International Journal of

Ciências moleculares

Artigo
Propriedades anti-inflamatórias da irisina, Mediador
da Atividade Física, estão relacionados com / Ativação
TLR4 MyD88 via de sinalização
Agnieszka Irena Mazur-Bialy 1, *, Ewa Pochec' 2 e 3 Marcin Zarawski

1
Departamento de Ergonomia e Fisiologia do Exercício, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade
Jagiellonian Medical College, Grzegorzecka 20, 31-531 Cracóvia, Polônia
2 Departamento de Glycoconjugate Bioquímica, Instituto de Zoologia da Universidade Jagiellonian,
Gronostajowa 9,
30-387 Cracóvia, Polônia; ewa.pochec@uj.edu.pl
3
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia com Oncologia Ginecológica, Rydygier Hospital
Cracóvia, Złotej Jesieni 1, 31-826 Cracóvia, Polônia; mzarawski@gmail.com
* Correspondência: agnieszka.mazur@uj.edu.pl; Tel .: + 48-012-421-9351
Editores acadêmicos: Paula Andrade e Patrícia Valentão
Recebeu: 31 de janeiro de 2017; Aceite: 21 de março de 2017; Publicado: março 25, 2017

Abstrato: Irisina, um adipomiokine conhecido como um mediador da actividade física, induz o

escurecimento do tecido adiposo e que tem propriedades potencialmente protectores no
desenvolvimento de estados relacionados com a obesidade, tais como a resistência à insulina,
arteriosclerose, e diabetes do tipo 2. Apesar de numerosos estudos efectuados sobre este factor,
ainda pouco é conhecido sobre o seu impacto sobre o funcionamento de células imunocompetentes,
mas as suas propriedades anti-inflamatórias potenciais foram sugeridas anteriormente. No
presente estudo foi investigado o papel de irisin (0-100 nM) na activação da via de jusante do
receptor de tipo Toll 4 (RST4) em macrófagos RAW 264.7 estimuladas com lipopolissacárido (LPS;
100 ng / mL). Os resultados têm mostrado que irisin em concentrações elevadas (50, 100 nM)
diminuiu significativamente os níveis de proteína de TLR4 e MyD88, bem como a fosforilação do
factor nuclear-kB (NF-kB), consequentemente, conduzindo à redução da libertação de citocinas
pro-inflamatórias cruciais. O acima foi confirmada por 1β interleucina (IL-1β), α factor de necrose
tumoral (TNF?), Interleucina 6 (IL-6), quimioatraente de queratinócitos (KC), monócitos proteína
quimiotática 1 (MCP-1), bem como em alta caixa de grupo mobilidade 1 (HMGB1). Além disso, os
nossos resultados indicam que este efeito está relacionado com o impacto do irisin sobre a
fosforilação de quinases activadas por mitogénio (MAPK) de proteína, onde foi observada uma
redução significativa da p-JNK e ERK-p, mas não p-p38. Em conclusão, estes dados sugerem que
irisin tem potencialmente propriedades anti-inflamatórias relacionadas com a regulao negativa de
vias a jusante de RST4 / MyD88. quimioatraente de queratinócitos (KC), monócitos proteína
quimiotática 1 (MCP-1), bem como para a caixa grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1). Além disso,
os nossos resultados indicam que este efeito está relacionado com o impacto do irisin sobre a
fosforilação de quinases activadas por mitogénio (MAPK) de proteína, onde foi observada uma
redução significativa da p-JNK e ERK-p, mas não p-p38. Em conclusão, estes dados sugerem que
irisin tem potencialmente propriedades anti-inflamatórias relacionadas com a regulao negativa de
vias a jusante de RST4 / MyD88.

Palavras-chave: exercício físico; irisin; adipomiokine; macrófagos; inflamação; esporte; leucócitos

1. Introdução
actividade impulsionado pelo exercício de músculos esqueléticos conduz a uma liberação de
proteínas de baixo peso molecular em massa chamado miocinas [1]. Irisin é uma parte do secretoma
muscular e é formada pela clivagem proteolítica da fibronectina de tipo III ligada à membrana de
domínio contendo cinco proteínas (FNDC5) [2-4]. Irisin desempenha um papel pleiotropic no
metabolismo [5]. Ele atua através Autócrino e endócrino [6]. Os principais objectivos do sistema
endócrino para irisin são adipócitos que residem em tecido adiposo branco (WAT) [7]. Tem sido bem
documentado que regula irisin adiposo mediada por tecido termogénese [8] E induz o escurecimento
da WAT [9-11], Resultando na perda de peso corporal [10]. Irisin também foi encontrada para ser
segregada por adipócitos num rato [12,13] Ou modelo de rato, bem como pelo tecido adiposo
humano [14].
Um estilo de vida sedentário acompanhado por um consumo excessivo de energia é uma das
principais razões para o excesso de peso e obesidade. Este estado está associada com a activação de
vias pró-inflamatórias e

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consequentemente, pode levar ao desenvolvimento de resistência à insulina ou outras doenças

metabólicas [15]. Além disso, a acumulação excessiva de gordura no tecido adiposo é definida como
a razão principal para o desenvolvimento de inflamação leve relacionadas com a obesidade, que, por
sua vez, tem um papel chave no desenvolvimento de doenças associadas à obesidade. O tecido
adiposo é infiltrada com vários tipos de células imunocompetentes, a maioria dos quais são os
macrófagos do tecido adiposo (ATM) [16,17], A principal fonte de factores inflamatórios no tecido
adiposo. A acumulação de gordura é acompanhado por um aumento no número de ATM e,
consequentemente, leva ao aumento da inflamação em curso através da indução da libertação de
citocinas inflamatórias por ambas as ATMs, bem como pelos adipócitos [18-23].
Embora não haja dúvida de que a secreção Myokine desempenha um papel importante no
equilíbrio pro- e anti-inflamatória no tecido adiposo, alguns aspectos da actividade irisin ainda
permanecem obscuros. Tanto quanto sabemos, o impacto do irisin a resposta inflamatória de
macrófagos ainda não foi explicada. Em nosso trabalho anterior, mostramos que sua ação se
intensifica fagocitose, mas ao mesmo tempo reduz a explosão respiratória gerada pelos macrófagos
[24]. Uma característica detalhada do seu papel imunomodulador parece ser especialmente
importante para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra o baixo grau de inflamação
gerado por células imunocompetentes em tecido adiposo. O nosso estudo recente demonstrou que
irisin significativamente regula negativamente a actividade pró-inflamatória dos adipócitos
(manuscrito em revisão); por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi avaliar a influência de
irisin em macrófagos. Particular atenção tem sido dada à activação da via de jusante do receptor de
tipo Toll 4 (RST4) e a libertação de citocinas pro-inflamatórias cruciais.

2. Resultados

2.1. Irisin Protege macrófagos contra uma lesão induzida por lipopolissacarídeo
Como primeiro passo da nossa análise, testamos os efeitos da pré-incubação irisin sobre a
viabilidade de macrófagos após estimulação LPS. Como mostrado na figura1Um, LPS a uma dose de
100 ng / mL aumentou acentuadamente a percentagem de macrófagos em apoptose, avaliada
cytometrically com o kit de anexina V, mas irisin pré-tratamento em concentração elevada (100 nM)
reduziu significativamente estes efeitos (p <0,05). Esta observação foi confirmada no ensaio de
MTT, o que nos permite avaliar a viabilidade celular total e actividade (Figura1B). Além disso, as
concentrações irisin inferiores (10 e 50 nm) foram ineficazes em ambos os testes. Nós não
observamos qualquer influência significativa de pré-tratamento irisin sobre a viabilidade de
macrófagos quiescentes, mas nossos resultados sugerem que uma alta concentração irisin pode
proteger macrófagos contra lesão induzida por LPS.

2.2. Irisin tem um impacto sobre TLR4 Expressão

Levando em conta a (TLR4) envolvimento do receptor de tipo Toll 4 no reconhecimento de LPS
por macrófagos, foram avaliados os efeitos do pré-tratamento irisin em ambos expressão TLR4 em
macrófagos activados por LPS quiescentes, bem como em. Conforme apresentado na
figura2(barras), um 24 h pré-tratamento dos macrófagos quiescentes com uma concentração irisin
inferior (10 nM) intensificou a expressão de ARNm de TLR4 (p <0,05), enquanto que doses mais
elevadas de irisin (50 e 100 nM) foram ineficazes. Estas observações foram confirmadas por análise
de citometria da expressão de proteína quantificadas após 24 horas de pré-incubação com e sem
irisin. Conforme apresentado na figura2(linhas), o nível da proteína TLR4 foi significativamente
elevado apenas no grupo pré-tratado com irisin a uma baixa concentração (10 nM; p <0,05).
Além disso, a análise de expressão de TLR4 após estimulação por LPS indicou uma falta de
impacto sobre a expressão de ARNm após o tratamento prévio com irisin, que foi apresentada na
Figura2(barras). No entanto, uma análise de citometria da expressão de proteína TLR4 mostraram
uma redução significativa na expressão da proteína TLR4 após uma dose elevada de irisin
tratamento (Figura2; linhas) em comparação com o grupo de controlo (0 nM; p <0,05). O pré-
tratamento dos macrófagos com a concentração irisin inferior (10 nM) não teve qualquer impacto
sobre o ARNm TLR4, bem como a expressão da proteína, após a estimulação com LPS. Estes
resultados mostraram que uma concentração baixa irisin poderia potencialmente melhorar as
propriedades de macrófagos associados quiescentes
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com o reconhecimento do patógeno pela elevação da expressão de TLR4. Além disso, os nossos
dados sugerem que uma concentração mais elevada irisin, quando agindo sobre o estado de
activação dos macrófagos, reduziu a expressão da proteína de RST4.

Figura 1. Os efeitos protectores de irisin (IR) de pré-tratamento em lipopolissacido (LPS)

estimuladas por células de macrófagos RAW 264.7. As células foram pré-incubadas com várias doses
de irisin (0-100 nM), durante 24 h, e depois estimuladas com LPS (100 ng / mL) para o próximo 24
h. Viabilidade das células foi testada cytometrically usando um kit de anexina V (A), onde os
resultados são apresentados como uma percentagem média de apoptótica tarde (barras a cheio) ou
células apoptóticas precoces (barras abertas) ± SE ou colorimetricamente no 3- (4,5- -dimetil tiazol-
2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT) de teste (B), onde os resultados são apresentados como uma
percentagem média vs grupo IR0. A linha de dentro das barras mostra o nível geral de apoptose
medida após 24 h, sem estimulação com LPS. N = quatro a cinco experiências independentes.
significados estatísticos foram determinados com o teste ANOVA com análise post hoc de Tukey. * P
<0,05 comparado com o significado do grupo de controlo para a intensidade da apoptose precoce ou
viabilidade global; # P <0,05 significado em comparação com o grupo de controlo para a intensidade
da apoptose tardia.

Figura 2. Efeitos do pré-tratamento irisin (IR; 0-100 nM) sobre a expressão do receptor de tipo Toll
4 (RST4) em mRNA e o nível de proteína. Os macrófagos RAW 264.7, pré-tratados com irisin
durante 24 h, foram cultivadas com e sem LPS (100 ng / mL) durante um adicional de 6 horas (a
expressão de ARNm; rtPCR; barras) ou 24 h (de expressão de proteínas; citómetro; linhas). nível de
proteína foi expressa como uma percentagem versus grupo de controlo (0 nM) como 100%. grupos-
IR0 com ou sem (w o / a) LPS de controlo. Os resultados são expressos como média + SE de quatro a
cinco experiências independentes (# p <0,05 em comparação com o significado do grupo de controlo
para a express de mRNAs; * p <0,05 comparado com o grupo significância de controlo para a
expressão da proteína). significados estatísticos foram determinados com o teste ANOVA com
análise post hoc de Tukey.
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2.3. Irisin Regulamenta o Caminho Downstream de TLR4 / MyD88

Em seguida, avaliou-se a via de saída de RST4 para verificar os efeitos do pré-tratamento com
irisina sobre a activação da cascata de sinalização e mediadores pró-inflamatórios libertados por
macrófagos estimulados com LPS. Conforme apresentado na figura3Um, macrófagos pré-tratados
com uma elevada concentração de irisin (100 nM) manifesta significativamente menor expressão
MyD88 (p <0,05) em comparação com células de controlo (0 nM). Irisin (100 nM) reduziu o nível de
MyD88 por cerca de 37%, enquanto inferior irisin concentrações (10 e 50 nM) induziu um ligeiro
efeito (p = 0,05 para 50 nM, e p> 0,05 para 10 nM).

Figura 3. Irisin inibe a via de jusante de RST4 / MyD88 em macrófagos activados com LPS. RAW
264.7 de macrófagos foram cultivadas com várias concentrações irisin (IR; 0-100 nM) durante 24 h e
em seguida estimuladas com LPS (100 ng / mL). Os níveis relativos de proteína MyD88 (A); factor
nuclear kB (NF-kB) (B), a JNK (C), ERK (D) e cinases p38 activada por mitogio (MAPK) proteína (E)
foram avaliadas cytometrically e expresso como uma percentagem versus grupo de controlo (0 irisin
nM) apresentados como um 100%. N = quatro experiências independentes. significados estatísticos
foram determinados com o teste ANOVA com análise post hoc de Tukey. * P <0,05 comparado com o
significado do grupo de controlo.

Além disso, a análise da fosforilação dos componentes cruciais da via de TLR4 indicaram que o
pré-tratamento irisin resultou na regulao negativa da MAPK vias de sinalização (figura3C-E) e,
consequentemente, reduzido a activação kB factor nuclear (NF-kB) por 39% (p <0,01; figura3B).
Particularmente, a fosforilação de JNK e ERK, mas não a cinase p38 foi diminuído depois de os
macrófagos foram pré-tratados com uma elevada concentração de irisin (100 nM), e os níveis foram
reduzidos em cerca de 21%, e 34%, respectivamente (p <0,05). Doses mais baixas de irisin (até 50 nM)
tem apenas um ligeiro impacto sobre a fosforilação da quinase (p = 0,05 ou p> 0,05), mas depois de
macrófagos foram pré-tratados com irisin a 50 nM, uma redução na activação do NF-kB também foi
observada ( 21%; p <0,05). A concentração irisin menor (10 nM) não teve qualquer impacto em ambos
os cinases e fosforilação de NF-kB (p> 0,05).

2.4. Irisin pré-tratamento reduz o nível de citocinas pró-inflamatórias

O último passo na nossa investigação foi a avaliação da expressão das citocinas /
quimiocinas e secreção após pré-tratamento com irisin. Macrófagos estimulados com LPS
aumentou acentuadamente tanto a expressão de mRNA de citocinas, bem como a libertação de
citoquinas medida após 24 h de estimulação (figura4). Além disso, um pré-tratamento de 24
horas de macrófagos com irisin de uma forma dependente da dose reduzida, tanto a expressão
de ARNm e a secreção de TNFa, IL-1β, IL-6, MCP-1, KC e HMGB1.Conforme apresentado na
figura4A, maior irisin concentrações (100 e 50 nM) reduziu eficazmente a TNF α expressão de
ARNm de 45% e 22%, e a libertação de TNFa em 40% e 18%, respectivamente (p <0,01).
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No caso de IL-6, o nível de ARNm era inferior cerca de 51% (100 nM) e 35% (50 nM) -quando o
conteúdo de citoquina no sobrenadante foi reduzido em 36% e 27%, respectivamente (p <0,05 ;
Figura4B). O nível de ARNm de IL-1β foi reduzido em 79% por irisin a 100 nM, e por 52% em irisin
a 50 nM (p <0,001; Figura4C). O nível de IL-1 libertada foi β diminuíram respectivamente por 62%
e 45% em comparação com o grupo de controlo (0 nM; p <0,01). Além disso, as concentrações mais
elevadas irisin (100 e 50 nM) com eficácia reduzida de MCP-1 por expressão de ARNm de 80%, e
56%, respectivamente, que foi acompanhada pela diminuição da secreção de MCP-1 em 46% e 30%,
respectivamente (Figura4D).

Figura 4. Irisin reduz citocinas pró-inflamatórias expressão e secreção por macrófagos activados por
LPS. células de macrófagos RAW 264.7 foram pré-tratadas durante 24 h com irisin (IR; 0-100 nM) e
em seguida estimuladas com LPS (100 ng / mL) durante 4 h (a expressão de ARNm; rtPCR) ou 24 h
(libertação de citocina; Testes ELISA). a expressão de ARNm relativa (barras), e a secreção de
proteínas (linhas) de factor de necrose tumoral alfa (TNF?) (A), interleucina 6 (IL-6) (B),
interleucina 1β (IL-1β) (C), monócitos proteína quimiotática 1 (MCP-1) (D), quimioatraente de
queratinócitos (KC) (e), e alta mobilidade caixa grupo 1 (HMGB1)
(F) foram avaliadas. grupo não-estimulado CTR, macrófagos quiescentes. Os resultados são
expressos como médias ± DP de quatro a cinco experiências independentes (* p <0,05 em
comparação com grupo de significância IR0 para a expressão do mRNA; # p <0,05 em comparação
com grupo de significância IR0 para a libertação de citocina para o sobrenadante). significados
estatísticos foram determinados com o teste ANOVA com análise post hoc de Tukey.
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Além disso, a análise de distribuição KC em RAW 264.7 de macrófagos indicaram que

concentrações elevadas de irisin (100 e 50 nM) inibiu marcadamente a expressão de mRNA de KC
por 65% e 33%, respectivamente (p <0,01), e, consequentemente, reduzido o nível de KC libertado
ap estimulao por LPS em 52% (p <0,01) e 28% (p <0,05; figura4E).
O efeito de irisin na express de HMGB1 não era tão proeminente (Figura4F), mas irisin a uma
concentração de 100 nM reduziu significativamente tanto os níveis de mRNA de citocinas e por 28%
e 20%, respectivamente (p <0,05). Em todos os casos, a concentração irisin menor (10 nM) não
diminuiu o nível de citoquinas testadas (p> 0,05). Além disso, a quantificação dos níveis de ARNm
em macrófagos quiescentes indicou que os níveis de repouso de TNFa e a expressão de ARNm de IL-
1β são regulados negativamente em macrófagos pré-incubados com irisin (100 nM) durante 24 h,
quando em comparação com células de controlo (0 nM; p < 0,05).

3. Discussão
Irisin é um peptídeo que tem sido amplamente investigada nos últimos anos. Numerosos
estudos realçar as propriedades benéficas e de protecção de elevação irisin nível da obesidade,
resistência à insulina, doenças metabólicas [25-27] E hepática esteatose [28]. Além disso, os dados
mostram que o nível de plasma irisin pode ser um factor preditivo para tais condições como a
diabetes mellitus tipo 2 [29], Risco cardiometabólico em estilos de vida sedentários [30], Sarcopenia
e carótida arteriosclerose [31], doenças renais crónicas [32], síndrome dos ovários policísticos [33]
Ou do cancro da mama [34]. Como relatado por Rana et al. [35], O nível irisin correlacionada com a
idade do paciente pode prever o comprimento dos telômeros. Repetidamente, estudos também
indicaram uma correlação entre o nível irisin e o nível de factores inflamatórios, sugerindo suas
propriedades anti-inflamatórias [36,37]. No entanto, ainda há pouca evidência para explicar o efeito
direto de irisin na ativação de células imunocompetentes [38]. Portanto, é particularmente
necessária a pesquisa sobre os mecanismos de ação dos irisin.
Macrófagos, células cruciais na primeira linha da nossa defesa imunológica, desempenham um
papel importante na eliminação de agentes patogénicos e o recrutamento de outras células para o
local da inflamação em curso. No entanto, em algumas condições patológicas, tais como, por
exemplo, a obesidade, a sua activao excessiva pode levar à indução da inflamação suave e,
consequentemente, para o desenvolvimento da doença associada. No mecanismo de reconhecimento
do patógeno, um papel proeminente é atribuído a receptores semelhantes a Toll (TLRs) que são
estimulados por padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMP) como um motivo
estrutural comum de bactérias, vírus ou fungos [39]. LPS, um componente da membrana exterior de
bactérias Gram-negativas, como um PAMP interage com o receptor de RST4 e desencadeia a
activação da via de jusante, que conduz à fosforilação e translocação do factor de transcrição NF-kB,
e, consequentemente, a secreção de pró-inflamatória mediadores [40]. A via de TLR4 a jusante,
através da interacção de vários complexos de proteína, conduz à activação da MyD88-dependente ou
vias independentes de MyD88 e, consequentemente, para as citocinas pró-inflamatórias ou de
interferão do tipo I a ser libertado, respectivamente [39]. Neste ponto, devemos prestar atenção para
dois aspectos analisados neste trabalho; em primeiro lugar, a influência de irisin nos macrófagos em
repouso, e em segundo lugar em macrófagos estimulados por LPS. Análise realizada em células
quiescentes indicaram que o pré-tratamento dos macrófagos com uma baixa concentração resulta
irisin no aumento da expressão de TLR4, o que pode sugerir o aumento da capacidade dos
macrófagos para reconhecer os potenciais agentes patogénicos. No entanto, deve ser tido em conta
que TLR4 é uma proteína altamente glicosilada que afeta sua funcionalidade em termos de
reconhecimento LPS [41]. Nossos próximos estudos sugerem influência que de irisin na glicosilação
e a formação de glycoforms TLR4 são possíveis (estudo em desenvolvimento). No entanto, mais
estudos são necessários para explicar e verificar esses aspectos. Além disso, a libertação diminuída
de TNFa e IL-1β na fase de repouso, também deve ser enfatizada. Outros factores analisados não
eram significativamente diferentes, mas a redução de TNFa e IL-1β libertação chama a atenção para
um potencial de redução na actividade pró-inflamatória espontânea destas células. O nosso estudo
anterior [25] Indicaram, além disso, que irisin aumenta a proliferação de macrófagos e tem um
impacto positivo sobre a fagocitose de bactérias e ao mesmo tempo que inibem a geração de explosão
respiratória. No estado de activação dos macrófagos por estimulação com LPS, irisin de pré-
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tratamento induziu efeitos anti-inflamatórios proeminentes, estreitamente ligada com as vias a
jusante TLR4 / MyD88. Nós
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observou-se uma redução dependente da dose, na expressão da proteína TLR4 após pré-tratamento
irisin, que foi acompanhada por uma redução no nível de MyD88. Deve notar-se que a via / MyD88
TLR4 activa a sinalização tal como a activada por mitogio proteína quinase via (MAPK), bem como a
via de NF-kB. Este estudo indica que irisin modula tanto a activação de NF-kB e da via de MAPK,
levando a uma redução da fosforilao dos factores mencionados. O efeito anti-inflamatório do pré-
tratamento irisin, sugerido neste trabalho, foi manifesta-se principalmente pelo abaixamento da
expressão e secreção de citocinas inflamatórias chave. Observou-se uma redução em TNF, IL-1β, IL-
6, MCP-1, os níveis de KC e HMGB1, o que pode ser explicado pela inibição acima mencionada da
via / MyD88 TLR4. O impacto da irisin sobre a inibição do TNF, IL-1β, e IL-6 foi previamente
mencionado por Dong et al. [38], Que também observou a promoção da polarização alternativa de
macrófagos submetidos irisin estimulação. Além disso, o nosso estudo mostrou que irisin inibe a
expressão e libertação de HMGB1, uma proteína de ligação a DNA nuclear que pode ser segregada
activamente por macrófagos estimulados, ou passivamente por culas danificadas ou necricas [42].
Como um mediador da inflamação tarde, a HMGB1 induz uma activação independente de LPS de
NF-? B [43] E, consequentemente, aumenta a secreção de factores pró-inflamatórios, incluindo
TNFa. Devido à acção de HMGB1, pode ser observada a amplificação da resposta inflamatória [44].
No nosso estudo, o nível de HMGB1 foi eficazmente reduzido por uma elevada concentração de
irisin, mas os mecanismos desta inibição deve ser examinada no futuro.
Em conclusão, como apresentado no nosso estudo, irisin alivia a activação inflamatória de
macrófagos estimulados por LPS. O efeito anti-inflamatório de irisin, observado neste estudo, é
mediado pela inibição da via de jusante de RST4 / MyD88, o qual está ligado com a fosforilação da
MAPK suprimida e, consequentemente, uma menor activação de NF-kB. Como resultado destas
alterações, observou-se a redução em ambas a expressão e libertação de citocinas pro-inflamatórias,
tais como IL-1β, TNFa, IL-6, KC, MCP-1 e HMGB1. Os nossos resultados podem sugerir que as
propriedades benéficas e anti-inflamatórios da actividade física, bem como os potenciais efeitos
protectores de irisin contra o desenvolvimento de doenças associadas com a obesidade, pode pelo
menos em parte, ser associado com propriedades anti-inflamatórias do irisin.

4. Materiais e métodos

4.1. Produtos químicos e materiais

Meio DMEM, antibióticos (estreptomicina e penicilina), soro fetal de bovino (FBS) foram
adquiridos a partir de PAA (Pasching, Austria). Lipopolissacarídeo (LPS) foi adquirido de
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Irisin foi comprado de Cayman. kit de anexina V, os
anticorpos de Fc de bloco, solução Cytofix / Cytoperm, PerCP-Cy5.5 estreptavidina, citometria
de grânulo matrizes para JNK, ERK e p38 quantificação foram adquiridos a partir de BD
Biosciences Pharmingen (San Diego, CA, EUA). Fosfo-NF-kB anticorpo monoclonal de coelho
(ser536) Alexa Fluor 647 conjugado foi adquirido a partir de Cell Signaling Technology
(Beverly, MA, EUA). kit de ELISA para HMGB1 e IL-1β foram adquiridos a partir deIBL
International (Hamburgo, Alemanha). RNeasy Além disso Mini Kit (74134) para isolamento de RNA
foi obtido de Qiagen (Hilden, Alemanha). Alta Capacidade para ARN-ADNc-Kit (4387406) para a
transcrição reversa e TaqMan Gene Master Mix expresson (4369026) para PCR em tempo real
foram obtidos de Applied Biosystems (ThermoFisher; Foster City, CA, EUA).

4.2. Cultura celular e Desenho Experimental

O estudo foi realizado em um RAW 264.7 linha celular de macrófagos-like murino (Colecção
Europeia de Culturas Tipo, ETCC, Sigma), livre de contaminação por micoplasma. As células foram
cultivadas sob condições padrão (37 ◦C, 5% de CO2) em meio DMEM suplementado com 1% de
antibiótico, 10% de soro fetal bovino, e irisin (0-100 nM), durante 24 h, e depois disso o as células
foram estimuladas com LPS (100 ng / mL; Escherichia coli, serotipo 0111: B4). células frescas foram
usadas para teste de MTT, por citometria
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avaliação e o isolamento de ARN. Os sobrenadantes foram congelados (-60 ◦C) para futuro
quantificação dos níveis de citocinas.

4.3. Colorimétrico Exame da viabilidade global celular

A viabilidade celular total e a actividade foi medida atrav do ensaio de redução de 3- (tiazol-2-il
4,5-dimetil) -2,5-difenil (MTT) a formazano, de acordo com as instruções do fabricante e quantificar
numa espectrofotômetro (Expert Além disso, ASYS / Hitech, Eugendorf, Áustria).

4.4. Quantitative PCR em Tempo Real Assay

Quantitative PCR em tempo real foi utilizado para avaliar a RST4, TNFa, IL-1β, IL-6, MCP-1,
KC e a expressão do gene HMGB1. Extraiu-se ARN a partir de células RAW 264.7 utilizando RNeasy
Mini Kit Além disso (Qiagen, 74134) e da transcrição reversa foi realizada utilizando a alta
capacidade de ARN-ADNc para-Kit (Applied Biosystems, 4387406), de acordo com os protocolos do
fabricante. PCR em tempo real foi realizada utilizando TaqMan Gene expresson Mestre Mix
(Applied Biosystems, 4369026) no Passo Um termociclador Plus (Applied Biosystems). A expressão
de genes analisados foram normalizados para o nível de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato
(GAPDH), utilizado como um gene de manutenção expressão. a expressão de ARNm de cada
amostra foi determinada em cada quatro e cinco (isolamento de ARN separado) utilizando o método
2-ΔΔCt.

4.5. Análise de citometria de fluxo

O impacto sobre a apoptose irisin macrófagos foi determinada utilizando um kit de anexina V
de acordo com o protocolo fornecido pelo produtor. Para a análise, 10.000 células foram adquiridos.
As células foram pré-tratados previamente com irisin (0-100 nM) durante 24 h e,
subsequentemente, com LPS (100 ng / mL) durante mais 24 h.
O nível de MyD88 e NF-kB foram detectados por citometria de fluxo ap marcao com um
anticorpo fluorescente. Resumidamente, após uma pré-incubação de 24 h com irisin (0-100 nM), as
culas foram estimuladas com LPS durante 24 horas adicionais. Depois disso, as células foram
desprendidas, bloqueadas com Fc-bloco (0,5 mg / mL; 1: 200; 20 min; 4 ◦C),
fixo, e permeabilizadas de acordo com o fabricante de instruções (Cytofix / Cytoperm) e tratados
com um anticorpo apropriado. Para a detecção de MyD88, o anticorpo anti-biotina MyD88 (0,2 mg
/ mL; 1: 200; 20 min; 4 ◦C) e PerCP-Cy5.5 estreptavidina (0,2 mg / mL; 1: 200; 20 min; 4 ◦C ) foram
usados; para
a detecção da forma fosforilada de NF-? B, as células foram coradas com anticorpo de fósforo-NF-kB
(Ser536) Alexa Fluor 647 conjugado monoclonal de coelho (0,1 mg / mL; 1: 100; 20 min). Todos os
antígenos foram detectados separadamente. Para análise de dados, 10.000 células pré-marcada
foram recolhidos.
Os níveis das formas fosforiladas de cinases de JNK, ERK e p38 foram determinados usando
um Bead comerciais de citometria de matrizes de acordo com o protocolo do fabricante.
Todas as amostras foram adquiridas e analisadas num citómetro de fluxo FACScan
(FACSCaliburTM; BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) utilizando CBA e o software CellQuest (BD
Biosciences, San Diego, CA, EUA).

4.6. Elisa Exame de Citocina / Quimiocina lançamento

Os níveis de tais citoquinas como TNF, IL-1β, IL-6, MCP-1, KC e HMGB1 foram quantificados
usando um ELISA Kit comercial, de acordo com as instruções do fabricante e medida num
espectrofotómetro (Expert Além disso, ASYS / alta tecnologia, Eugendorf , Áustria). Todas as
citoquinas foram medidas separadamente em sobrenadantes recolhidos após 24 horas de
estimulação com LPS.

4.7. Análise estatística

Os dados foram testados quanto à normalidade de distribuição, e as diferenças entre os grupos
foram determinadas usando ANOVA com análise post hoc de Tukey. Todos os dados foram
expressos como média ± erro padrão (X ± SE) com o nível de significância estatística (p) de 0,05.
Int. J. Mol. Sei.2017, 18, 701 10 de
11

Agradecimentos: Este estudo foi apoiado financeiramente pelo projeto de pesquisa No. K / DSC / 002.108
(Ministério da Ciência e Ensino Superior, Polónia) para Agnieszka Mazur-Bialy. Os autores agradecem Andrzej
Doniec, um estudante de PhD do Departamento de Genética e Evolução (Instituto de Zoologia da Universidade
Jagiellonian, Cracóvia, Polónia), pela excelente assistência técnica PCR em tempo real.
Contribuições do autor: Agnieszka Irena Mazur-Bialy concebido e desenhado os experimentos;
Agnieszka Irena Mazur-Bialy e Ewa Pochec' realizada PCR em tempo real; Agnieszka Irena Mazur-Bialy
realizada todas as outras avaliações; Agnieszka Irena Mazur-Bialy, Ewa Pochec' e Marcin Zarawski analisados
os dados; Agnieszka Irena Mazur-Bialy contribuiu reagentes / materiais / ferramentas de análise; Agnieszka
Irena Mazur-Bialy escreveu o jornal, e Ewa Pochec' escreveu a introdução; Marcin Zarawski realizada correção
de manuscrito e edição; Agnieszka Irena Mazur-Bialy gerido e coordenado o projeto.
Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

abreviaturas
ATMs macrófagos do tecido adiposo
FNDC5Fibronectin domínio de tipo III contendo 5
proteína caixa de grupo mobilidade HMGB1High 1
IL-1β 1β interleucina
IL-6 6Interleukin
KCKeratinocyte quimioatraente
LPSLipopolysaccharide
proteína MAPKsMitogen-activada quinases
MCP-1Monocyte proteína quimiotática 1
diferenciação MyD88Myeloid proteína resposta primária de
NF- κBNuclear fator kB
p-ERKPhospho sinal-regulada extracelular quinase p-
JNKPhospho c-Jun N-terminal cinase
TLR4Toll-like receptor 4
TNFα Tumor α factor de necrose
WAT tecido adiposo branco

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