediante agentes reductores y extraíbles con
glucanasa (Hamada et al., 1998). En estas últimas se pueden encontrar dos tipos
distintos: las proteínas de pared acoplado a glicosil-fosfatidilinositol (GPI-CWPS) y las
proteínas Pir (Pir-CWPS). Las primeras pueden ser específicamente liberadas
mediante HF-piridina (Klis et al., 2010), y son el grupo más abundante. Estas
proteínas se encuentran unidas al β-1,3-glucano a través de una molécula de β-1,6-
glucano. Las proteínas Pir, están presuntamente unidas directamente al β-1,3-
glucano vía unión sensible a álcali (Vink, 2003). El tercer tipo de proteínas
detectadas en la pared celular tiene ausente el péptido señal de secreción y
probablemente sean exportadas por una ruta alternativa, poco frecuente. Dentro de
estas proteínas se encuentran: enolasas, aconitasas, piruvato cinasas, fosfoglicerato
mutasas, metionina sintasa, entre otras (Martínez et al, 2004).

7.5.2 Quitina
La quitina es un biopolímero lineal con carga neutra, formada por monómeros
de N-acetilglucosamina unido por enlaces β-(1,4)  (Bueter et al., 2013). La quitina es
una parte esencial del esqueleto de carbohidratos de la pared fúngica y su síntesis
es realizada por las enzimas quitina sintasas asociadas a la membrana plasmática.
Esta enzimas usan como sustrato UDP-N- acetilglucana, localizado en la parte de la
membrana adyacente al (Free et al., 2013).  

7.5.3 Glucanos
El Glucano es el principal polisacárido de la pared celular; representa el 50-
60% de ella. Este polímero posee la función de proteger a la célula de los
mecanismos de estrés biótico y abiótico. De acuerdo al tipo de unión con otros

25 
 
   

componentes de la pared se dividen en α- Glucanos y β- Glucanos. Estos polímeros

son insolubles en agua y están hechos de unidades de glucosa unidas a través de
enlaces 1,3 y están presentes en la mayoría de las paredes celulares fúngicas (Ruíz-
Herrera, 1991). La pared celular está constituida con un gran número de β-1,3-
Glucano, entre 30-50 % del glucano total. El β-1,3-glucano es sintetizado por β-1,3-
Glucano sintasa, una enzima asociada a la membrana plasmática mediante múltiples
dominios transmembranales.

7.6 Criopreservación
La criopreservación es el mantenimiento de la viabilidad y funcionalidad celular
a bajas temperaturas. Los avances en la tecnología de criopreservación están
disponibles para la preservación por un largo periodo de tiempo de materiales
biológicos como por ejemplos tejidos, células de tejidos aislados, pequeños
organismos multicelulares y organismos más complejos, tales como embriones y
actualmente para ácido nucleico y proteínas (Woods et al., 2004).
El procesos de criopreservación incluye la congelación a temperaturas de -80
ºC y alcanzando hasta -196 ºC con él fin de mantener por largo tiempo en
condiciones de vida suspendida. La criopreservación depende mucho de los agentes
crioprotectantes, estos cumplen funciones importantes durante el proceso de
congelación.
Los métodos de criopreservación pueden ser clasificados de acuerdo a su
velocidad de congelamiento:
Una velocidad de congelación lenta intenta mantener un delicado balance
entre varios factores, los cuales pueden resultar en lesiones celulares provocadas
por la formación de cristales de hielo, los choques osmóticos, el efecto tóxico de los
crioprotectantes, la concentración de electrolitos intracelulares, los daños por
enfriamiento y las alteraciones de los organelos intracelulares, el citoesqueleto o el
contacto entre las células (Massip et al., 1995, Dobrinsky, 1996, Martino et al., 1996).
La vitrificación es un método convencional de criopreservación; es un proceso
físico de solidificación para conservar órganos, tejidos, y embriones. La vitrificación

26 
 
   

es una técnica de congelación ultrarrápida basada en el contacto directo entre la

solución de vitrificación que contiene los agentes crioprotectores con las células y el
nitrógeno líquido. Una definición física de la vitrificación es la solidificación de una
solución a baja temperatura sin que éste llegue a cristalizar, debido a una alta
viscosidad (Rall y Fahy, 2007).

7.6.1 Factores que afectan la criopreservación

Entre los factores que afectan la criopreservación se encuentran: El tipo de
microorganismo, la elección del agente crioprotectante adecuado para la célula,
temperatura de incubación, medio de crecimiento, pH, composición de las células,
densidad a la congelación, velocidad de enfriamiento, tiempo y temperatura de
almacenamiento, el contenido de agua y lípidos en la célula; esto factores deben ser
examinados para la supervivencia de las células. (Brian, 1995).

7.7 Crioprotectantes
Un crioprotectante es un compuesto químico hidrosoluble y de baja toxicidad
que permite el almacenamiento de tejidos o de células por largo tiempo en
temperaturas bajas (Day y Mclellan, 1995). Bioquímicamente son clasificados en tres
tipos de crioprotectores, que son los alcoholes, azúcares y el dimetilsulfóxido.
Los tipos de crioprotectantes utilizados principalmente en la criomicrobiología
son las siguientes: dimetilsulfóxido (Me2SO), metanol, etilenglicol, propilenglicol,
albúmina de suero y el suero (Cuadro 4), y con menos éxito polivinilpirrolidona (PVP),
glicerol, sacarosa, sorbitol, dextrano, extracto de levadura, sacarosa, glucosa,
metanol, peptona, suero de sangre, extracto de malta. Dependiendo del tipo de
organismo y célula, algunos de estos podrían resultar tóxicos para algunos. El que se
considera universal y con magníficos resultados es el Me2SO; combinaciones entre
dos o más de estos crioprotectantes también han aumentado la eficiencia de la
criopreservación (Hubalék, 2003).
Los crioprotectantes también se pueden clasificar en agentes penetrantes y no
penetrantes de acuerdo a la permeabilidad celular.

27 
 
   

Cuadro 4. Crioprotectantes usados en la criomicrobiología (Hubaek, 2003).

Compuesto Formula Peso Mol

Sulfóxidos
Dimetilsulfóxido (CH3)2SO 78.13
Alcoholes monohidrico y sus derivados
Metanol CH3OH 32.04
Etanol C2H5OH 46.07
Polivinil alcohol [CH2CHOH]x 2–12 x 104
Dioles y sus derivados
Etilenglicol (CH2)2(OH)2 62.07
Propilenglicol CH3CH2CH(OH)2 76.09
Trietilenglicol CH2(CH2OH)2 76.09
Dietilenglicol O(CH2)4(OH)2 106.12
Polietilenglicol H[OCH2CH2]xOH 2–400 x 102
Polipropilenglicol H[OCHCH3CH2]x)OH 4–40 x102
Polietilenoxido (–CH2CH2O–)x 3–80 x 105
Trioles
Glicerol (CH2)2CH(OH)3 92.09
Polialcoholes
Manitol, sorbitol, dulcitol C6H8(OH)6 182.17
Monosacaridos
Glucosa C6H12O6 180.16
Xilosa C5H10O5 150.13
Disacaridos
Sacarosa C12H22O11 342.3
Lactosa, maltosa C12H22O11 .H2O 360,31
Trehalosa C12H22O11.2H2O 378.33

7.7.1 Crioprotectantes penetrantes

Estos agentes penetrantes son de bajo peso molecular y permeable a través
de la membrana celular. Los que penetran fácilmente incluyen metanol, etanol,
etilenglicol (EG), dimetilformamida, metilacetamida, dimetilsulfoxido (DMSO y el
glicerol, propanidiol (PROH).

El DMSO es un solvente bipolar aprótico, hidrosoluble, de bajo peso molecular

que accede rápidamente en la membrana celular, y fue descubierto en el año 1959
por Loveloch. Actualmente es considerado el mejor crioprotector, porque sirve para
fomentar una mayor deshidratación de las células antes de la congelación
intracelular (Farrant, 1980).

28 
 
   

7.7.2 Crioprotectantes no penetrantes

Los agentes no penetrantes son sustancias de alto peso molecular y a velocidades
rápidas de congelación promueven la deshidratación celular. Además funcionan
mejor con algunas combinaciones de agentes penetrantes como: glucosa, sacarosa,
dextrosa y dextrano. Estos agentes crioprotectantes son polímeros que forman
puentes de hidrógeno con el agua, lo que permite reducir la actividad de agua en la
célula (Ávila et al., 2006).

7.8 Métodos de criopreservación de protoplastos

Langis y col., (1990), desarrollaron un procedimiento para la vitrificación de
protoplastos del mesófilo de hojas de centeno (Secale cereale L). El procedimiento
implicó: A) Tratamientos de los protoplastos mediante concentraciones de 1.5 M, 1.7
M y 2.0 M de etilenglicol (EG); B) Deshidratación de los protoplastos en 0.7 M de EG
+ 0.88 M Sorbitol + 6 % Suero de albumina de bovino; C) Introducidos en nitrógeno
líquido; D) Recuperación de los protoplastos que fueron introducidos en nitrógeno
líquido y la remoción de la solución vitrificadora. Los resultados que obtuvieron de
sobrevivencia de protoplastos fue variable, de 34 a 47 %.

Por otra parte, en estudios de Musa acuminata ssp (AA) se aislaron

protoplastos de suspensiones celulares iniciadas a partir de callos de semillas
inmaduras de diferentes cultivares de Musa acuminata ssp. (AA) y cocultivaron a una
alta densidad para formar de nuevo callos. La adición de DMSO al cultivo no afectó
la proliferación de las células madre ni el crecimiento posterior de callos (Panis et al.,
1993).

También se ha realizado un método reproducible para la criopreservación para

un solo genotipo derivado de suspensiones celulares embriogénicas de diferentes
especies de gramíneas forrajeras de los géneros Festuca y Lolium: F.arundinacea,
F.pratensis, F.rubra, L. multiflorum, L. perenne y L. × boucheanum. El protocolo
permitió una disponibilidad a largo plazo de cultivos embriogénicos en suspensión
altamente regenerables los cuales fueron materiales crucial para trabajos de
transformación con biolística y como una fuente de protoplastos totipotentes. La
evaluación de diferentes parámetros tales como la composición del crioprotector, la

29 
 
   

pre-congelación, la adaptación osmótica, los regímenes de enfriamiento y de lavado

después de la descongelación de las células cultivadas embriogénicas, los
crioconservados, han llevado a mejorar los procedimientos para el almacenamiento
de las células en nitrógeno líquido. Estos procedimientos permitieron regenerar del
40-70% de las células crioconservadas después de la descongelación, para
mantener su carácter embriogénico y para regenerarse en plantas maduras.

Cornejo y colaboradores, (1995) estudiaron la criopreservación a partir de

callos de arroz que se puedan regenerar en plantas y protoplastos con rendimientos
competentes después de transformación genética. Se observó que la
criopreservación no afecta la capacidad de las células de arroz para integrar y
expresar genes foráneos. Se utilizó como crioprotectante una solución compuesta de
2 M de sacarosa, 1 M de glicerol, 1 M DMSO y 0.03 M de prolina (solución CPS). Las
líneas de callos congelados después de 4 meses en cultivo conservaron la capacidad
de crecer mejor y el rendimiento de protoplastos fue mucho más notorio que los que
fueron congelados después de 8 meses en cultivo, lo que indica que el tiempo en
cultivo previo a la congelación es importante,

En otro estudio con arroz (Oryza meyeriana) se demostró la capacidad de

regeneración de las células mediante la criopreservación. Los protoplastos se
aislaron de la suspensión celular y se cultivaron hasta obtener plantas. Este es el
primer informe sobre la regeneración de plantas a partir de protoplastos del
germoplasma O. meyeriana resistente a las enfermedades, que pueden servir como
punto de partida para la fusión de protoplastos para transferir el gen de resistencia en
el género Oryza. Se utilizó como crioprotectante 10 % DMSO. (Guangcun et al.,
1997).

En células de las plantas Pogonatum y Polytrichum, ambas especies fueron

desecadas y criopreservadas, aunque Pogonatum fue ligeramente más tolerantes a
la desecación, ambas fueron crioconservadas con un índice del 90% de
supervivencia. Se observó que los azúcares trehalosa y sacarosa proporcionaron
efectos protectores durante la desecación de los protoplastos, mientras que el
manitol y la glucosa fueron menos efectivos cuando los protoplastos de Pogonatum

30 
 
   

se desecaron y directamente se conservaron a diversas temperaturas. Con base en

los experimentos realizados en este estudio las células Pogonatum sobrevivieron a la
desecación tanto rápida como lenta, mientras que las células Polytrichum sólo
toleraron la desecación lenta. Las diferencias cualitativas en la tolerancia a la
desecación entre células Pogonatum y Polytrichum se asocia con la velocidad de
deshidratación (Yamazaki et al., 2009)

Liu et al., en 2004, por medio de vitrificación con un tratamiento de 10% w / v

DMSO, 30% w / v de glicerol, 10% de sacarosa en agua de mar, permitió que los
protoplastos del alga roja Porphyra yezoensis alcanzaran una viabilidad de 66. 5 %
después de la criopreservación. Aunque el rebrote de protoplastos criopreservados
mostró una fase de retardo de 2-3 días, y se recuperó por completo hasta 20 días
después de la descongelación, el patrón de crecimiento fue el mismo que el de los
protoplastos no crioconservados.

En otro estudio con P. yezoensis conchocelis se evaluó la combinación de 6

crioprotectores: DMSO con etilenglicol (EG), propilenglicol (PEG), sorbitol, glicol y
sacarosa. Los mayores índices de recuperación fue con 10 % de DMSO con 0.5 M
etilenglicol alcanzando un (86.38 %) y con 10 % DMSO + 30 % glicerol + 10 %
sacarosa fue un (76.06 %) (Zhou-Dai, 2007).

En caso del hongo Pseudozyma flocculosa se obtuvo por primera vez un eficiente
protocolo específico para la obtención y la regeneración de protoplastos de esporas
de este moho descrito como agente de biocontrol. Los protoplastos fueron
criopreservados con diferentes tratamientos de las cuales son las siguientes 0.8 M
KCL, 0.8 M sacarosa, 0.8 M glucosa, 0.8 M sorbitol y 0.8 M manitol; para la
regeneración de protoplastos se utilizó el medio YMPDA. La digestión enzimática
óptima fue en la combinación 0.5 % novozym 234, 5 % glucanex preparados en 0.6
M KCL y 0.1 M buffer citrato. La tasa de regeneración de protoplastos en un medio
YMPDA resulto muy eficiente; cerca de 75 % de protoplasto vivos con el tramiento
0.8 de sacarosa (Chen – Belanger, 2000).

31 
 
   

Con base en todo lo anterior, en este trabajo el interés es establecer un

procedimiento experimental para la criopreservación de protoplastos del hongo
Mycosphaerella fijiensis.

32 
 
   

VIII. DIAGRAMA EXPERIMENTAL

Cultivo in vitro Mycosphaerella fijiensis.

Crioprotectante

Producción de protoplastos
1: 20 % Dimetilsulfóxido 
(DMSO) + 1 M sorbitol 
2: 30 % Polivinilpirrolidona  Almacenamiento de protoplastos
(PVP) + 2 M sorbitol  a – 80°C.
3: 10 % Dimetilsulfóxido 
(DMSO) + 20 % glucosa 
Tinción vital (FDA)

Regeneración protoplastos en
medio (SOFT) agar

Cuantificar colonias regenerados

33 
 
   

IX. MATERIALES Y MÉTODOS

9.1 Material fúngico

Se utilizó la cepa C1233 del hongo Mycosphaerella fijiensis, la cual es parte de
la colección del CICY.

9.2 Cultivo del hongo en medio PDB

En condiciones asépticas se cortaron fragmentos de 1 cm2 del hongo M.
fijiensis crecido en placas con medio PDA (agar papa dextrosa, SIGMA) de un mes
de cultivo. Este fragmento de micelio fue macerado en morteros que contenían 5 ml
del medio de cultivo PDB (caldo de papa dextrosa, SIGMA) y se inoculó a 50 ml del
mismo medio en matraz Erlenmeyer de 250 ml. Los cultivos se incubaron a
temperatura ambiente y en agitación constante a 100 rpm durante 12 días en
incubadora (SHAKER).

9.3 Digestión enzimática de micelio

Transcurrido el tiempo de crecimiento del hongo, se cosechó la biomasa en
tubos Falcon estériles y se centrifugó a 4000 rpm durante 12 minutos, se retiró el
sobrenadante que contenía el medio líquido y se lavó el micelio con medio osmótico
(OM) por dos veces. Se adicionaron las enzimas (Driselase + lysing enzime (Sigma),
10 mg/ml c/u, en medio OM, se esterilizó por filtración y se mezcló con el micelio. Se
incubó en agitación a 70 rpm, oscuridad, 30 °C por toda la noche.

9.4 Lavado de la digestión

Transcurrido el tiempo de la digestión se filtró a través de dos capas de gasa y
luego se filtró a través de una capa de miracloth. En seguida, se distribuyó en tubos
Eppendorf de 2 ml o de 1.5 ml y se centrifugó a 6500 rpm, 4 °C por 12 minutos. Se
colectaron los protoplastos de la capa superficial o la pastilla en diferentes tubos
Eppenderf. Después se lavó con OM dos veces a 6500 rpm, 4 °C por 12 minutos y se
contabilizo en la cámara de Neubauer en el microscopio óptico (NIKON ECLIPSE).

34 
 
   

9.5 Cuantificación de protoplastos

Se tomó una alicuota de 20 l de protoplastos y se diluyó 1:20. Se observaron
utilizando el microscopio óptico (NIKON ECLIPSE E200) y se cuantificaron con la
cámara de Neubauer. Se contaron y se ajustaron a 1x107 protoplastos/ml. Se
alícuotaron de 100 l en tubos Eppendorf de 1.7 ml. La fórmula que se emplea para
el conteo de protoplastos es.

Fórmula:

( ) (Dil) = protoplastos /l x 1000 = protoplastos/ml

0.02

Donde x es el número de protoplastos.

Se adicionaron los crioprotectantes a cada tubo y los protoplastos se

conservaron a -80 °C en un ultracongelador durante diferentes semanas, después de
los cuales los protoplastos crioconservados fueron descongelados para la
cuantificación de viabilidad y regeneración.

9.6 Efecto de crioprotectantes en la criopreservación de protoplastos

Se evaluaron tres tratamientos:

 Primer tratamiento: 20 % Dimetilsulfóxido DMSO + 1 M sorbitol

 Segundo tratamiento: 10 % Polivinilpirrolidona PVP + 2 M sorbitol
 Tercer tratamiento: 10 % Dimetilsulfóxido + 20% glucosa

Estos tratamientos fueron esterilizados por filtración utilizando un filtro de 0.45,

luego se le adicionaron de manera independientes a los protoplastos, se mezclaron
suavemente hasta homogeneizar y se conservaron en el ultracongelador a –80 °C.

9.7 Tinción vital (viabilidad celular)

La tinción vital se realizó por el método de diacetato de fluoresceína (FDA) en
el tampón fosfato salino (PBS) de acuerdo a (Kenneth y Sentf, 1995). Para
determinar la viabilidad de los protoplastos se preparó una solución stock de 5 mg/ml
de FDA en acetona y de aquí se preparó una solución de trabajo mezclando 8 l de
35 
 
   

FDA más 1 ml de PBS. Se mezcló en una proporción 1:1 con los protoplastos y se
observó con un microscopio óptico de epifluorescencia utilizando un filtro GFP de
390-509 nm. Esto permite ver la luminiscencia celular y determinar la viabilidad
celular.

9.8 Regeneración de protoplastos

La regeneración de protoplastos se realizó tomando los protoplastos
guardados en tubos Eppendorf criopreservados a -80 °C con cada uno de los tres
tratamientos, junto con el control (sin crioprotectante). Los protoplastos
criopreservados fueron descongelados en hielo y en seguida fueron mezclados en 15
ml de soft agar (PDB + sorbitol + agar) atemperizado a 50 °C, plaqueados en 3 cajas
Petri para cada tratamiento, incubados a 21 °C y fotoperiodo 16/8 durante 21 días
para su regeneración.

9.9 Cuantificación de protoplastos regenerados

Después de 21 días de incubación se observaron y contaron las colonias
regeneradas. Para la cuantificación de los protoplastos regenerados se utiliza el
microscopio estereoscópico óptico. Se utiliza una cuadricula y se cuentan 5 cuadros
de 1 cm2 para cada caja Petri de los tratamientos. Los experimentos se realizaron
tres veces por triplicado, evaluándolos cada semana y durante un mes.

36 
 
   

X. RESULTADOS

10.1 Material biológico

Para la obtención de material biológico el hongo se resembró en 5 cajas Petri
conteniendo medio solido PDA. El hongo creció formando micelio aéreo con un
diámetro de 2 a 2.5 cm, de coloración café rosado con aspecto algodonoso y de
forma esférica y en la parte del envés de color negro (Figura 5). El crecimiento
adecuado del hongo, se observó en la cuarta semana de haberse inoculado el medio
sólido PDA.

Figura 6. Morfología del hongo M. fijiensis cultivado en un medio sólido PDA después de cuatro
semanas de cultivo.

10.2 Crecimiento del hongo Mycosphaerella fijiensis cultivado en medio líquido

(PDB)
El hongo se cultivó en un medio líquido con 50 ml de PDB. A partir de los 12 días se
observó gran cantidad de micelio de color negro, el cual fue utilizado para la
digestión enzimática y producción de protoplastos. En la figura 6 se observó el
micelio de M. fijiensis del que se partió para la obtención de protoplastos.

37 
 
   

Figura 7. Producción de micelio de M. fijiensis en medio líquido PDB.

10.3 Digestión enzimática

Se utilizaron dos enzimas (Driselase + Lysing enzimes, Sigma) a una
concentración de 150 mg/c/u en 15 ml OM; esto se adicionó a cinco ml de micelio
(libre de medio de cultivo) colectados por centrifugación en tubos Falcón. Esta
preparación hidrolítica se incubó a 70 rpm, oscuridad, 30 ° C por toda la noche
(Figura 7).

Figura 8. Digestión enzimática de micelio de Mycosphaerella fijiensis.

10.4 Producción de protoplastos del hongo Mycosphaerella fijiensis

Después del tiempo de incubación, la solución de digestión se filtró a través de
dos capas de gasa y una de miracloth para eliminar residuos de micelio no digeridos.

38 
 
   

Se lograron obtener protoplastos limpios a partir del método establecido de

producción de protoplastos (Figura 8), estos fueron ajustados a la concentración final
de 1x107 protoplastos/100 l con los crioprotectantes y se almacenaron a -80 °C. La
regeneración y viabilidad celular se evaluó cada semana durante un mes.

A B

Figura 9. Protoplastos observados en el objetivo 20x del microscopio Nikon Eclipse, A) protoplastos y
pequeñas cantidades de hifas parcialmente digeridas sin ningún lavado, B) protoplastos lavado y
filtrados con OM.

10.4 Tinción vital (viabilidad celular)

Se realizó la tinción con FDA para observar la viabilidad celular con ayuda de
un microscopio óptico de epifluorescencia empleando un filtro GFP que corresponde
a la longitud de onda del FDA. El diacetato de fluoresceína penetra en las células y
es transformado por las esterasas celulares en fluoresceína que emite fluorescencia
amarillo-verdosa (Emisión: 514 nm). En forma de diacetato la fluoresceína no emite
fluorescencia, luego sólo aparecerán marcadas las células metabólicamente activas
(viables). El mejor resultado observado para criopreservar al hongo M. fijiensis fueron
10 % dimetilsulfóxido + 20 % glucosa y 20 % dimetilsulfóxido DMSO + 1 M sorbitol en
donde se observaron mayor número de protoplastos fluorescentes después de cuatro
semana en criopreservación a -80 °C. El 10 % polivinilpirrolidona PVP + 2 M sorbitol
sobrevivieron muy pocos protoplastos a la cuarta semana de criopreservaión (Figura
9). Cabe mencionar que esta técnica de tinción fue muy sensible al tiempo, y aunque
en los protocolos se recomienda reposar 5 min (Jones y senft, 1985). En nuestro
caso después de ese tiempo ya no era posible observar la fluorescencia, por lo que
cuantificamos inmediatamente después de adicionarlo. Aun así, muchos de los
39 
 
   

protoplastos teñidos perdían la fluorescencia en pocos segundos por lo que se

decidió regenerar en un medio soft agar en placas Petri, para una cuantificación más
confiable de los protoplastos viables.

Figura 10. Protoplastos observados con el microscopio Nikon Eclipsé E200 (20x) para determinar
viabilidad celular con FDA.

10.5 Regeneración de protoplastos

El mejor resultado observado para criopreservar el hongo M. fijiensis fue con
el tratamiento 10 % dimetilsulfóxido + 20% glucosa en donde se observaron mayor
número de regenerantes después de cuatro semanas de almacenaje a -80 °C
(Figura10). En el tratamiento 10 % Polivinilpirrolidona PVP + 2 M sorbitol también se
obtuvieron regenerantes pero en menor cantidad. Cabe mencionar que en el control
sin crioprotectante solamente se observaron hasta tres regenerantes en toda la placa
en la primera semana. Los protoplastos regenerados fueron cuantificados al
microscopio estereoscópico después de tres semanas (21 días) de cultivo, que fue el
tiempo en que eran claramente visibles. Estos protoplastos fueron funcionales y
pudieron desarrollarse hasta formar colonias completas. La morfología y el lento
tiempo de desarrollo fue similar a las cepas sin criopreservar.

40 
 
   

B C D

 
Figura 11. Protoplastos regenerados después de 4 semanas de criopreservación a -80 °C en medio
"soft agar": A) Control sin crioprotectante, B) Tratamiento 1, C) Tratamiento 2, D) Tratamiento 3.

10.6 Efecto del tiempo de criopreservación de protoplastos sobre la

regeneración

Los protoplastos de M. fijiensis se regeneraron durante 4 semanas a 25°C en

un medio Soft que contiene sorbitol, PDB, PDA, se plaquearon muestras por
triplicado cada semana y cada experimento se repitió tres veces. La curva de
crecimiento de protoplastos del hongo muestra que hay una relación con las tres
réplicas realizadas, demostradas por la pequeña desviación estándar. Asimismo, en
las tres repeticiones de cada experimento se observa el mismo comportamiento.
Como el mejor tratamiento para criopreservar protoplastos se seleccionó el
tratamiento 3, con el cual se alcanzó hasta un 80 % de regenerantes. En general, en
todos los tratamientos se observa un cambio brusco en la regeneración en la primera
semana, después de la cual continúan con un ligero descenso en la regeneración
(Figura 11).

41 
 
   

(C)

Figura 12. Regeneración de protoplastos después de cuatro semanas de criopreservación. A) Primera

repetición. B) Segunda repetición. C) Tercera repetición.  Primer tratamiento: 20 % Dimetilsulfóxido
DMSO + 1 M sorbitol. Segundo tratamiento: 10 % Polivinilpirrolidona PVP + 2 M sorbitol. Tercer
tratamiento: 10 % Dimetilsulfóxido + 20% glucosa. Control sin crioprotectante.

42 
 
   

El tratamiento 10 % dimetilsulfóxido + 20 % glucosa rindió el mayor número de

regenerantes; se observa una diferencia significativa con respecto a los otros
tratamientos; fue seguido del tratamiento 20 % dimetilsulfóxido DMSO + 1 M sorbitol
y luego el 10 % Polivinilpirrolidona PVP + 2 M sorbitol. Los protoplastos sin
crioprotectante (control), no soportan las bajas temperaturas y a partir de la primera
semana se redujo a prácticamente cero regenerantes.

Como un resultado adicional (datos no mostrados), se regeneraron los mismos

tratamientos criopreservados por cuatro meses, y estos también mostraron un alto
porcentaje de regeneración (hasta el 40 %), en el tratamiento 10 % dimetilsulfóxido +
20% glucosa.

43 
 
   

XI. DISCUSIÓN
Los protoplastos son una herramienta muy importante en biología molecular y
genética. Sus aplicaciones son numerosas y su utilidad se basa en la suposición de
que son fisiológicamente normales, conservando todas las propiedades de la célula
intacta. Por lo cual, es pertinente el establecimiento de protocolos para la
conservación de los mismos.

En el laboratorio de biología molecular de hongos en la unidad de biotecnología del

CICY. A.C, se logró el establecimiento de un protocolo eficiente para la
criopreservación de protoplastos de Mycospharella fijiensis. Los tratamientos
empleados fueron elegidos de acuerdo con los artículos de criopreservación de
Porphyra yezoensis (Liu et al., 2004), el hongos Pseudozyma flocculosa (Cheng &
 
Bélanger, 2000), Laboratory Protocols in Fungal Biology (Kumar & Tuohy, 2013),
Criopreservation of plant protroplasts (Brian, 1995) y Protectants used in the
cryopreservation of microorganismo (Zdenek, 2003). La viabilidad de protoplastos se
evaluó por microscopia con diacetato de fluoresceína y por regeneración en un
medio sólido. Los resultados fueron novedosos para el hongo M. fijiensis, alcanzando
más de 80% de regeneración de protoplastos en un medio soft que contiene Sorbitol,
PDB, PDA, con el tratamiento a 10 % Dimetilsulfóxido + 20 % glucosa
criopreservados durante un mes. En comparación con el caso de planta mencionan
que la regeneración de protoplastos en un estudio obtuvieron un 37 % de
protoplastos criopreservados en nitrógeno líquido de (Secale cereale L), (Langis et
al., 1990). En el hongo Pseudozyma flocculosa se logró 75% de protoplastos
sobrevivientes (Cheng-Belanger, 2000). Por lo tanto, el protocolo implementado para
la criopreservacion de M. fijiensis resultó estar por arriba de ellos.

EL resultado logrado con M. fijiensis estuvo también por encima de lo reportado para
la crioconservación de centeno (Secale cereale L), en el cual lograron 37% de
protoplastos regenerantes

44 
 
   

XII. CONCLUSIÓN Y RECOMENDACIONES

En conclusión, este protocolo resulta adecuado para criopreservar
protoplastos durante un mes con una concentración de 80 % de protoplastos viables.
Los datos no se presentan en este reporte pero los protoplastos se mantienen vivos
hasta por 4 meses.

Es importante trabajar en un ambiente libre de contaminantes para evitar

contaminaciones con otros hongos. Debe usarse gantes a lo largo de todo el proceso
experimental. Controlar la fuerza de gravedad; centrifugar los protoplastos a fuerzas
no muy altas evitar que sufran daños.

Como una perspectiva, se pudieran evaluar otros crioprotectantes reportados o

combinaciones de ellos en diferentes porcentajes, así como también evaluar otros
medio osmóticos para los protoplastos.

La conservación de protoplastos viables tiene aplicaciones prácticas en

estudios de la genética de M. fijiensis e incluso de hongos estrechamente
relacionados.

45 
 
   

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