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Los hidroperóxidos generalmente sufren una oxidación adicional que los convierte en
productos secundarios de oxidación. Silvagni et al. [5] propusieron un modelo cinético
alternativo donde los aldehídos se generan no solo a través de la degradación directa de
hidroperóxidos sino también a partir de radicales peroxilo a través de una ruta
independiente. Este mecanismo implica una reacción bimolecular para formar tetraóxidos
intermedios, que son inestables a altas temperaturas y se descomponen para dar radicales
alcoxi.
La amplia variedad de productos de oxidación secundaria que produce la oxidación incluye
aldehídos, cetonas, epóxidos, compuestos hidroxi, oligómeros y polímeros. Entre ellos, se
pueden encontrar tanto compuestos volátiles como no volátiles, como hexanal o
malondialdehído (MDA) como principales representantes, respectivamente.
La evaluación del estado de oxidación de los lípidos es una tarea desafiante debido a una
serie de hechos, como los diferentes compuestos que se forman dependiendo del tiempo,
el grado de oxidación y el mecanismo involucrado. Por lo tanto, elegir un solo parámetro
para analizar el estado oxidativo es bastante difícil y con frecuencia es más conveniente
combinar diferentes métodos. Además, como lo expresan Eymard et al. [6], no solo la
naturaleza y composición de los lípidos como sustrato de la reacción tienen un impacto en
el proceso de oxidación de los lípidos, sino también el tipo y la concentración de
proteínas, antioxidantes y prooxidantes presentes en la matriz alimentaria, así como sus
características fisicoquímicas son parámetros que vale la pena tener en cuenta.
Dependiendo de la fuente de alimento, la oxidación de lípidos es diferente. Por ejemplo,
en muestras de carne, Richards y Dettmann [7] sugirieron que las tasas de oxidación de
lípidos pueden depender de la capacidad relativa de las hemoglobinas de diferentes
especies animales para promoverlo, y Chen et al. [8] propuso que las estructuras
coloidales formadas por fosfolípidos en aceites vegetales podrían tener un impacto en la
estabilidad oxidativa de los aceites alimentarios; también se observó que la oxidación de
lípidos se retrasó en las salchichas de pescado después de la adición de varios
antioxidantes [9], y en muestras de leche, el papel de las catequinas y el ácido ascórbico
se ha estudiado recientemente en la oxidación [10]. Además, cada método permite una
serie de condiciones experimentales diferentes, y junto con la falta de uniformidad entre
los laboratorios, conduce a resultados disímiles que son hoy en día inevitables.
Finalmente, la mayoría de los compuestos de oxidación son propensos a degradarse aún
más, lo que proporciona una fuente adicional de divergencia. En consecuencia, se debe
mantener un control preciso del procedimiento experimental.
Peroxides
Las propiedades redox de los hidroperóxidos son la base de algunos de los métodos clave
aplicados en su determinación. Un número de reactivos puede ser oxidado por
hidroperóxidos, incluyendo iones inorgánicos simples, como yoduro o ión ferroso. Estos
métodos generalmente requieren una complejación posterior para mejorar la
sensibilidad.
Método volumétrico
Además del método volumétrico, los espectroscópicos son bastante simples y son
moderadamente sensibles, confiables y reproducibles cuando se llevan a cabo en
condiciones estandarizadas. Por el contrario, son altamente empíricos en vista del hecho
de que miden mezclas complejas de moléculas oxidadas. Además, generalmente
requieren mucho trabajo y usan grandes cantidades de solventes y reactivos que pueden
ser peligrosos [13].
Cromatografía
Sin embargo, todas las metodologías descritas anteriormente son, en general, bastante
simples en cuanto a la base teórica, la implementación del procedimiento y la
interpretación ulterior de los datos, que presentan una sensibilidad y selectividad baja a
moderada. En este caso, las técnicas cromatográficas son mucho más precisas, sensibles y
específicas para el compuesto de interés, lo que permite una mejor identificación de los
productos individuales. En realidad, su implementación para la determinación de
hidroperóxidos en lugar de las mediciones volumétricas y espectroscópicas muestra una
tendencia creciente en los últimos años. Como consecuencia inevitable, los métodos
cromatográficos generalmente requieren un trabajo experimental largo o meticuloso, el
control preciso de las condiciones experimentales y el procesamiento de datos es
complejo.
Cromatografía líquida
Cromatografía de gases
La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) también se puede
utilizar para el análisis de hidroperóxidos de lípidos, pero debido a su termolabilidad, se
necesita una reducción previa de los hidroperóxidos. Este hecho, junto con la extracción
previa de lípidos y el posterior paso de derivatización, lo convierte en un método
engorroso y lento [27].
Los productos de oxidación primaria de lípidos pueden generar, si están expuestos a otras
condiciones de oxidación, productos de oxidación secundarios, que incluyen aldehídos,
cetonas, epóxidos, compuestos hidroxi, oligómeros y polímeros. Estos compuestos
muestran una amplia variedad de propiedades fisicoquímicas, que difieren principalmente
en volatilidad, polaridad y peso molecular. Se comentarán los grupos más relevantes de
compuestos (aldehídos, compuestos volátiles y polímeros), así como una molécula
particular muy frecuentemente utilizada como marcador de oxidación (malondialdehído).
Malondialdehído
El malondialdehído (MDA) es uno de los aldehídos más abundantes que se generan
durante la oxidación secundaria de los lípidos y también es probablemente el más
utilizado como marcador de oxidación.
Espectroscopía UV-Vis
Cromatografía
Espectroscopía UV-Vis
Cromatografía
Volatiles
Bajo este grupo de productos de oxidación secundaria, se ha incluido una gran diversidad
de compuestos, presentando grupos funcionales muy diferentes: aldehídos, cetonas,
alcoholes, ácidos carboxílicos cortos e hidrocarburos. Todos comparten la propiedad de
dar olores de moderados a altos y están relacionados con la ranciedad en las pruebas
sensoriales. La medición de estos productos secundarios de oxidación es de gran
importancia, ya que su formación se relaciona estrechamente con el deterioro del sabor.
Algunos de estos compuestos volátiles son altamente específicos para la degradación
oxidativa de una familia particular de ácidos grasos poliinsaturados: el propanal es el
principal marcador de la oxidación de los ácidos grasos n-3, mientras que el hexanal y el
pentanal son marcadores de la oxidación de los ácidos grasos n-6. Tanto el propanal como
el hexanal se usan a menudo como indicadores de la oxidación de los lípidos en los
alimentos porque se pueden medir en el espacio de cabeza de la muestra y carecen de
dobles enlaces, lo que los hace más estables frente a la oxidación que los aldehídos
insaturados. Sin embargo, el hexanal se mide con mayor frecuencia ya que su formación
es más alta que la de la mayoría de los productos de oxidación secundaria, salvo algunas
excepciones. Sin embargo, la medición del grado de oxidación con solo uno o dos
marcadores es un enfoque bastante tosco, por lo que los métodos que implican la
evaluación de un gran conjunto de compuestos deben promoverse [28].
La cromatografía de gases es el método preferido para cuantificar las moléculas volátiles y
la detección por espectrometría de masas contribuye a identificarlas. Se pueden usar
diferentes métodos para recuperar compuestos de oxidación volátiles antes del análisis
cromatográfico, que incluyen: (a) extracción con solvente y (b) técnicas de espacio de
cabeza (HS).
(a) Aunque las extracciones líquido-líquidas no son muy adecuadas para recuperar el
contenido volátil porque son largas, laboriosas y requieren una etapa de evaporación del
solvente, lo que conduce a una degradación sustancial del compuesto volátil,
recientemente se han propuesto nuevas variantes para superar algunas de estas
limitaciones . Nótese especialmente la extracción por destilación simultánea (SDE) y la
extracción por destilación a vapor a presión reducida (RPDE). Ambos permiten obtener
compuestos con un punto de ebullición relativamente alto, pero con la evaporación de
RPDE se alcanza con temperaturas más bajas, evitando la posible formación de artefactos
[72]. SDE y RPDE muestran la ventaja de poder extraer grandes cantidades de compuestos
diana, ya que las fracciones volátiles generalmente tienen una alta solubilidad en
disolventes orgánicos [73, 74]. Por otra parte, Ferhat et al. [75] desarrolló un método de
extracción mediado por energía de microondas. Las extracciones líquido-líquido son los
métodos de recuperación preferidos siempre que las muestras requieran una etapa de
derivación previa al análisis cromatográfico (HPLC y GC). Los derivados de DNPH,
benciloxima y tiazolidina son los compuestos utilizados con más frecuencia para mejorar
la estabilidad y / o detección mediante espectrometría ultravioleta-visible, ionización de
llama, detección de nitrógeno-fósforo y espectrometría de masas [76].
(b) El análisis de HS se puede realizar mediante el espacio de cabeza estático (SHS), el
espacio de cabeza dinámico de purga y captura (DHS) o las técnicas de microextracción en
el espacio de cabeza-fase sólida (HS-SPME). Todos ellos son anteriores al análisis de
cromatografía de gases.
Oligómeros / polímeros
Durante la oxidación prolongada, un compuesto lipídico puede unirse entre sí con uno o
varios, dando lugar a dímeros, oligómeros o polímeros. El análisis simultáneo de formas
oxidadas de triacilgliceroles y sus oligo / polímeros es muy común para evaluar el progreso
de oxidación de lípidos. Los monómeros son muy reactivos y se correlacionan con la
precisión con el valor de peróxido, por lo que podrían dar información sobre el nivel de
oxidación primaria de una muestra. Por el contrario, los oligopolímeros de triacilgliceroles
son compuestos bastante estables, que se consideran como buenos indicadores del
estado de oxidación secundaria [85, 86].
La cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HPSEC) ha demostrado
proporcionar resultados satisfactorios en el análisis de este tipo de productos de
oxidación. Permite la separación y posterior identificación y cuantificación de moléculas
de acuerdo con su peso molecular. Por lo general, se realiza en compuestos polares, por lo
que requiere una purificación previa de la fracción de lípidos polares, que generalmente
se realiza mediante cromatografía en columna de gel de sílice. Algunos estudios [1, 87, 88]
han demostrado la utilidad de HPSEC en la determinación de los niveles de degradación
oxidativa en una variedad de muestras de alimentos, y particularmente en aceites
vegetales refinados, cuyo proceso tecnológico implica un deterioro de la calidad. Morales
et al. [33] lo aplicó para la determinación de la oxidación avanzada en aceites vegetales a
través de la detección de polímeros de ácidos grasos. La formación de oligómeros durante
la termooxidación de fitoesteroles también se ha informado [89-92] por medio del análisis
HPSEC.
Alternative methodologies
Las técnicas anteriores son demasiado empíricas o dependen mucho de varios factores
experimentales, como la habilidad técnica, la exposición a la luz y el oxígeno atmosférico,
aparte del hecho de que consumen mucho tiempo. Para evitar estas limitaciones, se han
propuesto diversas metodologías como buenas alternativas en el análisis de productos de
oxidación primarios y secundarios. Se basan en análisis espectroscópicos directos de
muestras, como resonancia magnética, fluorescencia y espectroscopia vibratoria, y en
propiedades quimioluminiscentes. Como buenas características generales, el tratamiento
preliminar es mínimo o innecesario, se requiere poca cantidad de muestra y se obtienen
resultados muy específicos.
Quimioluminiscencia
Ciertas reacciones químicas generan radiación electromagnética. Esta emisión de energía
se conoce como quimioluminiscencia (CL) y se puede aplicar para detectar y cuantificar
compuestos de interés. Sin embargo, la intensidad de la luz es muy baja (la LC ultrabaja se
acompaña durante la oxidación de hidrocarburos y lípidos [93]), por lo que se deben
introducir amplificadores de luz para aumentarla. Uno de los más utilizados es el luminol.
La quimioluminiscencia potenciada por luminol implica la oxidación de luminol en una
solución básica que genera un intermedio de radical libre que reacciona con el flujo de
agentes oxidantes (radicales libres activos) presentes en el sistema, por ejemplo,
hidroperóxidos de lípidos. Esto conduce a la formación de un producto derivado de
luminol en estado excitado, que finalmente vuelve al estado fundamental emitiendo una
luz azul fuerte a 430 nm [94]. Las diferentes versiones de este método difieren en el tipo
de radical libre activo producido y el modo de producción de radicales libres, así como en
los detalles del procedimiento. Robinson et al. [95] sugirió la adición de p-yodofenol para
proporcionar una emisión de luz más intensa, prolongada y estable en comparación con el
sistema de luminol tradicional. Más recientemente, se desarrolló un nuevo método de
quimioluminiscencia en medio CL no acuoso para detectar peróxidos lipídicos en aceites
vegetales [96], presentando una buena correlación con el análisis PV espectrofotométrico.
Baj et al. [97] descubrieron que la exclusión parcial de oxígeno del medio de reacción
influye fuertemente en la intensidad de la luz de la reacción de luminol y el efecto
depende del oxidante analizado, por lo que se sugirió un mecanismo alternativo para
algunas especies oxidantes. Además, declararon que la concentración de oxígeno siempre
afecta la reproducibilidad de los resultados, por lo que equilibrar las soluciones de trabajo
con oxígeno o aire siempre debería conducir a resultados más precisos.
Las características atractivas de los métodos CL son el menor consumo de tiempo
(tomando solo unos pocos minutos), la sensibilidad (se han evaluado los niveles de
picomol), bajos requerimientos de muestra, bajo costo y simplicidad en comparación con
otros métodos [98]. En cuanto a las deficiencias de este tipo de métodos, la teoría cinética
y el mecanismo para los procesos químicos que resultan en CL no se conocen en detalle y
esto puede ocasionar problemas en la interpretación de los datos. Además, este método
no es específico para los lípidos, ya que otros agentes oxidantes también dan señal, pero
esta oportunidad puede aprovecharse para estimar el estado total de oxidante total de la
muestra.
Bunting y Gray [99] desarrollaron un sistema de quimioluminiscencia por inyección de
flujo automático para medir las concentraciones de hidroperóxido lipídico en aceites e
informaron buena concordancia con un ensayo de titulación yodométrica tradicional, lo
que podría indicar la utilidad de los métodos CL para evaluar la oxidación primaria de los
lípidos; y también en aceites vegetales, Yang et al. [100] encontró una tendencia similar
para las mediciones de TBARS y CL durante la oxidación.
Espectroscopía de fluorescencia
Espectroscopia infrarroja
La espectroscopía infrarroja (IR) también se conoce como una forma muy útil de estudiar
la degradación de los lípidos en condiciones de oxidación [113], particularmente porque
es una tecnología fácil, rápida, económica y no destructiva. Se basa en la determinación
de transiciones vibratorias fundamentales de un compuesto particular e implica la
absorción de niveles discretos de energía de la región IR. Estos niveles discretos de energía
son característicos de cada enlace átomo-átomo, por lo que estudiar el espectro IR puede
proporcionar suficiente información para descubrir la naturaleza del compuesto analizado.
Las herramientas matemáticas, como la transformada de Fourier (FT) o los métodos
quimiométricos, permiten el procesamiento de datos. El monitoreo del envejecimiento
continuo se puede llevar a cabo con esta metodología, aunque por el momento, la
mayoría de los trabajos se han evaluado de manera discontinua. Recientemente se han
realizado algunos avances gracias a los nuevos dispositivos tecnológicos [114].
IR se ha aplicado para medir el valor del peróxido en los lípidos oxidados [115], y se
observaron diferencias en los espectros IR de los aceites frescos y envejecidos [116, 117],
por lo que los espectros IR se pueden utilizar para caracterizar el envejecimiento de varios
comestibles aceites [118-122]. La investigación de los espectros FTIR de los aceites
tratados reveló que el calentamiento con microondas de aceites [123] causó cambios
significativos en la intensidad de sus bandas de absorción y no produjo cambios en la
posición de las bandas. Estos cambios se atribuyeron a la reducción en el contenido de
ácidos grasos 18: 2 y 18: 3 debido a la oxidación.
También se ha utilizado para el análisis de aceites comestibles [124], empanadas de jurel
[125] y jugo de tomate enlatado [126], en combinación con otros métodos analíticos que
conducen a conclusiones similares, proporcionando por lo tanto bandas marcadoras que
mejoran la comprensión de los cambios químicos que tienen lugar durante el
procesamiento y almacenamiento.
Espectroscopía Raman
Magnetic resonance
Conclusión