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Degradación de Poliestireno mediante la microbiota del Tenebrio molitor y Artemia franciscana

Resumen El poliestireno (PS) es un problema de contaminación a nivel mundial, debido a la deficiencia de su reutilización y la dificultad para ser degradado. Con el objetivo de encontrar una solución sustentable a este conflicto se realizaron diversas pruebas con la microbiota de las larvas del Tenebrio molitor y la Artemia franciscana para determinar la capacidad de degradación de este polímero. Para la realización de esta investigación se alimentaron durante una semana las larvas de Tenebrio molitor con espuma de poliestireno y las Artemia franciscana con alimento comercial. Posteriormente, se obtuvo la microbiota por disección del tubo digestivo de las larvas de Tenebrio molitor y del encéfalo de la Artemia franciscana la cual se incubó a 30 ± 2 ºC por cinco semanas en medio libre de carbono adicionando 1 g de poliestireno para emplearlas en la degradación de espuma de poliestireno. De la microbiota obtenida se realizó el aislamiento sobre placas con medio Luria Bertaini a 24 h y 30 ± 2 ºC. Las colonias aisladas fueron incubadas en caldo nutritivo permitiendo el desarrollo bacteriano el cual se cuantificó por el método McFarland. Los resultados obtenidos hasta el momento nos permiten concluir que la larva de Tenebrio molitor tiene la capacidad para consumir el poliestireno y las bacterias aisladas de su tracto digestivo pueden utilizar el PS como fuente de carbono. Sin embargo, las bacterias aisladas de la Artemia franciscana no son capaces de degradar el poliestireno.

Introducción Antecedentes La contaminación producida por los polímeros ha crecido de manera exponencial en los últimos años por lo que distintas instituciones han dedicado sus esfuerzos a la investigación en la degradación de los mismos. También se ha buscado diversas soluciones como el uso de plásticos biodegradables, compuestos de almidón o colágeno que permanecen poco tiempo en el ecosistema. No obstante, la desventaja de estos productos es el elevado costo de producción en comparación al costo de los

plásticos tradicionales, razón por la cual, los plásticos tradicionales siguen siendo el principal producto industrial (Zimmer; 2015).

Uno de los polímeros más utilizados a nivel mundial es el poliestireno junto con el polietileno, polipropileno y el PVC con una demanda mundial de aproximadamente 21.6 millones de toneladas al año (Góngora, 2014). Uno de los riesgos medioambientales ocasionados por la producción de espuma de poliestireno es que libera sustancias químicas perjudiciales a la atmósfera e incrementa los gases de efecto invernadero, con lo que aumenta la contaminación de nuestro suministro de aire y de la capa de ozono.

Por lo que en diversas ciudades del mundo se ha prohibido el uso de PS por las repercusiones ambientales y la dificultad para su disposición, reciclado o degradación. Así en Estados Unidos de América ya son más de 70 las ciudades estadounidenses (Washington DC, San Francisco, Minneapolis, Portland y Seattle, entre ellas) que prohíben su uso. En otras latitudes como París o Toronto el tema es objeto de debate (BBC, 2015).

Además, algunas investigaciones indican que el PS causa graves daños en los ecosistemas marinos, el poliestireno presente genera dos clases de problemas para los animales marinos: mecánicos y biológicos. Al causar problemas en las vías respiratorias, además puede absorber contaminantes tóxicos presentes en el ecosistema (BBC, 2015).

Marco Teórico

El estireno es un hidrocarburo de fórmula C8H8 que al ser polimerizado da como

resultado el poliestireno (PS), el cual es un polímero termoplástico [−CH (C6H5) CH2]n

muy frágil a temperatura ambiente, por lo cual se modifica mediante la adición de polibutadieno, para mejorar su resistencia al impacto llamándose así poliestireno de alto impacto (HIPS, por sus siglas en inglés) también conocido como poliestireno de espuma, este polímero posee buena resistencia dimensional, propiedades balanceadas de fuerza y resistencia al calor. Debido a su resistencia al impacto, su

fácil manejo y bajo costo son típicamente utilizados para aplicaciones del hogar, juguetes y componentes eléctricos (Blackwell plastics, 2012).

Como todos los polímeros termoplásticos, tienen cualidades hidrófobas que impide que sean vulnerables a la hidrólisis. Además, el uso de antioxidantes y retardantes de flama durante el proceso de elaboración, incrementan la vida y la calidad del producto, pero también impiden su degradación y oxidación (Ho, Roberts, & Lucas; 2017).

Se sabe que este material representa una problemática ambiental ya que es industrializado en gran cantidad y su reciclaje ha sido deficiente incluso, Kaplan et al., (1979) sostienen que, en un hábitat natural, la degradación de este polímero por medio de microorganismos, hongos e invertebrados es menor al 1%. Sin embargo, Otake et al., (1995) informaron que una lámina de PS dejada por 32 años en un hábitat natural, no tenía signos de haber sido degradado.

María Laura Ortiz Hernández del Centro de Investigación en Biotecnología de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM), indica que una fuerte problemática en México es que no existe la suficiente infraestructura para el reciclaje de los residuos de plástico, por lo que usualmente tienen que enviarlos a países con mayor infraestructura (La jornada, 2013) lo que evita que se realice un tratamiento adecuado de estos residuos en el país.

El uso del poliestireno trae consigo diversos conflictos como lo es el cambio de los ecosistemas debido a su toxicidad, problemáticas de salud, contaminación de cuerpos de agua, entre otros. Ho B., et al., (2018) por lo que se han realizado diversas investigaciones en las cuales se buscan diversas alternativas en las que se pretende alcanzar la degradación de polímeros.

En este sentido, la bacteria Ideonella sakaiensis, encontrada por Yoshida, et al., (2016), es capaz de descomponer el tereftalato de polietileno (PET). Así lo mostraron los resultados de laboratorio, donde se observó la degradación de un rollo de PET en seis semanas a una temperatura de 30º C. También Yang, et al., (2015), investigaron la capacidad de las bacterias Bacillus sp.YP1 y Enterobacter asburiae YT1 para degradar polietileno. El grupo de Khan del World Agroforestry Centre (ICRAF) y del

Instituto Botánico Kunming, en China demostraron que el hongo Aspergillus tubingensis es capaz de degradar el HPDE (polietileno de alta densidad).

No obstante, investigaciones realizadas por Yang, et al., (2015) han mostrado la capacidad para degradar poliestireno por Exiguobacterium sp. strain YT2, encontrada dentro del tubo digestivo de la larva del Tenebrio molitor (Figura 1). A su vez, se han realizado investigaciones donde se ha logrado el aislamiento de Exiguobacterium mexicanum en el cerebro de la Artemia franciscana (Figura 2) (Moraga, Ávila y Vilaxa; 2015). Este pequeño organismo es un crustáceo normalmente utilizado como alimento vivo de peces debido a su alto contenido proteico (Sánchez-Osuna et al.,

2012).

su alto contenido proteico (Sánchez-Osuna et al. , 2012). Figura 1. Larva de Tenebrio molitor Figura

Figura 1. Larva de Tenebrio molitor

et al. , 2012). Figura 1. Larva de Tenebrio molitor Figura 2. Artemia franciscana vista desde

Figura 2. Artemia franciscana vista desde el microscopio estereoscópico.

El género Exiguobacterium, son bacterias descritas como gram positivas, anaerobias, que han logrado ser aisladas en diversos ecosistemas (muchas veces, ecosistemas muy diferentes entre sí) entre una temperatura de 12 a 55 ºC. Este género de bacterias se ha usado para aplicaciones biotecnológicas (Vishnivetskaya, Kathariou & Tiedje; 2009).

Algunas cepas del género Exiguobacterium, además de soportar distintas temperaturas, son halotolerantes, pueden crecer en un amplio rango de pH (5 - 11), toleran la radiación UV y estrés por presencia de metales pesados y no metales como el arsénico (Pandey, Renu & Bhatt; 2016).

Por otra parte, trabajos la revista Environmental Science and Technology, indicó que la bacteria Exiguobacterium sp. strain YT2 tiene la capacidad de degradar el poliestireno.

Objetivos General

Utilizar la microbiota de Tenebrio molitor y Artemia franciscana para degradar espuma de poliestireno bajo condiciones controladas.

Particulares

Extraer y cultivar la microbiota de Tenebrio molitor y Artemia franciscana.

Aislar las bacterias con capacidad de degradar la espuma de poliestireno.

Planteamiento del problema El poliestireno, polietileno, polipropileno y el PVC son los plásticos más consumidos con una demanda mundial de aproximadamente 21.6 millones de toneladas al año (Góngora, 2014). Por lo que en los últimos años se ha buscado la producción de plásticos biodegradables, pero aún se tiene un alto costo de producción.

Debido a que el PS tiene un bajo reciclaje y su degradación en el ambiente puede tardar miles de años es uno de los polímeros que usualmente es desechado al ambiente, tanto en el suelo como en cuerpos de agua. En especial, los sistemas acuáticos son vulnerables a la contaminación por PS, debido a su alta porosidad puede absorber contaminantes que posteriormente pueden llegar a ser liberados en el agua dañando la flora y fauna marina, y en consecuencia también a los seres humanos. Por lo que es importante buscar opciones viables para su degradación, siendo el uso de la microbiota del Tenebrio molitor y la Artemia franciscana una propuesta favorable y sustentable con el ambiente.

Justificación Actualmente, no se puede prescindir del uso de polímeros ya que se encuentran en muchos bienes materiales y de uso cotidiano como bolsas, empaques, telas, entre otros; estos objetos, dejan de ser utilizados en un corto tiempo comparado con su vida útil, hecho que representa un gran problema, pues los polímeros como el poliestireno poseen tiempos de degradación muy altos y permanecen en el ambiente durante miles de años. Por lo que es indispensable el uso de métodos biotecnológicos para la degradación de diversos polímeros, por lo tanto, proponemos investigar si la microbiota del Tenebrio molitor y la Artemia franciscana pueda ser una opción viable para la degradación del PS y de esta forma contrarrestar sus efectos negativos en los ecosistemas.

Hipótesis La microbiota del Tenebrio molitor y de la Artemia franciscana permitirá la degradación de espuma de poliestireno bajo condiciones de laboratorio.

Desarrollo

Tenebrio molitor El diseño experimental constó de tres tratamientos con tres réplicas cada uno (Figura 3); en cada tratamiento se colocaron 15 larvas del Tenebrio molitor. Las larvas del primer tratamiento se alimentaron con 3 g de alimento (15 g alimento de engorda de pollo, 35 gramos de salvado, 25 g de harina de maíz y 25 gramos de avena hojuela), en el segundo se colocaron dos gramos del alimento y un gramo de poliestireno; en el tercer tratamiento fue colocado un gramo de poliestireno. Esta dieta se mantuvo durante una semana, tiempo en el cual se midió cada día la masa de los organismos y del poliestireno.

Posteriormente, las larvas fueron diseccionadas para poder obtener su contenido gástrico, el cual se lavó con solución salina, se homogeneizó con un vortex por 5 minutos y se adicionaron a matraces con 80 mL de disolución libre de carbono adicionada con 1 g de poliestireno previamente sanitizado con etanol 96 % y solución

salina isotónica (SSI) estéril. Los matraces se mantuvieron por 35 días en la estufa de cultivo a 30 ºC (Figura 4).

Figura 3. Tratamientos en los que se les dio una dieta específica a las larvas
Figura 3. Tratamientos en los que se les dio
una dieta específica a las larvas del Tenebrio
molitor
Figura 4. Tratamientos con la microbiota
inoculada en la estufa de cultivo, donde fueron
incubados por cinco semanas.

Tras el tiempo de incubación, las bacterias se pasaron a placas con Luria Bertaini (LB) (Figura 5) adicionando 1 mL y de 0.5 mL del inóculo e incubadas por 48 h a 30 ºC. Después, de las colonias aisladas se pasaron a tubos de ensayo con 7 mL de caldo nutritivo (CN) se dejaron crecer 24 h a 30 ºC. Este cultivo sirvió para inocular matraces con 80 mL de CN y se crecieron 24 h a 30 ºC. Las bacterias se obtuvieron por centrifugación de 3 mL del cultivo de CN a 5000 rpm por 10 minutos, las bacterias se lavaron con SSI estéril. Posteriormente, se resuspendieron en SSI y se llevó a cabo la cuantificación por densidad óptica mediante el método de McFarland. Finalmente, una vez medidas las bacterias se inocularon de nuevo en 80 mL de medio libre de carbono en los cuales se colocaron 0.2 g de poliestireno en cada matraz (Figuras 6 y

7).

Figura 5. Realización del sembrado, teniendo así tres métodos por cada tratamiento: estría radial, extensión

Figura 5. Realización del sembrado, teniendo así

tres métodos por cada tratamiento: estría radial,

extensión de 1 mL y extensión de 0.5 mL.

Figura 6. Preparación de los matraces con poliestireno en medio libre de carbono para la
Figura 6. Preparación de los matraces con
poliestireno en medio libre de carbono para la
etapa final.
Figura 7. Colonias inoculadas en solución libre
de carbono con 0.2 g de poliestireno.

Artemia franciscana

Se tomaron de 20 Artemias franciscanas por triplicado, donde fueron diseccionadas para obtener la microbiota de su cabeza (Figura 8). Las cabezas se colocaron en tubos de ensayo con SSI estéril y se homogeneizaron con ayuda de un vortex por 5 minutos. Con esta solución se inocularon los matraces con 80 mL de SLC adicionada con 1 g de poliestireno. Los matraces se mantuvieron por 35 días en la estufa de cultivo a 30 ºC (Figura 5).

por 35 días en la estufa de cultivo a 30 ºC (Figura 5). Figura 8. Realización

Figura 8. Realización de la disección de la Artemia franciscana con el microscopio estereoscópico en área estéril.

El tratamiento que se siguió es el descrito anteriormente para las larvas de Tenebrio molitor (Figuras 6 y 7).

Resultados

En la Tabla 1, se muestran los cambios en el peso del poliestireno de los tratamientos para las larvas de Tenebrio molitor. Los datos mostrados son el promedio de las tres réplicas y las mediciones se realizaron diariamente.

Tabla 1. Peso promedio en g del poliestireno de cada día por tratamiento.

 

D1

D2

D3

D4

D5

D6

T2

0.0338± 0.0004

0.0339± 0.0003

0.0338± 0.0003

0.0336± 0.0004

0.0343± 0.0017

0.0336± 0.0018

T3

0.0672± 0.0000

0.0669± 0.0000

0.0667± 0.0001

0.0680± 0.0029

0.0718± 0.0098

0.0718± 0.0098

Por su parte, en la Tabla 2, se aprecia el cambio del peso diario de las larvas. Esto con el objetivo de comparar su aumento o disminución de peso en los distintos tratamientos.

Tabla 2. Peso promedio en g de los tenebrios de cada día por tratamiento.

 

D1

D2

D3

D4

D5

D6

T1

0.1135± 0.0133

0.1152± 0.0124

0.1152± 0.0126

0.1150± 0.0116

0.1174± 0.0135

0.1155± 0.0126

T2

0.1119± 0.0068

0.1143± 0.0048

0.1135± 0.0046

0.1150± 0.0038

0.1179± 0.0035

0.1121± 0.0098

T3

0.1176± 0.0081

0.1161± 0.0079

0.1129± 0.0101

0.1096± 0.0095

0.1090± 0.0092

0.1082± 0.0092

En la Tabla 3, se muestran los promedios (tres réplicas) de consumo de poliestireno por cada larva dentro de los tratamientos, esto debido a que los organismos utilizados se transforman en pupas, escarabajos o murieron.

Tabla 3 Diferencias entre los promedios de las larvas y del poliestireno por cada tratamiento entre días.

   

Dia 1-Dia

Dia 2-Dia

Dia 3- Dia

Dia 4-Dia 5

Dia 5- Dia

Cambio

2

3

4

6

total

T1

Larvas

0.0017

0.0000

-0.0001

0.0023

-0.0018

0.0021

T2

Larvas

0.0024

-0.0008

0.0015

0.0028

-0.0057

0.0003

 

Poliestireno

0.0001

-0.0001

-0.0002

0.0007

-0.0007

-0.0002

T3

Larvas

-0.0015

-0.0033

-0.0033

-0.0006

-0.0009

-0.0095

 

Poliestireno

-0.0003

-0.0003

0.0014

0.0038

-0.0001

0.0045

Los resultados de la Tabla 4, soportan el uso de poliestireno como fuente de carbono por la microbiota de las larvas de Tenebrio molitor. Los resultados indican que existió un cambio de masa entre 0.5 y 0.6 g. Sin embargo, en el caso de los tratamientos de Artemia franciscana no se observó un cambio real en la masa de poliestireno. En este punto es necesario aclarar que el valor inicial de la masa de poliestireno fue medido con un instrumento de menor sensibilidad, motivo por el que solo se tiene un decimal.

Tabla 4 Peso del poliestireno antes y después de su incubación por 5 semanas con la microbiota.

 

Peso inicial (g)

Peso final (g)

Tratamiento 1

1.0370± 0.0484

0.4041± 0.0082

Tratamiento 2

1.0418± 0.0263

0.5183± 0.0817

Tratamiento 3

1.0736± 0.0133

0.5805± 0.0668

Tratamiento Artemia

1.0

1.0679± 0.0277

Por otra parte, se construyó la curva de calibración para la escala de McFarland, y se pudo determinar la concentración de bacterias iniciales adicionadas al medio libre de carbono con 0.2 g de poliestireno. En la Gráfica 1, se muestra la ecuación de la recta y el valor de r 2 que se emplearon para estimar las concentraciones de bacterias en UFC mL -1 .

Gráfica 1. Curva de calibración de absorbancia promedio vs. UFC mL -1 .

calibración de absorbancia promedio vs. UFC mL - 1 . En la Tabla 5, se presentan

En la Tabla 5, se presentan las UFC mL -1 que fueron inoculadas inicialmente en solución libre de carbono. No se tienen los datos finales ya que el experimento sigue en proceso (por 6 semanas más).

Tabla 5. Concentración de UFC mL -1 que fueron inoculadas en los matraces con medio libre de carbono siguiendo la escala McFarland.

Tratamientos

UFC / mL

Tratamiento 1

1.52x10 9

Tratamiento 2

1.05x10 9

Tratamiento 3

2.32x10 8

Tratamiento Artemia

1.2x10 9

Análisis de los resultados Se puede observar en la Figura 9 y en las Tablas 1 y 3 los valores del consumo de poliestireno por parte de la larva del Tenebrio molitor. Los valores para las mediciones de los días 3- 4 y 4 - 5 salen de la tendencia que se observa los primeros días y el último día en donde si se observa una baja en la masa del poliestireno como se esperaba. Se podría explicar el incremento en la masa correspondiente a estas dos mediciones como un error en la medición o por no haber limpiado correctamente el poliestireno de los residuos que generan las larvas. También, se observa en los datos de la Tabla 4, que las bacterias en el medio libre de carbono pueden degradar el poliestireno, como lo demostraron (Yang, et al., 2015).

el poliestireno, como lo demostraron (Yang, et al., 2015). Figura 9. Muestra de poliestireno con evidencia

Figura 9. Muestra de poliestireno con evidencia de consumo por la larva

Los datos que se obtuvieron en esta investigación muestran una degradación de 50 - 60% de la masa de poliestireno tras 5 semanas de incubación. En el caso de la Artemia franciscana no se pudo alimentar desde un inicio con espuma de poliestireno por lo que no se puede medir el consumo por el organismo. Sin embargo, los datos del experimento de su microbiota en medio libre de carbono indican que no fueron capaces de degradar el polímero en las 5 semanas de incubación.

Cabe mencionar que de este organismo no se tienen antecedentes, sin embargo, una de las bacterias que se han aislado de la artemia corresponde al género Exiguobacterium sp, motivo por el que se probó su habilidad para usarla en la degradación de poliestireno en ambientes marinos. Durante el tiempo de incubación

se notó un ligero incremento de la turbidez del medio y la generación de burbujas de gas. Estas observaciones sugieren que las bacterias pertenecientes a la microbiota de la Artemia franciscana lograron sobrevivir al periodo de incubación, ya que al sembrarse en el medio Luria Bertani se lograron aislar colonias. Se considera que las bacterias pudieron utilizar en menor medida el poliestireno como fuente de carbono o que pudieron utilizar sus propios metabolitos de desecho o incluso se pudieron alimentar de ellas mismas.

En la figura 10 se tienen las colonias de bacterias en medio Luria Bertaini donde se puede observar un crecimiento bacteriano en los tratamientos del Tenebrio molitor y de la Artemia franciscana. En ellas se logra ver que las colonias son morfológicamente similares, es decir, son planas, lobuladas, genera mucílago y son de color crema y podrían pertenecer a un mismo género.

son de color crema y podrían pertenecer a un mismo género. Figura 10. Cajas de Petri

Figura 10. Cajas de Petri con las bacterias ya inoculadas en medio Luria Bertaini y divididas por tratamientos.

Finalmente, se lograron aislar bacterias de larvas de Tenebrio molitor con capacidad de degradar espuma de poliestireno, en el caso de la Artemia franciscana no se cuenta con datos contundentes que sugieran la posibilidad de utilizar el poliestireno como fuente de carbono aún en menor magnitud, razón por la cual, la investigación sigue en proceso.

Conclusiones

Se puede concluir a través de los resultados, mediciones y observaciones que la

microbiota de la Artemia franciscana no presenta la misma capacidad de degradación

del poliestireno que la microbiota del Tenebrio molitor.

Las bacterias aisladas del Tenebrio molitor si fueron capaces de utilizar el poliestireno

como fuente de carbono bajo condiciones controladas al disminuir la masa del

poliestireno tras 5 semanas de incubación.

Es necesario continuar con la investigación para obtener más datos que puedan

confirmar la capacidad de degradación de las bacterias aisladas de Artemia

franciscana, razón por la cual el experimento sigue en proceso donde el periodo de

incubación será mayor a cinco semanas con el objetivo de obtener datos más

específicos. Además, como parte del experimento, se realizará la identificación

genómica de las bacterias que fueron inoculadas.

Alcances y perspectiva

Para poder comprobar adecuadamente la capacidad de degradación de poliestireno

por bacterias de la Artemia franciscana el experimento se llevará a un periodo más

largo.

Las bacterias aisladas de ambos organismos se caracterizan morfológicamente y

genéticamente con la finalidad de identificar los géneros y especies de estas

bacterias.

Fuentes de consulta

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