UNIVERSIDAD NACIONAL “HERMILIO VALDIZÁN”

CARRERA PROFESIONAL INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

CURSO: ANÁLISIS POR INSTRUMENTACIÓN

DOCENTE: RUTH ESTHER CHAMORRO GOMEZ

PRÁCTICA N° 03: CUANTIFICACIÓN DE ANTOCIANINAS TOTALES POR EL MÉTODO

DEL pH DIFERENCIAL

Fabián Díaz, Jhordan Jhampierd; Rafael Orihuela, Angelina Thais

1. INTRODUCCIÓN

Se ha demostrado que frutos ricos en antocianinas evidencian una alta actividad antioxidante contra el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y contra radicales peróxidos, (ROO), superóxido (O2), hidroxilo (-OH)
y oxígeno singulete. El interés en los pigmentos de antocianina también se ha incrementado por su
color, ya que se podrían utilizar como colorantes naturales, las antocianinas son glucósidos de
antocianidinas, pertenecientes a la familia de los flavonoides, compuestos por dos anillos aromáticos A
y B unidos por una cadena de 3 carbonos. Variaciones estructurales del anillo B resultan en seis
antocianidinas conocidas (cianidina, malvidina, pelargonidina, petunidina, delfinidina y peonidina).
(Cosavalente, Ruiz & Ganoza, 2016).
Rubus es uno de los géneros más diversos de plantas y se distribuye en todo el mundo, la diversidad de
este género se manifiesta en la gran variedad de frutos y su pigmentación. Los frutos de las especies del
género Rubus contienen compuestos fenólicos a los cuales se les reconoce como agente
quimiopreventivo, las antocianinas entran en este grupo, se ha encontrado una gran variación en el
contenido de antocianinas, así como en la capacidad antioxidante. Diversos estudios epidemiológicos
indican que el consumo de productos vegetales como frutas y verduras, con altos contenidos de
compuestos fenólicos, reducen la propensión a enfermedades cardiacas, cerebrovasculares y
disminuyen la tasa de mortalidad por cáncer. Genotipos de Rubus de origen mexicano han sido
reportados con actividad antioxidante y antiinflamatoria. En la actualidad hay un interés creciente en
los antioxidantes, en particular en aquellos que previenen los efectos nocivos de los radicales libres en
el cuerpo humano, existe preferencia por los antioxidantes naturales y no de fuentes sintéticas,
(Martínez, 2011).
Uno de los principales factores del medio que afecta la estabilidad del color de las antocianinas es el
pH. Dependiendo del pH las antocianinas pueden existir en cuatro especies diferentes: base quinoidal,
catión flavilio, pseudobase carbinol y chalcona. En soluciones muy ácidas (pH < 0.5) el catión flavilio
rojo es la única estructura. Con incrementos de pH la concentración del catión decrece al mismo tiempo
que la hidratación da lugar a la base de carbinol incolora. Entre pH 4 y 5.5 habrá poco color, debido a
que las dos formas coloreadas estarán en bajas concentraciones y el equilibrio se desplazará a las formas
Incoloras. Por lo tanto, la forma chalcona es la más susceptible a la degradación, y la forma iónica
flavilio es la más estable (Wesche-Ebeling & Montgomery, 2000).

2. OBJETIVOS Espectrofotómetro, Balanza analítica, pH

 Conocer el método y determinar el metro, agitador magnético, vaso
contenido de antocianinas totales en precipitado, fiola, pipetas, tubo de ensayo
muestras alimenticias, mediante el método Micropipetas de volumen graduable,
de pH diferencial. cubetas de espectofometro,
3.3 reactivos
3. MATERIALES Y MÉTODO KCl, HCl, CH3, COONa.
3.1 Muestra
3.4 Método
3.2 Materiales y Equipos
a) Preparación de soluciones
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1. Buffer ph =1,0:,125ml de 0,2 M KCl y
375 ml de 0,2 M HCl.
2. Buffer ph =4,5: 400 ml de l M CH3
COONa, 240 ml de l M HCl y 360 ml
de H20
3. Verificar el ph de los buffer
b) Preparacion de los extractos.
5 g de muestra sera extraido en agitación con
100 ml de agua, alcohol u otro solvente, durante
15 min. El extracto será filtrado
c) Cuantificación de antocianinas totales
Tomar 2 alicuotas de 400 ul de muestra y
diluir con el buffer ph =1,0 y ph = 4,5
(4600ul). Registrar la absorción a 510nm .
La cocentracion de antocininas sera
calculada mediante la siguiente ecuación.
C(mg/L)= (Aph=1.0 – pH=4.5.
Aph=4,5)*484.82(1000/24825)*DF
Donde:
484,82 es la masa molecular de la cianidina
y -3 glucocido, 24825 es la absortividad
molar a 510 nm, a Ph =1,0; ph=4,5 es la
correccion de la formación de productos de
degradación, DF es el factor de dilución.
4. RESULTADOS
I. Pruebas Fitoquímicas
Cuadro 3. Pruebas de tamizajes realizadas al
extracto de zarzamora.
Cuadro 4. Resultados del buffer a pH=4.5 del
extracto de zarzamora (Rubus ulmifolius).
*Blanco buffer pH=4.5
Cuadro 2. Resultados del buffer a pH=1.0 del
extracto de zarzamora (Rubus ulmifolius).
Para la obtención de la concentración de
antocianina se utilizó la fórmula de pH diferencial:
A= (Aλvis-max-Aλ700)pH1-(Aλvis-max-
Aλ700)pH4.5
A= (1.483-¿)pH1-(¿-0.571)pH4.5
A=
-En donde Aλvis-max es la lectura del pico mas
alto a pH=1 y pH=4.5.
- Aλ700 es la lectura nm, tanto para pH=1 como
5. DISCUSIONES
 Según Martínez (2011), la palabra
antiocianina deriva del griego anthos (flor)
y kyanos (azul oscuro). Las antocianinas
son las responsables de los colores rojos,
azulados o violetas de la mayoría de las
frutas y flores. La experiencia consistió en
medir la cantidad de antocianinas presente
en una muestra se zarzamora por el método
de pH diferencial. En donde se pesó 115,85
g de zarzamora y se le adiciono 150 mL de
etanol acidificado (135 mL de etanol 95%
y 15 mL de HCl 0,2 ml), luego se esperó
cierto tiempo y se filtró la muestra
concentrada de la cual luego se tomó 10mL
de y se llevó en una proporción de 1:4
(13,5 de etanol y 1,5 mL de HCl), de la
proporción 1:4 se tomó 10 mL y se llevó a
una proporción 1:6. Posterior a esto se
tomó 1 mL de cada proporción y se le
añadió 4 mL de buffer pH 1 (Cloruro de
potasio) y pH 4,5 ( acetato de plomo).
Estas disoluciones se leyeron a una
absorbancia de 514 nm. Luego se hicieron
otras promociones de 1:9,3:7 y 5:5 a un pH
4.5 y estas se leyeron a una longitud de
770nm.
 Según (Cosavalente, K., Ruiz, S. &
Ganoza, M. (2016) es recomendable que
antes de llevar acabo las mediciones se
haga una lectura para ver si la muestra no
se desvía de la ley de Lambert y Beer. Si
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esto ocurre se debe variar el factor de

dilución de la muestra, hasta obtener un
rango que vaya de (0-1.0), ya que la ley de
Lambert y Beer no se cumplen a
concentraciones muy bajas o altas. La
relación entre la absorbancia y la
concentración deben dar un gráfico de
línea recta.
Otras consideraciones que debemos tomar
en cuenta es que las diluciones deben ser
claras y no contener sedimentos o turbidez,
si fuese así debemos ya sea centrifugar o
filtrar la muestra.

6. CONCLUSIONES

 Las antocianinas desarrollan

transformaciones estructurales reversibles
con el cambio de pH manifestado por el
espectro a diferentes absorbancias.
Conociendo que, la forma de oxoanionicas
coloreada predomina a pH 1 y la forma c
hemicetal incolora a pH 4,5, se establece el
método de pH diferencial, que se basa en
esta reacción para medir el total de
antocianinas en la muestra de zarzamora.

 No se determino el contenido total de 8. REFERENCIAS

antocianinas presentes en los extractos de
zarzamora trabajados, debido a que no se
leyeron todas las diluciones en las
longitudes trabajadas (514-770)nm, pero si
se evidencia que estas estaban presentes
con los datos que se obtuvieron en las
lecturas obtenidas se encontraban dentro
del rango a la cual absorben las
antocianinas en el UV visible.
7. RECOMENDACIONES
 Cuantificar la presencia de antocianinas
que había en el extracto de zarzamora que
utilizamos debido a que no se leyeron
todas las diluciones en las dos longitudes
de ondas a las que trabajamos (514-770)
nm.
 Cosavalente, K., Ruiz, S. & Ganoza, M.
(2016). Antocianinas totales y capacidad
antioxidante in vitro de extractos de
diferente grado etanólico del fruto de
Vacciniumcorymbosum “Arándano”.
UCV-Scientia, 8 (1), 44-48.
 Wesche‐Ebeling, P. & Montgomery, M.
(2000). Strawberry polyphenoloxidase: its
role in anthocyanin degradation. Journal
of Food Science, 55(3), 731-734.
Recuperado el 6 de octubre de 2018.
Disponible en:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.111
1/j.1 365-2621.1990.tb05217.x/epdf
 Martínez, N. (2011). Antocianinas y
actividades anti radicales libres de
Rubus adenotrichus Schltdl
(zarzamora). Revista mexicana de
ciencias farmacéuticas, 42 (4), 66-71.
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