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ELECTROFORESIS
La electroforesis es un método de
laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de
separar biomoleculas según su tamaño y carga
eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
1. Fundamento.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en
un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que
posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las
moléculas esta gobernado
también por dos fuerzas
adicionales; inicialmente la
fricción con el solvente
dificultará este movimiento
originando una fuerza que se
opone , por otro lado las
moléculas tienen que moverse
en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética
propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la
temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas
provoca que las moléculas no
migren de una manera homogénea,
de tal manera que, si las moléculas
son colocadas en un cierto lugar de
solución, los iones comenzaran a
moverse formando un frente cuya
anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las
moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento.
Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero
soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un
tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración
electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente
se vera reducido también.
Las separaciones electroforéticas se llevan a cabo habitualmente en dos modalidades que difieren
notablemente: Electroforesis Convencional y Electroforesis Capilar (CE). La primera es la
metodología clásica que ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas,
de elevado peso molecular, de interés biológico y bioquímico; por otro lado, la segunda es un
método de separación que se basa en las diferentes velocidades de migración de especies
cargadas, en el seno de una disolución amortiguadora a través de la cual se aplica un campo
eléctrico constante. Esta técnica de separación fue desarrollada, en primer lugar, por el químico
sueco ARNE TISELIUS, quien durante la década de los años treinta la aplico al estudio de las
proteinas séricas1 . La electroforesis a escala macro se ha aplicado a diversos problemas de
separaciones analíticas dificultosas: aniones y cationes inorgánicos, aminoácidos, catecolaminas,
fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteinas, ácidos nucleicos, nucleótidos,
polinucleótidos u otras especies numerosas. Hasta la aparición de la electroforesis capilar (CE), las
separaciones electroforéticas no se realizaban en columnas, sino en un medio estabilizador plano
como papel o gel semisólido poroso. En consecuencia, (CE) ha llegado a ser una herramienta
importante para una gran variedad de problemas de separación analítica2 .
En primer lugar, una disminución en la sección transversal reduce la corriente que fluye a un
voltaje determinado. Para un voltaje y un tampón fijo, la corriente que fluye disminuye cuando el
área de la sección transversal del líquido se reduce. Puesto que la sección transversal es 𝜋𝑟 2 , el
calentamiento de Joule (potencia) disminuye fundamentalmente con el cuadrado del radio. Por
tanto, disminuye el diámetro desde 100 m hasta 50 m, se espera que la corriente a un voltaje
fijo disminuya por un factor de cuatro. El calentamiento de Joule, por tanto, se reducirá por un
factor de cuatro; ya que, P = I x V 2 .
En segundo lugar, la menor sección transversal hace que disminuya la distancia que el calor tiene
que recorrer para igualar la temperatura con el tampón. Nivelando las diferencias de
temperaturas con el tampón se reduce la convección .También, el aumento del calor total se hace
más pequeño por la menor distancia al medio que lo rodea 2 .
El diagrama muestra cómo cambia la temperatura desde su punto más alto en el centro del
tampón en el capilar, hasta el menor nivel de temperatura, que es el medio que lo rodea.
Pequeños tamaños no solo reducen el calor de Joule, sino también la magnitud de la convección
en sí misma. En efecto, a pequeñas distancias de la superficie, la disolución acuosa es más
resistente a la convección que a grandes distancias. La pared del capilar actúa como un polímero
soportado en un gel para reducir la tendencia a la convección. Tanto la reducción del incremento
de temperatura como el efecto de las pequeñas distancias a la pared del capilar permiten aplicar
(de 5 a 40 kV) comparado con los sistemas más grandes, y se mejora así la calidad de la
separación. El cambio en el radio también reduce otros efectos de la temperatura cuando la
separación se realiza por electroforesis capilar, que son grandes y complejos2 .
C. FLUJO ELECTROOSMÓTICO (FEO) ó ELECTROOSMOSIS (EO) ó ELECTROENDOOSMOSIS EN
CAPILARES.
Cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que contiene un tampón, se origina
normalmente un flujo electroosmótico, gracias al cual el disolvente migra hacia el cátodo o el
ánodo. La velocidad de migración puede ser apreciable. Por ejemplo, se ha demostrado que una
disolución tampón 50 mM de pH migra hacia el cátodo a través de un capilar de 50 cm a una
velocidad de aproximadamente 5 cm/min cuando se aplica un potencial de 25 KV 2, 3 . En la figura
de distribución de cargas, la causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se
desarrolla en la interfase sílice/disolución. A valores de pH mayores de 3, la pared interna de un
capilar de sílice se carga negativamente a causa de la ionización de los grupos silanol de superficie
(Si-OH) 3 .
Los cationes del tampón se congregan en una doble capa eléctrica adyacente a la superficie
negativa del Capilar de sílice. Los cationes de la parte exterior difusa de la doble capa son atraídos
hacia el cátodo o electrodo negativo. Dado que estos cationes están solvatados, arrastran consigo
el grueso de disolvente. En la Figura perfiles de flujo de líquido, puesto que el flujo se origina en las
paredes del tubo, la electroósmosis da lugar a un flujo de la disolución con un perfil plano a través
del tubo 4 .
Perfiles de flujo de líquidos bajo (a) flujo electroosmótico y (b) flujo inducido por presión1, 4.
Este perfil contrasta con el perfil laminar (parabólico) que se observa en el flujo impulsado por la
presión que se emplea en HPLC. Dado que el perfil es esencialmente plano, el flujo
electroosmótico no contribuye apreciablemente al ensanchamiento de banda, a diferencia de lo
que ocurre con el flujo impulsado por la presión en la cromatografía de líquidos3 .
La velocidad del flujo electroosmótico suele ser mayor que las velocidades de migración
electroforéticas de los iones individuales y, en efecto, se convierte en la bomba de la fase móvil en
la electroforesis capilar de zona. Aun cuando los analitos migran según sus cargas dentro del capilar,
la velocidad de flujo electroosmótico generalmente es suficiente para arrastrar todas las especies
positivas, neutras e incluso negativas, hacia el mismo extremo del capilar, de manera que todas
pueden ser detectadas a su paso por un punto común2, 3 .
La Figura velocidades en presencia de flujo electroosmótico. La longitud de la flecha que está junto
al ion indica la magnitud de su velocidad; la dirección de la flecha muestra la dirección del
movimiento. El electrodo negativo está a la derecha y el electrodo positivo a la izquierda de esta
parte de la disolución. El electroferograma resultante tiene la apariencia de un cromatograma, pero
con picos más estrechos1, 2 .
Cuando se aplica un potencial entre los extremos de un tubo aislante que contiene un líquido, este
líquido se mueve a lo largo de todo el tubo como si fuera un enchufe largo. La velocidad del flujo es
proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del tampón y depende de la carga en la superficie
del interior del capilar. Es esencial el control del FEO para la reproducibilidad de los resultados en
electroforesis capilar2 .
Una gran ventaja que presenta el flujo electroosmótico es que la separación electroforética y la
detección se pueden realizar a la vez para cationes y aniones. La velocidad de flujo electroosmótico
se suma a la velocidad de electroforesis de los iones. Puesto que el flujo electroosmótico es también
proporcional al potencial, es conveniente usar una movilidad para definir también al FEO2, 3 .
N = 𝜇𝑒𝑉/ 2𝐷
Donde D es el coeficiente de difusión del soluto en cm2 S -1 .
La larga longitud y la pequeña sección del capilar hacen que la resistencia de la disolución en el
capilar sea excepcionalmente proporcional a la resistencia se pueden aplicar potenciales muchísimo
más altos. Además, el capilar proporciona una eficaz refrigeración por su elevada relación superficie-
volumen. Como resultado de estos factores el ensanchamiento de banda debido a la convección
térmica no tiene lugar o es insignificante. Con la electroforesis capilar los potenciales normalmente
utilizados varían entre 20.000 y 60.000 V y estos potenciales elevados producen las
correspondientes mejoras en la rapidez y en la resolución con respecto a la disposición
convencional4, 5 .
La anchura de pico, en la electroforesis capilar, alcanza a menudo el límite teórico marcado por la
difusión longitudinal. La electroforesis capilar genera normalmente un número de platos
comprendido entre 100.000 a 20.000 comparados con los típicos 5.000 a 20.000, platos que se
obtienen en el HPLC5 .
También se han descrito números de platos de 3.000.000 en el caso de las separaciones por
electroforesis capilar de zonas de aminoácidos dansilados y de 10.000.000 para las separaciones de
polinucleótidos por electroforesis capilar en gel4 .
Puesto que los analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar al pasar el detector,
los electroferogramas tienen la misma apariencia general. La nomenclatura utilizada para describir
la separación de las bandas en cromatografía también se usa para la electroforesis capilar. Aquí la
mayor diferencia es que la posición de los picos se determina por las movilidades electroforéticas4.
La temperatura es un factor a tener en cuenta puesto que la disolución está más caliente en el
centro del capilar, y la migración es más rápida. La zona se extiende hacia el centro, tiende a
desplazarse hacia la periferia4 .
Una zona de la muestra excesivamente larga determina el límite para el valor mínimo de N. Sin
embargo, por simplificación se dice que si la longitud de la zona es de 3 mm o menor en un capilar
de 100 cm, puede generalmente ignorarse esta contribución en el ensanchamiento de la banda.
Zona más larga de muestras con analitos cargados, se pueden acortar electrofocalizando con un
aumento concomitante en la eficiencia4 .
Es interesante destacar que N se usa para describir separaciones tanto cromatográficas como
electroseparaciones, incluso pensando que es un concepto que deriva del número de platos
teóricos, como si estas técnicas dependieran de un numero de destilaciones secuenciales. Es decir,
en la cromatografía no se interpreta adecuadamente una serie de extracciones secuenciales, pero
se mantiene el término N. La electroforesis incluso más claramente no se parece a tales procesos
químicos. Sin embargo, ignoramos el origen de N y retenemos este concepto tan útil para describir
la calidad de las separaciones electroforéticas2, 5 .
En la figura efecto de la eficacia de un analito, la unión de dicho analito se cuantifica como un factor
de capacidad k, como el usado en cromatografía. La eficacia de N disminuye rápidamente con la
unión2 .
E. RESOLUCION
La resolución electroforética se define de forma análoga en cromatografía
El valor de W1 es la anchura d ela línea base de los picos, y el numerador es su separador, que
resulta de las diferentes en las movilidades electroforéticas2 .
Los métodos más comunes de introducción de las muestras son la inyección electrocinética, la
inyección hidrodinámica y la inyección hidrostática 3, 4, 5 .
En el método de inyección electrocinética, se retiran del depósito del tampón uno de los extremos
del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en un pequeño recipiente donde está situada
la muestra. Se aplica entonces un potencial durante un tiempo determinado, lo que hace que la
muestra penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de los fenómenos de migración iónica
y flujo electroosmótico. El extremo del capilar y el electrodo vuelven a introducirse en la disolución
tampón, donde se mantienen durante el resto del proceso de separación. Esta técnica de inyección
es discriminatoria al introducir mayor cantidad de los iones más móviles respecto a los más lentos
3,4.
En el método de inyección hidrodinámica, el extremo del capilar se coloca momentáneamente en
un pequeño recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presión para conducir
la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacío en el extremo
del detector o de la aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien se
consigue por elevación del extremo que contiene la muestra. La inyección por presión no diferencia
los iones según su movilidad; sin embargo, no puede utilizarse en capilares rellenos de gel4 .
El agua no fluye fácilmente a través de los capilares cuyo diámetro interno oscile entre 50 y 100 μm,
que es el rango más común usado en la CE. Por tanto, la inyección de la muestra en electroforesis
capilar se hace de dos únicas formas. Una supone aplicar una diferencia de presión entre los
extremos del capilar. Por ejemplo, uno de los extremos del capilar se sitúa sobre la muestra, y
durante un tiempo determinado la superficie del líquido de la cubeta se aumenta por encima del
nivel del tampón situado al final del detector. Y otra forma alternativa es consiguiendo el mismo
resultado haciendo vacío en el comportamiento del tampón del final del detector o una presión
positiva de aire a la muestra. En cualquier sea el caso, un protocolo sin cambios debería inyectar
una longitud fija de zona de muestra en el capilar5 .
La potencia suministrada por equipos comerciales puede operar de diferentes maneras: a corriente
constante, a potencial constante o a potencia constante. También, útil poder trabajar con gradientes
en los tres casos. Los gradientes se usan para mejorar la cuantificación al asegurar que toda a
muestra se lanza hacia el capilar, y una vez que se ha introducido, no puede expulsarse durante la
expansión inicial del electrolito produciendo por el calentamiento de Joule6 .
Surgen diferentes
comportamientos si se opera
con protocolos a corriente
constante o a potencial
constante. En el modo de
corriente constante, se cambia
internamente el campo eléctrico
(el potencial disminuye) al
cambiar la temperatura6 .
En el modo de potencial
constante, el campo eléctrico no
cambia, pero la corriente varia (y
por lo tanto la resistencia
interna) con los cambios de
temperatura. Estas propiedades
son fáciles de entender con la
simple descripción de ley de Ohm, V= IR. La cuantificación del analito puede ser mejor en el modo
de potencial constante que en corriente constante6 .
H. DETECCIÓN
Debido a que en la mayoría de las modalidades de electroforesis capilar los analitos separados se
desplazan pasando por un punto común, los detectores son semejantes en diseño y función a los de
HPLC, ya descritos. Sin embargo, se encuentra una diferencia de comportamiento en los detectores,
porque en la electroforesis capilar cada ion migra a una velocidad determinada por su movilidad
electroforética1, 2 .
Por tanto, las bandas de analito atraviesan el detector a diferentes velocidades, lo cual hace que las
áreas de los picos sean ligeramente dependientes de los tiempos de retención. En cambio, en HPLC
todas las especies pasan a través del detector a la velocidad de la fase móvil, y las áreas de los picos
son independientes de los tiempos de retención. Normalmente, esta dependencia del tiempo tiene
poca importancia práctica2.4 .
TIPOS DE DETECCIÓN:
1. Deteccion por absorbancia Los detectores de fluorescencia y absorbancia se han empleado
ampliamente en electroforesis capilar, aunque los últimos son más comunes debido a que
su campo de aplicación es mayor. Para que el volumen de detección se mantenga dentro
del orden de magnitud de nL o inferior, la detección se lleva a cabo en columna1,6 .
Uno de estos métodos, que está comercializado, se basa en doblar el extremo del capilar
en forma de “z”, obteniéndose un camino óptico de 3 mm. La mejora de sensibilidad lograda
con este método es inferior a la esperada, probablemente debido a un enfoque inadecuado
de la radiación. (a)
Una segunda estrategia para aumentar el camino óptico, consistente en formar una búrbuja
cerca del extremo del capilar. (b)
4. Detección electroquímica:
Se han utilizado 2 tipos de detección electroquímica en electroforesis capilar:
conductimétrica y amperométrica. Uno de los problemas de la detección electroquímica ha
sido el de aislar los electrodos del detector de la influencia de los elevados potenciales
necesarios para la separación7 .
Uno de los métodos de aislamiento consiste en unir el capilar a un segundo capilar que
contiene los electrodos del detector mediante una unión de vidrio poroso o grafito7 .
5. Detección por espectrometría de masas:
Los flujos tan pequeños, de alrededor de 1 µL/min, que proceden de los capilares de la
electroforesis, hacen posible el acoplamiento directo del efluente del capilar de un
dispositivo electroforético a la fuente de ionización de un espectrómetro de masas1, 3 .
Los tamaños de muestra para la electroforesis son del orden de nL, mientras
que normalmente se necesitan tamaños de muestra mucho mayores, del orden
de L, para los otros tipos de análisis de iones pequeños. Por ello, los métodos
electroforéticos son más sensibles que los métodos donde se determina la masa
(pero no lo son más que en otros los que se determina la concentración)1, 3 .
2. Separación de moléculas
Puede separarse y analizarse por CZE una gran variedad de moléculas de
pequeño tamaño, tales como herbicidas sintéticos, pesticidas y fármacos,
siempre que sean moléculas cargadas o puedan derivatizarse para dar un
ion1,3.
Sin embargo, los geles son redes tridimensionales de moléculas, y a medida que
la matriz está más concentrada, hay conductos que son más pequeños y
tortuosos que la media8 .
1. Los geles
Se emplean dos materiales distintos para realizar la mayoría de las
electroforesis con geles: agarosa y poliacrilamida, tienen dos características
en común2, 8 .
En segundo lugar, ambas estructuras están libres de cargas iónicas, así evita
que la disolución del tampón se desplace por el gel cuando se active el
campo eléctrico: FEO. Importante recordar que, obtener geles excelentes
es una arte, significa que tenemos que controlar tanto los detalles de
elaboración así como la práctica, cuyos requisitos para un análisis es una
muestra de patrones internos2, 8 .
Cuando en una separación por CITP se aplica un potencial, los iones migran
como en la electroforesis de zona, cada ion a una velocidad característica
que viene dada por el producto de eE. La diferencia en las velocidades de
migración da lugar a la separación de los distintos analitos en bandas
adyacentes, con la especie más rápida situada en la banda más próxima al
tampón conductor y la más lenta por delante del tampón terminal1 .
Una vez que se han formado todas las bandas, todas ellas se mueven a la
misma velocidad. La razón por la que todas las bandas se mueven a la
misma velocidad es que el potencial se hace más reducido para las bandas
más móviles y se hace más intenso para las bandas más lentas, de tal forma
que la corriente es la misma en todas al zonas del tampón1 .
La corriente iónica que se origina como consecuencia del flujo de los iones
en el tampón es semejante al de la corriente continua en un circuito
formado por varias resistencias conectadas en serie a una pila en este caso,
la corriente debe ser idéntica en todas las resistencias; por ello, el potencial
varia en todas y cada una de ellas según predice la ley de Ohm1 .
ETAPAS
1. Carga: La muestra se mezcla con el anfolito que cree un gradiente de
pH apropiado. La concentración final de este anfolito suele ser 1-2%. La
mezcla se carga en el capilar por el método hidrodinámico (aplicando
presión)3 .
La CEC, parece tener varias ventajas sobre técnicas de las que procede. Primero, como HPLC,
se puede utilizar para la separación de especies no cargadas. Segundo, como en
electroforesis capilar, proporciona una elevada eficacia en las separaciones, de micro
volúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un sistema de bombeo de alta
presión 2, 3 .
Los iones empiezan a formar agregados esféricos, de entre 40 y 100 iones, cuyas cadenas
hidrocarbonadas se orientan hacia el interior mientras que los extremos cargados quedan
orientados hacia el exterior, en contacto con el agua1, 3, 4 .
Las micelas constituyen una segunda fase estable que es capaz de alojar compuestos no
polares en el interior de la micela, entre las cadenas hidrocarbonadas, solubilizando así
compuestos no polares. La solubilizarían se produce, habitualmente, cuando se lava con una
disolución detergente un material o una superficie grasa4 .
La superficie de una micela de este tipo es anionica y posee una elevada carga negativa, lo
cual hace que tenga una movilidad electroforética alta, desplazándose hace el electrodo
positivo. Sin embargo, algunos de los tampones presenta una velocidad de flujo electro
electroosmótico hacia el electrodo negativo tan alta que hace que las micelas anionicas
también se desplacen hasta este electrodo, pero a una velocidad muy reducida. Así, en la
práctica, la mezcla tampón está formada por iones de la fase micelar que se mueve más
lentamente4 .
Cuando una muestra se introduce en este medio los distintos en este medio los distintos
componentes se distribuyen entre la fase acuosa y la fase hidrocarbonada del interior de las
micelas. Las situaciones resultantes de estos equilibrios de distribución dependerán de la
polaridad de los solutos. Si los solutos son polares se ve favorecida se permanencia en la
fase acuosa, si los compuestos son no polares, el entorno preferido es el hidrocarbonado de
la micela2 .
El sistema anteriormente descrito es bastante similar al que tiene lugar en una columna
cromatografía de reparto líquido, excepto que la fase estacionaria se va desplazando
también a lo largo de la columna, pero a una velocidad mucho más lenta que la fase móvil.
El mecanismo por el cual se produce la separación es idéntico en ambos casos y depende
de las diferencias de los coeficientes de distribución de los analitos entre la fase móvil
acuosa y la fase pseudoestacionaria hidrocarbonada. El proceso que tiene lugar es una
verdadera cromatografía y de allí el nombre cromatografía capilar electrocinética micelar2,
3.