Uso de técnicas cromatográficas en el análisis de biomoléculas

Hernández Melany, Pila Grace, Segarra Danny, Taipe Cristina

1 INTRODUCCIÓN

La cromatografía es una técnica biofísica importante que permite la separación,

identificación y purificación de los componentes de una mezcla para el análisis
cualitativo y cuantitativo. La cromatografía se basa en el principio de que las
moléculas en mezcla se aplican sobre la superficie o el sólido, y la fase estacionaria
del fluido (fase estable) se separa entre sí mientras se mueve con la ayuda de una fase
móvil. Los factores efectivos en este proceso de separación incluyen características
moleculares relacionadas con la adsorción (líquido-sólido), la partición (líquido-
sólido) y la afinidad o diferencias entre sus pesos moleculares (Coskun, 2016).

2 REVISIÓN DE LA LITERATURA

2.1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Usando esta técnica de cromatografía es posible realizar análisis estructurales y

funcionales, y purificación de muchas moléculas en poco tiempo. Esta técnica produce
resultados perfectos en la separación e identificación de aminoácidos, carbohidratos,
lípidos, ácidos nucleicos, proteínas, esteroides. y otras moléculas biológicamente activas,
en HPLC, la fase móvil pasa a través de columnas a una presión atmosférica de 10 a 400,
y con un caudal alto (0.1–5 cm // seg). En esta técnica, el uso de partículas pequeñas y la
aplicación de alta presión sobre la velocidad del flujo de disolvente aumentan el poder de
separación de HPLC y el análisis se completa en poco tiempo. Los componentes
esenciales de un dispositivo de HPLC son depósito de solvente, bomba de alta presión,
columna preparada comercialmente, detector y registrador. La duración de la separación
se controla con la ayuda de un sistema computarizado, y el material se acumula (Harris,
2007).
2.2 USO DE HPLC EN EL ANÁLISIS DE BIOMOLÉCULAS

Ejemplo 1: Determinación en HPCL de mioglobina como indicador

temprano de infarto agudo de miocardio.
La mioglobina, una proteína transportadora de oxígeno que se encuentra en el músculo
cardíaco y en el músculo esquelético estriado, presenta una alternativa atractiva a la CPK
y la LDH en el servicio de urgencias para la identificación del infarto agudo de
miocardio. Los niveles de mioglobina pueden elevarse en el suero dentro de una hora
después de la muerte celular del miocardio, con niveles máximos alcanzados dentro de
cuatro a seis horas. Presentamos un estudio de 59 pacientes que acudieron a un hospital
comunitario con dolor torácico y hospitalización posterior. Veintiuno tuvieron un infarto
agudo de miocardio (Gibler & Kereiakes, 2014).

Determinación de miofblonina (0 horas) fue positiva en 13 de 21 pacientes.

Ejemplo 2: La cromatografía líquida de alta eficacia en la separación de

triglicéridos de grasas animales complejas

Los triglicéridos son una de las fracciones lipídicas más abundante y complejas de la
naturaleza. Es por ello que, la determinación de sus especies moleculares es esencial para
el estudio de la biomolécula, a su vez también es necesario conocer la posición
estereoespecífica en que se sitúan los ácidos grasos que los componen, para caracterizar
las grasas animales y los aceites vegetales.
En el trabajo analizado se discuten las condiciones cromatográficas que se han propuesto
para el análisis de mezclas complejas de triglicéridos (TGs) por HPLC. Además, se da a
conocer el estado actual de conocimientos en el campo de la separación de TGs de algunas
de las grasas animales más complejas y de importancia para el sector industrial y la
nutrición humana, como la grasa láctea, el aceite de pescado y la grasa de hígado. (Peroné,
Ruiz-Gutiérrez, & Barrón, 2007)

Para el análisis de la composición trigliceridica de la grasa hepática, se menciona que el

principal componente de las grasa hepática es el fosfolípidos, el cual dificulta la
determinación de los TGs presentes en la muestra.

2.3 CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

En este método, la fase estacionaria es una columna que se coloca en el dispositivo y
contiene una fase estacionaria líquida que se adsorbe sobre la superficie de un sólido
inerte. La cromatografía de gases es una cromatografía de "gas-líquido". Su fase
portadora consiste en gases como He o N 2 . La fase móvil, que es un gas inerte, se pasa
a través de una columna a alta presión. La muestra a analizar se vaporiza y entra en una
fase gaseosa móvil. Los componentes contenidos en la muestra se dispersan entre la fase
móvil y la fase estacionaria en el soporte sólido. La cromatografía de gases es una técnica
simple, multifacética, altamente sensible y de aplicación rápida para la separación
extremadamente excelente de moléculas muy diminutas. Se utiliza en la separación de
cantidades muy pequeñas de los analitos (Harris, 2007).

2.4 USO DE GC EN EL ANÁLISIS DE BIOMOLÉCULAS

Ejemplo 1: Método cromatográfico de gases mejorado para la determinación

de nicotina y cotinina en fluidos biológicos

Se han desarrollado métodos mejorados para la determinación de la nicotina y su

metabolito principal, cotinina, en muestras de sangre, plasma y orina. Estos métodos
utilizan la cromatografía de gases con detección de ionización de llama alcalina
(nitrógeno-fósforo) y análogos estructurales de la nicotina y la cotinina como estándares
internos. Usando un volumen de muestra de 100 μL, el límite inferior de detección tanto
para la nicotina como para la cotinina fue de 100 pg mL- 1 , lo que permite utilizar el
método para la medición de estos compuestos en fumadores y no fumadores ( Trehy,
Jacob, Wilson, 2009).

Cromatograma de nicotina e impurezas relacionadas con la nicotina. Tiempos de

retención: Cotinina (5,94 min), Anabasina (9,51 min), Anatabina (10,15 min), Miosina
(11,30 min), Nicotina (13,55 min) y B- Nicotyrina (17,71 min)
Conclusiones
------

3 REFERENCIAS

Coskun, O. (2016). Separation techniques: Chromatography. Nostherm Clinics of

Istanbul. Doi: 10.14744/nci.2016.32757

Gibler, M, Kereiakes, D. (2014). - Identification of myoglobin in HPLC as an indicator

in the emergency department for the prevention of acute myocardial infarction. Annals of
Emergency Medicine

Harris, C. (2007). Chromatohgraphy: Principles and methods, Amercham

Pharmacia. Biotech SE.

Trehy, H, Jacob, P, Wilson, B. (2009). Improved gas chromatographic method for the
determination of nicotine and cotinine in biologic fluids. Journal of chromatography:
Biomedical Sciences and applications