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VALIDACIÓN
Es la confirmación mediante el suministro de evidencia
objetiva de que se han cumplido los requisitos para
una utilización o aplicación específica prevista
VERIFICACIÓN
Es la confirmación mediante el aporte de evidencia
objetiva de que se han cumplido los requisitos
especificados
Dra. Nora Angelini
Consultora Internacional de la FAO
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
Experimentos de
pre-validación Método aprobado
incluirlo en el Manual
de Procedimientos
Ajustar Analíticos
parámetros del EJECUCION
método
POE para ejecutar el
método en la rutina
Ajustar criterios
de aceptación
Realizar experimentos de validación
interna en forma completa
CONTENIDO
Objetivo
Alcance
Areas afectadas
Responsabilidades
Relaciones
Desarrollo
Registro y Archivo
Anexos
Histórico
Referencias Dra. Nora Angelini
Consultora Internacional de la FAO
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
VALIDACIÓN DE INSTRUMENTAL
Controles Intralaboratorios
EXACTITUD
Es la cantidad que se refiere a las diferencias entre la
media de una serie de resultados o un resultado individual
y el valor que se acepta como verdadero o valor correcto,
para la cantidad medida
[IUPAC Compendium of Chemical Technology, 1985]]]
VERACIDAD (SESGO)
VALOR
Valor aceptado que sirve como referencia de
comparación previamente acordado y el cual deriva de:
A. Establecido o teórico, basado en principios
científicos
B. Asignado o certificado, basado en el trabajo
experimental de organizaciones nacionales e
internacionales
C. Consensuado o certificado, basado en trabajo
experimental colaborativo
D. Cuando a), b) y c) no es posible, la medición de una
cantidad [ISO 3534-]
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
VALOR VERDADERO
Es el consistente con la definición de una cantidad
particular dada
[VIM 1993]
VALOR VERDADERO CONVENCIONAL
Atribuido a la cantidad particular y aceptada, algunas
veces por convención, que tiene una incertidumbre
adecuada para el propósito dado
[VIM 1993]
PRECISION
Es la proximidad entre
resultados de análisis
independientes obtenidos bajo
condiciones estipuladas
Depende sólo de la distribución
de los errores aleatorios y no
se relaciona con el valor
verdadero o valor especificado.
Se computa como desviación
estándar de los resultados de
los análisis [ISO 3534-1]
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
VALOR VERDADERO
X X X X X X XXXXXX
MAS VERAZ MENOS VERAZ
MENOR SESGO MAYOR SESGO
MENOS PRECISO MAS PRECISO
CONCENTRACION (X)
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
DESVIACION ESTANDAR
LINEALIDAD
RANGO (cont.)
Determinar el intervalo de concentración de analito en el
cual el método es aplicable
Dentro del intervalo de trabajo puede haber un intervalo
en el que la respuesta del sistema de detección es lineal.
Interesa conocerlo para determinar el modo de calibración
Cuando se utiliza algún tipo de instrumentación es útil
considerar la sensibilidad y el umbral de discriminación
INTERVALO DE TRABAJO
Para ello
a) Preparar un blanco y 4 -6
concentraciones diferentes
del analito o 4 -6 muestras
fortificadas c) Repetir los pasos a)
y b) dentro del ámbito
b) Representar la señal lineal y efectuar un
obtenida en función de la estudio estadístico de
concentración y determinar los resultados
el ámbito lineal y los obtenidos
extremos superior e inferior
del intervalo de trabajo
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
COEFICIENTE DE CORRELACIÓN
Es un parámetro cualitativo, adimensional, da una idea primaria
sobre la bondad del modelo lineal
Para tener una idea más confiable se deben realizar análisis
gráficos de residuos
CRITERIOS
Métodos Cuantitativos
Respuesta lineal ≥ 0.99, DS de residuales ≤ 0.1
Respuesta no lineal ≥ 0.98
Métodos Criba o Screening
Respuesta lineal ≥ 0.98, DS de residuales ≤ 0.2
Respuesta no lineal ≥ 0.95 Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
DISCRIMINACION
Es la capacidad de un instrumento de medición
para responder a pequeños cambios en el valor del
estímulo
Puede depender del ruido (interno o externo),
fricción, amortiguamiento , inercia, etc
SENSIBILIDAD
Es el cambio en la respuesta del instrumento de
medición dividido por el cambio correspondiente en el
estímulo
El estímulo puede ser cantidad de analizado presente
También se aplica al método analítico globalmente,
teniendo en cuenta otros factores tales como el efecto
de los pasos de extracción y purificación
[VIM 1984 y IUPAC Orange Boo
AREA = 1899
ng/g
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
BLANCO
El valor obtenido cuando el analito no está presente
en la muestra durante la medición. Si existe una
señal o valor medido para el componente se debe a
factores ajenos y debe ser descontado del valor de
la medición cuando ésta se realiza con el analito
presente
CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD
Establecer que la respuesta del instrumento se atribuya
sólo al analito en estudio y no a la presencia de
interferencias. Usar técnicas distintas
Se aplica al análisis cualitativo y cuantitativo
SELECTIVIDAD
El grado en que otras sustancias interfieren con la
determinación de una sustancia de acuerdo con un
procedimiento dado
[IUPAC Compendium of Chemical] T
Para ello
Analizar blancos de al menos 20 matrices diferentes
LIMITE DE DETECCION
Es el contenido más bajo
que se puede medir con
seguridad estadística
razonable
[AOAC- PVMC]
LD cont.
b) 2,5 a 5 veces la relación señal/ruido del equipo de
medida que utiliza
c) la concentración cL o la cantidad qL, es la medida más
pequeña xL que se puede detectar con seguridad
razonable
xL = x bl + k S bl
x bl media de las medidas de las muestras blanco (MB)
S bl desviación estándar de las medidas de la MB
k factor numérico de acuerdo al nivel de confianza de
trabajo
[IUPAC, 1985] Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
FALSO POSITIVO
Probabilidad que la concentración real de una sustancia en la
muestra de laboratorio sea menor que el valor límite
aceptado, mientras que las medidas realizadas en una (1) o
más porciones de muestra, indican que la concentración
excede ese valor. Valores aceptados para esta probabilidad
están entre uno (1) a cinco (5) por ciento (%)
[Codex Alimentarius, ALINORM 01/24A] Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
FALSO NEGATIVO
Probabilidad que la concentración real de una sustancia en
la muestra de laboratorio sea mayor que el valor límite
aceptado mientras que las medidas realizadas en UNA (1)
o más porciones de muestra, indican que la concentración
no excede ese valor. Los valores aceptados para esta
probabilidad están en el rango de uno (1) a cinco (5) por
ciento (%)
[Codex Alimentarius, ALINORM]
LIMITE DE CUANTIFICACION
Los límites de cuantificación son
las características de realización
que marcan la capacidad de un
proceso de medidas químico para
cuantificar la sustancia en forma
adecuada
[IUPAC Orange book]
LC (cont.)
LQ = k Q x Q, donde
LQ es el límite de cuantificación
Q es la desviación estándar en ese punto
k Q es el factor cuya inversa multiplicada por el RSD iguala
al cuantificando seleccionado
El valor por defecto que expresa para k Q es 10
[IUPAC Orange book]
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
MATERIAL DE REFERENCIA
(MR)
MR CERTIFICADO (MRC)
Es el material o sustancia
en el cual Uno(1) o más Es el MR cuyas propiedades
valores de sus propiedades están certificadas con
son homogéneos y están rasteabilidad a la unidad en la
bien definidos para permitir que se expresan y se
utilizarlos para la calibración acompaña de la incertidumbre,
de un instrumento, la con la indicación de un nivel de
evaluación de un método de confianza
medición o la asignación de
valores
[ISO/IEC Guide 30-1992, 2.1]
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
RECUPERACION
Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra
(muestra fortificada) antes del análisis, al ser analizadas
muestras fortificadas y sin fortificar, el porcentaje de
recuperación (%R) se calcula
%R = [(CF-CU)/CA] x 100
CF concentración de la sustancia medida en la muestra
fortificada
CU concentración de la sustancia medida en la muestra sin
fortificar
CA es la concentración de la sustancia agregada (valor
teórico) en la muestra fortificada
[AOAC-PVMC]] Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
RECUPERACION (cont.)
REPETIBILIDAD
[ISO 3534-1]
REPRODUCIBILIDAD
Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad,
es decir, los resultados de análisis independientes se
obtienen con el mismo método en muestras idénticas en
distintos laboratorios con diferentes operadores, usando
distintos equipos
Se requiere la especificación de las condiciones
cambiadas, se puede expresar en forma cuantitativa en
términos de dispersión de los resultados
[ISO 3534-1]
RASTREABILIDAD
Es la propiedad de un resultado de una medida o valor de
un estándar por el cual se puede relacionar, con la
incertidumbre establecida, a referencias establecidas,
normas nacionales e internacionales (una cadena
ininterrumpida de comparaciones)
Pruebas de significación para el aseguramiento
Test de t (distribución de la t de Student)
Depende de los grados de libertad (relacionados con n) y
P (nivel de confianza)
µ = X ± t DS/ (n)1/2
Fexp = DS1 2
DS2 2
Test de t
texp = X -x
DS/ (n)1/2 Grados de libertad: n1+ n2 - 2
CARTA DE CONTROL
Método de elección para el control interno de rutina de
métodos. No se aplica en métodos que se utilicen
menos de 3 veces/mes
Analizar muestra control (M incurrida o MR certificado
o no) con las muestras, el resultado se registra en la
carta de control
Las variantes más importantes son:
Carta de control de un sólo valor
Carta de control del blanco
Carta de control para recuperación
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
INCERTIDUMBRE
INCERTIDUMBRE (cont.)
Fuentes de incertidumbre
Fuentes de incertidumbre
(cont.)
i) Condiciones de almacenamiento
j) Efectos atribuibles a los instrumentos de medición,
incluyendo función de calibrado, número de cifras
significativas, redondeo de cifras relevantes
k) Pureza de los reactivos
l) Condiciones de medición
ll) Efectos de la muestra (matriz)
m) Corrección por blanco
n) Efectos atribuibles al operador
o) Efectos aleatorios
Dra. Nora Angelini
p) software
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS
QUÍMICOS
Fuentes de incertidumbre
(cont.)
p) Mediciones térmicas q) Pesadas y calibración de
Termómetros de balanzas
referencia Calibración y estabilidad de
Instrumentos eléctricos pesas de referencia
Resolución Incertidumbre de la
Inestabilidad, gradientes pesada: repetibilidad,
térmicos linealidad, excentricidad
Corrección de una escala Empuje del aire
o tabla de referencia Condiciones ambientales
Contribuciones del
Dra. Nora Angelini
termómetro a calibrar
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
Distribuciones de Probabilidad de
los componentes de Incertidumbre
EJEMPLO INCERTIDUMBRE
Determinación de Cadmio en Alimento
Alcance: se determina Cadmio en alimento en el rango de
0.5- 5 mg /kg
Descripción
Resumen: Se toma 0.5 g ± 0.1 mg de alimento, se adiciona
2.5 ml de ácido nítrico, después de la mineralización la
solución se transfiere cuantitativamente a un frasco o
redoma de 100 ml y se analiza por Absorción Atómica
usando horno de grafito. La curva de calibración se realiza
con patrones comerciales disponibles Dra. Nora Angelini
Consultora Internacional de la FAO
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
EJEMPLO
Preparación de la muestra INCERTIDUMBRE (cont.)
Pesada Preparación de la
Curva de calibración
con patrones
Mineralización
AA Calibración del AA
Resultados
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
c 0 VS
m Cd
m
c0 = cantidad de Cadmio en µg/l análisis por AA
VS = volumen de muestra en litro
m = cantidad de muestra
U (V)
0.1 ml
3
U (V) 0.06 ml
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
Efecto de Temperatura:
Temperatura ambiente 20 °C ± 3 °C
Coeficiente de expansión del volumen para el agua
2.1 x 10-4 / °C
4
100 ml 2.110 3 C
u (T)
3C
u (T) 0.035 ml
Dra. Nora Angelini
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DS(V100ml) 0.07 ml
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
5 mg
u (Cstock )
3 l
u (Cstock ) 2.89 mg/l
Dra. Nora Angelini
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n
Sxx (ci c) 25.22
2
i 1
c0 V 0.6 0.1
m m 0.12 mg/kg
P 0.5
U c (Cd) 0.06 0.12 0.007 0.01
Cd 0.12 0.01 mg/kg
Incertidumbre expandida: Informe de resultados
k = factor de cobertura Cd = 0.12 ± 0.02 mg/kg
k = 2 (95 % intervalo de confianza) Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
ROBUSTEZ
La robustez de un procedimiento analítico es una medida
de su capacidad para permanecer inalterado por
variaciones pequeñas pero deliberadas en parámetros del
método y brinda una indicación de su confiabilidad
[ICH Q2A, CPMP/ICH/ 381/95]
El objetivo es optimizar el método y las
condiciones para obtener resultados exactos con alta
seguridad, que funcione después de intervalos largos de
tiempo y en otros laboratorios
Un método es más robusto cuanto menos dependan los
resultados de una modificación en sus condiciones
Dra. Nora Angelini
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
ROBUSTEZ (cont.)
ROBUSTEZ (cont.)
Estabilidad de muestras, patrones y reactivos
(condiciones de almacenamiento y ensayo) Parámetros:
·Sensibilidad a la temperatura
·Sensibilidad a la luz
·Hidrólisis (por la humedad del aire)
·Facilidad de oxidación
Descomposición química
·Efectos catalíticos (por las paredes del contenedor)
·Adsorción (durante la filtración de soluciones con residuos)
· Precipitación (al dejar mucho tiempo una solución)
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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
Realizar variaciones
Identificar las variables sistemáticas en los
que afectan el método factores “sospechosos”
observar variación del
resultado
Analizar MR o
Diseñar experimentos
para monitorear el muestras de
efecto de cambios composición Diseño factorial
sistemáticos en las conocida de experimentos
variables
INTERCOMPARACIONES
INTERCOMPARACIONES (cont.)
Inmunoanálisis 6 niveles +
RANGO blanco reactivos ≥ 2
EXACTITUDSESGO replicados
(desviación o error Materiales de
sistemático) referencia o 5 niveles + blanco reactivos +
SELECTIVIDAD (interferencias) muestras blanco muestras 6 replicados
EFECTO MATRIZ fortificadas
LD/ LC Inmunoanálisis 5 niveles +
RECUPERACIONES blanco reactivos 6 replicados
INCERTIDUMBRE + 20 blancos de matriz
HOMOGENEIDAD AL NA O ≥5 REPLICADOS DE CV %≤ 10 CV %≤ 15
DE LA MUESTRA LC MUESTRAS
REPRESENTATIVAS,
HALLAR EL CV%
OTROS CRITERIOS
1 μg/kg ± 30% ± 35 %
GC-MS, HPLC-MS
Cuatro (4) iones para sustancias prohibidas
Tres (3) iones para sustancias con LMR
R > 50 % ± 10 % ± 20 %
20 % < R < 50 % ± 15 % ± 25 %
10 % < R < 20 % ± 20 % ± 30 %
R < 10 % ± 50 % ± 50 %
Dra. Nora Angelini
Consultora Internacional de la FAO
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
OTROS PARAMETROS
OTROS PARAMETROS
Alimentos representativos
– Muestras para validación
residuos de pesticidas
Dra. Nora Angelini
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Dra. Nora Angelini
Consultora Internacional de la FAO