Danna Lizeth Rodríguez Narváez

Pontificia Universidad Javeriana

Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo

Debido a los pocos reportes de métodos para conservación de actinobacterias solubilizado
ras de fosforo, el objetivo de la investigación fue evaluar diferentes métodos que permitieran
la conservación de estos microorganismos.

Es importante poder llevar a cabo la conservación de microorganismos que presenten

características de gran interés, como por ejemplo producción de enzimas, metabolitos
secundarios, solubilización de fosforo, entre otros. Para la elección del método de
conservación es importante que este nos permita mantener el 70% de las células viables, la
pureza, la estabilidad genética al final de la conservación de los aislamientos y los costos más
bajos en el proceso. Los métodos de conservación se clasifican según el tiempo en largo,
mediano y corto plazo.

Las plantas requieren de fosforo para llevar a cabo su desarrollo y optimo crecimiento, pero
este no se encuentra disponible fácilmente en el ambiente para ser usado por las plantas. Una
forma de hacer disponible el fosforo es mediante la solubilización, proceso que puede ser
llevado a cabo por microorganismos como las actinobacterias, las cuales son bacterias Gram
positivas filamentosas, aerobias, crecen a temperaturas de 30°C, se encuentran presentes en
una amplia variedad de ambientes y son capaces de llevar a cabo el proceso de solubilización
de fosforo.

La metodología en la investigación se llevó a cabo a partir de 15 aislamientos de

microorganismos con actividad solubilizadora de fosforo, los cuales se seleccionaron de la
unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana.

Todos los inóculos se prepararon en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una
concentración de 108 cel/ml, luego se inocularon los viales de cada método de conservación
con sus respectivos crioprotectantes. Uno de los métodos de largo plazo empleado fue
liofilización , para el cual se usó un liofilizador LABCONCO FREEZE DRY SISTEM /
FREE ZONE 4.5 que se mantuvo a una temperatura de -50°C y como crioconservante Skim
Milk al 18%(p/v), el siguiente método a largo plazo empleado fue congelación , donde se
emplearon como crioconservantes diferentes concentraciones de glicerol : glicerol 20% (p/v)
y 30% (p/v).Para los métodos a mediano plazo se llevó a cabo un procedimiento similar ,
donde se agregó inoculo a 10 g de arena estéril , a 5 g de sílica gel y a 10 perlas de arcilla,
posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se llevó a cabo en agar avena
(15 g/L), el cual consistió en transferencia periódica de un cultivo de un medio líquido a uno
sólido, en condiciones óptimas de incubación, hasta obtener crecimiento, se realizó
caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento mensualmente durante 4
meses. Para evaluar la viabilidad de todos los métodos se realizó recuento directo en cámara
de Neubauer por la técnica de azul de tripán, para diferenciar células vivas de las muertas.

Se realizo un análisis de varianza ANOVA de un factor con un α del 0,05, posteriormente se

hizo una prueba de comparación de medias de Tukey para determinar el mejor método de
conservación relacionado con la preservación de la actividad a largo y mediano plazo de cada
uno de los aislamientos. Por otro lado, para el método de corto plazo, no se observaron
variaciones en el tiempo en las caracterizaciones morfológicas, pero la actividad
solubilizadora de fósforo fue baja. La actividad solubilizadora se evaluó tomando 3
aislamientos de actinobacterias con mayor actividad solubilizadora: Streptomyces MCR24,
Streptomyces T3A y Streptomyces T3C, lo cual fue cuantificado en estudios previos
utilizando el test de cuantificación SPECTROQUANT de Merck® y midiendo la absorbancia
a una longitud de onda de 880nm, para esta cuantificación se preparo una curva patrón de
solución estándar 0.01mg de P(KH2PO4)/ml.

El método de liofilización y congelación donde se uso glicerol al 30% son los que mejor
presentaron efecto en mantener la propiedad de solubilizar fosforo. Los porcentajes de
viabilidad del recuento inicial frente al recuento final a la conservación fueron mayores al
87%, lo cual puede deberse al crioconservante usado en este caso Skim Milk para el método
de liofilización, es un método rápido, de bajo costo y eficiente para largos periodos de
conservación.

Para los métodos a largo plazo el 46% de los aislamientos presentaron mayor afinidad con
glicerol al 20% (p/v) la diferencia porcentual en cuanto a liofilización no es significativa, ya
que el 33% de los aislamientos se ajustaron mejor a este método el cual ha sido ampliamente
reportado.

La crioconservación es reportado como un buen método de conservación para bacterias y

hongos , pero afecta la viabilidad y actividad dependiendo de la temperatura y concentración
del crioprotectante utilizado .El glicerol a concentraciones superiores a 30% puede ser toxico
penetrando las membranas de las células , pero en el presente estudio tres aislamientos
presentaron buenos resultados con este método , por lo cual es útil como método de
conservación , a su vez este método fue el que presento mayor mantenimiento en la actividad
solubilizadora al pasar un año en los tres aislamientos; La congelación rápida esta ligada a la
preservación de la actividad y viabilidad en este método.

En cuanto a los métodos de mediano plazo el 86% de los aislamientos presento mayor
afinidad en arena como matriz de conservación, esto debido a que la arena presenta unas
características que benefician el crecimiento de las actinobacterias, permitiendo la
conservación de estas; Este método fue el mejor en cuanto a viabilidad, conservación de la
actividad solubilizadora y costos. La arcilla permitió la conservación de la viabilidad, 2
aislamientos presentaron afinidad con este método, esta arcilla tras ser sometida a un proceso
térmico cambia un poco sus propiedades, aumentando su porosidad y permitiendo así la
conservación de los microorganismos y la afinidad de estos 2 aislamientos por este método.

Ningún aislamiento fue exitoso con el método en silica gel, aunque si se ha utilizado en la
conservación de microorganismos en otros estudios, presentando buenos resultados. En este
estudio los efectos positivos no se encontraron con este método, posiblemente porque la silica
está fabricada por un compuesto desecante que elimina la humedad y afecta así la actividad
y viabilidad.
El método de transferencia periódica se invalido, ya que hubo perdida en la actividad
solubilizadora de fosforo en los microorganismos, la cual era la característica de interés.

En ningún método se observaron cambios en los microorganismos evaluados durante el

periodo de almacenamiento, pudiéndose concluir que estos proporcionaron estabilidad
génica, pero no la capacidad de conservar la característica de interés en todos los métodos.

Llevando a cabo un análisis de costos el método del glicerol al 20% y arcilla fueron los más
económicos, pero no precisamente los que presentaron mayor viabilidad ni actividad
solubilizadora, aun así, se pude inferir que también son métodos eficaces, ya que la
concentración de fosforo soluble no disminuyo significativamente.

Aún no está estipulado un método de conservación exitoso para estos microorganismos en

general, por lo cual es indispensable que se siga llevando a cabo el desarrollo de diferentes
propuestas para conservar microorganismos de interés biotecnológico que pueden ser de gran
importancia en diferentes campos. Una propuesta es llevar a cabo el ensayo de otros métodos
que ya están estipulados para la conservación de ciertos microorganismos y empezarlos a
probar en otros grupos bacterianos de interés, sin embargo, lo ideal es poder determinar un
método de conservación específico para un microorganismo en especial, ya que todos poseen
diferentes características, las cuales no permiten que un mismo método funcione en general
para varios filum o un amplio rango de microorganismos. También es importante tener en
cuenta la característica de interés por la cual se lleva a cabo un proceso de conservación, ya
que esto nos indica el método más optimo que debe ser empleado y además es otro factor el
cual impide que un método en general permita conservar un amplio rango de
microorganismos, ya que la característica de interés a conservar es variable para cada grupo
bacteriano (Tatiana Ortiz, 2016) .
Referencias:
-(Tatiana Ortiz, 2016)
Tatiana Ortiz, V. O. (2016). Métodos de conservación para actinobacterias con actividad
solubilizadora de fósforo. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2, 32-39.