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Alumnos:
Karina Madalice Prado Gallardo.
Gisella Araceli Rojas Cortes.
Profesor Guía
Dr. Bernardo Prado Alderete
2019
AGRADECIMIENTOS
Agradecer a todas las personas que hicieron posible esta investigación, a todos los
profesores, por la orientación y conocimientos aportados a lo largo de mi carrera universitaria,
que fue sin duda una de las etapas de mayor aprendizaje y crecimiento. A mi compañera de
tesis Gisella Rojas por su apoyo durante estos años de estudio y por su confianza y dedicación
para poder cumplir con los objetivos propuestos.
Finalmente, a mi hermana y a mis padres, mi mayor inspiración, gracias por todo el
amor, comprensión y apoyo incondicional, esto es por y para ustedes.
RESULTADOS Y RECOMENDACIONES 71
DISCUSIÓN 83
CONCLUSIÓN 87
BIBLIOGRAFÍA 88
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
SIMBOLOGÍA
- g: Gramo
- cm : centímetro
- ml : Mililitro
- g/l : gramos por litro
- µ/ml : Microgramo por mililitro
- L : Litro
- ng : Nanogramo
- N : Normalidad
- h : Hora
- s : Segundos
- %p/v : porcentaje peso/volumen
- %p/p : porcentaje peso/peso
- mm : milímetro
- CO2 : Dióxido de carbono
- N2 : Dinitrógeno
- H2O2 : Peróxido de hidrogeno
- NO2 : Dióxido de nitrógeno
- C : Carbono
- kDA : kiloDalton
- BP : Baird Parker
- M : Manitol
SIGLAS
- Atm : Atmósfera
- UTFSM : Universidad Técnica Federico Santa María
- JMC : José Miguel Carrera
- FAO : Food and Agriculture Organization.
- Aw : Actividad de agua.
- OMS : Organización Mundial de la Salud
- ETA : Enfermedades Transmitidas por Alimentos
- KOH : Hidróxido de potasio
- VP : Voges- Proskauer
- EY : Emulsión preparada de yema de huevo con telurito
- MIO : Medio Movilidad, Indol y Ornitina
- RM : Rojo Metilo
- TSI : Agar tres azúcares hierro
- LIA : Agar Hierro Lisina
- BHI : Caldo extracto cerebro- corazón
- HCl : Ácido clorhídrico
- NaCl : Cloruro de sodio
- UFC : Unidad formadora de colonias
1
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Entre los años 2005 y 2010 se notificaron en el sistema de vigilancia en Chile 5.689
brotes de ETA. El análisis en base a grupos de edad reportó que, en el período analizado, la
incidencia acumulada del grupo de edad más afectado correspondió al segmento de 15 a 44
años. La distribución por sexo fue similar en todo el período (49,7% mujeres y 50,3% hombres)
y a través de los años.
La sintomatología más frecuentemente reportada correspondió a diarrea y dolor
abdominal, seguido por náuseas o vómitos y fiebre.
Al analizar la ocurrencia de brotes por región durante el período 2005-2010, la Región
Metropolitana registró el mayor número de brotes de ETA (3.066 brotes) seguido por la Región
de Valparaíso (1.220 brotes), lo que representó 54 y 21% del total de brotes notificados en el
país para dicho período, respectivamente.
De los brotes con información alimentaria, el 21% registró consumo de comidas y
platos preparados, los ocasionados por consumo de carnes o productos cárnicos alcanzaron el
11%, y de estos últimos, las carnes de aves fueron las causantes de 36% de los brotes. Olea,
Díaz, Fuentes, Vaquero y García (2012)
(Olea, A., Díaz, J., Fuentes, R., Vaquero, A. y García, M., 2012) mencionan en su
artículo de investigación lo siguiente:
Los brotes estudiados reflejaron que el mayor porcentaje se asoció a la inadecuada
manipulación de alimentos durante su comercialización o preparación doméstica, lo cual está
relacionado a la deficiente conservación de los alimentos y hábitos de consumo. Se considera
que en la población chilena existe una baja cultura sanitaria en los manipuladores de alimentos,
incluyendo tanto el nivel comercial como domiciliario. (p. 508)
24 horas noticias, (2 de abril de 2013) afirman:
En el caso del sushi, hasta el año 2013 las intoxicaciones aumentaron en un 100%. De
un total de 400 fiscalizaciones, 12% de los locales han sido sumariados.
La Seremi de Salud ha detectado más de 10 brotes distintos, los síntomas de la intoxicación,
según la autoridad, son diarrea, vómitos, malestar general y decaimiento.
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La alteración de los alimentos supone todo cambio que los convierte en inadecuados
para el consumo. Un alimento se considera descompuesto cuando es considerado por los
consumidores como inaceptable, debido a sus características sensoriales. Estas generalmente
incluyen la apariencia, el sabor, el olor y la textura del alimento; son subjetivas y dependen de
7
- Ataque de insectos.
- Lesiones físicas por golpes, presiones, heladas, deshidratación y radiación.
- Actividad de enzimas tisulares autóctonas, tanto vegetales como animales.
- Cambios químicos no producidos por microorganismos ni por enzimas autóctonas. En
estos cambios está implicado generalmente el oxígeno, y aparte del deterioro por
microorganismos, constituye una de las principales formas de deterioro alimenticio.
- Actividad de los microorganismos, sobre todo bacterias, levaduras y mohos. (Herrera,
1997, p.3)
Según la facilidad con que se alteran los alimentos, se pueden clasificar en tres grupos:
La mayoría de los alimentos se pueden encuadrar en uno de los citados grupos, existen
algunos que se encuentran tan próximos al límite que separa unos de otros, que resulta difícil
clasificarlos.
Casi todos los alimentos frescos contienen una serie de bacterias, levaduras y mohos
y, según su procedencia, pueden contener enzimas animales o enzimas vegetales. Debido a las
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condiciones especiales de cada medio, solamente una insignificante cantidad de los distintos
tipos de microorganismos existentes será capaz de multiplicarse rápidamente y producir
alteraciones en el alimento e incluso es posible que estos microorganismos no existieran en
abundancia en el alimento original.
El tipo y número de microorganismos que existirán tanto en la superficie como en el
interior del alimento, dependerán del tipo y grado de su contaminación, de las oportunidades
anteriores que hayan tenido los microorganismos para multiplicarse, y de los tratamientos
previos a los que se haya sometido el alimento.
La contaminación puede aumentar el número de microorganismos del alimento e
incluso puede incorporar al mismo nuevas especies. Por ejemplo, el agua con que se lava la
mantequilla puede incorporar a la misma bacteria que producen manchas en su superficie; el
equipo de la planta industrial puede incorporar a los alimentos microorganismos que producen
alteraciones en los mismos durante las distintas operaciones de su tratamiento; las máquinas
lavadoras pueden incorporar microorganismos a los huevos; y los barcos sucios pueden
incorporarlos al pescado.
Frazier y Westhoff (1993) afirman:
Los tratamientos previos a los cuales se someten los alimentos pueden eliminar o
destruir determinados tipos de microorganismos, añadir microorganismos, modificar la
proporción de los existentes o inactivar parte o la totalidad de los enzima, reduciendo por tanto
el número de agentes productores de alteraciones y, por consiguiente, el número de los tipos de
alteración posibles. El lavado de los alimentos, por ejemplo, puede eliminar microorganismos
de su superficie o puede añadir algunos existentes en el agua que se utiliza para lavarlos. Si se
realiza el lavado con una solución antiséptica o germicida, el número de microorganismos se
puede reducir de forma importante y se pueden eliminar algunos tipos de los mismos. Los
tratamientos con radiaciones, con ozono, con dióxido de azufre, o con vapores germicidas,
reducirán su número y actuarán como selectivos al eliminar de los alimentos determinados
tipos. Por lo que se refiere a las temperaturas elevadas, conforme aumente la intensidad del
tratamiento térmico, cada vez destruirán mayor cantidad de microorganismos y cada vez
dejarán menor número de tipos de los mismos. La conservación de los alimentos bajo
condiciones no constantes, tanto puede aumentar como reducir la cantidad de microorganismos
y el número de sus tipos. (p.93)
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El sushi es un plato de origen japonés a base de arroz cocido adobado con vinagre de
arroz, azúcar, sal y otros ingredientes, incluyendo pescados o mariscos. Este plato es uno de los
más reconocidos de la gastronomía japonesa y uno de los más populares internacionalmente.
Normalmente, este plato se asocia el sushi con el pescado y el marisco, también puede
llevar verduras, quesos, carnes blancas o cualquier otro acompañante. Además, los productos
frescos tradicionales que acompañan al arroz no tienen que ir siempre crudos. Se incluyen
también preparaciones hervidas, fritas o marinadas. Es decir que el nombre "sushi" refiere a la
preparación del arroz y que el acompañamiento, si bien es relevante en el sabor, no hace al plato
en sí. Si bien existe una variedad de acompañamientos de sushi internacionalmente reconocidos
y acostumbrados, lo ideal es que cada región adopte acompañamientos típicos del lugar con
pescados o frutos de la región que estén identificados con el gusto y la gastronomía local. Sin
embargo, debe abstenerse el uso de pescado de agua dulce crudo dado que, a diferencia del
pescado de mar, puede contener salmonella. (Castro, N.,Corrales ,N., 2010)
1.3.2. Ingredientes
En su mayoría los alimentos listos para consumir como el sushi están más expuestos a
la contaminación porque sus insumos pollo, pescados (salmón), vegetales (palta), queso crema
y otros requieren mayor manipulación en la preparación. A lo anterior se suma la naturaleza.
1.3.2.1. Arroz
Fuente: Jumbo
Las consideradas carnes blancas son el pollo, el pavo y el conejo, se destacan por su
contenido en hierro, proteínas, vitamina B12 y aminoácidos esenciales. La característica
nutritiva esencial es su bajo aporte en grasa, contiene menos del 10% de grasa por cada 100
gramos de carne. (Fernández, 2018)
Después del sacrificio y curtir la piel, los cadáveres de aves contienen muchos tipos
de microorganismos, sobre todo bacterias provenientes de la piel, las plumas y el tracto
gastrointestinal, entre otros; del ambiente en que se les alimentó y de la pastura (alimento, agua,
suelo y estiércol); y del ambiente en los mataderos (equipo, aire, agua y el hombre). Por lo
general los cadáveres contienen un promedio de 101−3 celulas bacterianas / pulgada (2.54 cm)
cuadrada. Suelen estar presentes, pero en un nivel bajo, diferentes patógenos entéricos, tales
como Salmonella, Yersinia enterolitica, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Clostridium
perfringens y Staphylococcus aureus, tanto de aves, animales o seres humanos, (…). Parte del
equipo usado puede ser fuente importante de microorganismos, como cintas transportadoras,
trituradoras, rebanadoras y tipos similares del equipo que son difíciles de limpiar. La carne
refrigerada tiene mesófilos, como Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus,
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Fuente: Ingredienta.com
temperaturas de refrigeración. Los patógenos pueden permanecer viables por un largo tiempo
durante el almacenamiento. Las cargas microbianas se reducen en gran medida durante el
procesamiento por calor para producir diferentes productos. (Ray y Bhunia, 2011, p.26)
Alga nori o Porphyra umbilicales L, se encuentra en forma natural en las orillas del
mar, también crece en superficies duras y se puede unir a otras algas.
El alga nori se encuentra en el grupo de las algas pardas, las cuales se caracterizan por
tener pigmentos fotosintéticos de color marrón-amarillento (xantofilas). (propiedades del alga
nori, s.f)
"Una vez recogida fresca, se seca al sol o en hornos extendida en pequeñas cantidades
sobre esteras de bambú. Por eso tiene un lado liso y otro rugoso, apariencia característica y un
color que cambia dependiendo de su estado: por ejemplo, cuando es cocida su apariencia es
verde, mientras que cuando se seca su color se torna negro." (alga nori: propiedades, beneficios
y cómo usarla, s.f). Se utiliza generalmente en la cocina japonesa, está disponible en láminas
delgadas que se cortan o rompen en pedazos más pequeños para envolver el rollo de sushi. El
nori se cultiva, procesa y es empaquetado industrialmente. El producto tiene forma laminar de
tamaño estándar de 18 x 21 cm. Destaca por su alto contenido en proteínas, vitamina C y
minerales y fibra dietética.
Las algas marinas son colonizadas por bacterias del entorno acuático. En un trabajo de
la Universidad Nacional de La Patagonia San Juan Bosco (Argentina), se estudió la población
microbiana asociada a Porphyra umbilicales L, entre las cepas que se lograron identificar por
sus características morfológicas y pruebas metabólicas como miembros del género
Pseudomonas (35%), Vibrios (25%),otras cepas fueron comparables con los géneros
Flexibacter (8%), Moraxella (6%), Aeromonas (4%), Alteromonas (4%), Flavobacterium (4%),
Acinetobacter (2%), Agrobacterium (2%), Cytophaga (2%). Los cocos Gram positivos aislados
fueron identificados como pertenecientes a los géneros Staphylococcus (6%) y Streptococcus
(2%). Los géneros predominantes fueron; Pseudomonas y Vibrios.
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Fuente: gastronosfera.com
Según la norma del Codex para el queso crema, realizado por FAO (2018):
El queso crema (queso de nata) es un queso blando, untable, no madurado y sin corteza
(…) el queso presenta una coloración que va de casi blanco a amarillo claro. Su textura es suave
o ligeramente escamosa y sin agujeros y el queso se puede untar y mezclar fácilmente con otros
alimentos. (p. 1)
Rodríguez (2012) indica que el queso fresco, se caracteriza por:
ser un producto poco fermentado, ligeramente ácido (pH en torno a 5,3), muy líquido
(actividad del agua de 0,9), con un bajo porcentaje de sal (menor al 3%) (…) estas condiciones
permiten el desarrollo de muchos microorganismos propios de la leche y de contaminación
ambiental. Por este motivo, es esencial que en este producto se realice siempre una
pasteurización previa de la leche. (párr. 3)
16
Fuente: Líder
más la suma de sal y azúcar que le dan el toque característico de este. Al ser condimento del
sushi, “un medio acido que inhibe el crecimiento de la bacteria Bacillus cereus. Por ese motivo,
conviene aliñar el arroz recién cocinado con vinagre para evitar intoxicaciones” (ABC color,
2013, párr. 6).
"La adición de vinagre al arroz produce una acidificación que dificulta el crecimiento
de gérmenes y la formación de toxinas. En un medio ácido, con un pH inferior a 4,6 no hay
crecimiento de microorganismos, a excepción de algunas especies como salmonella o
Escherichia Coli enteropatógena." (Microservices,2015, p.4).
Fuente: Jumbo
Las verduras proceden de diversas partes de las plantas, es importante indicar las
diferentes verduras según a la parte a la que pertenecen.
La palta es un fruto que proviene de un árbol (Persea americana) de la familia de las
lauráceas, por otro lado, el pimentón es un fruto pertenece a la familia de las Solanáceas,
proviene de una planta del mismo nombre.
En general, los vegetales son relativamente altos en carbohidratos, con valores de pH
de 5.0 a 7.0. Por lo tanto, pueden crecer diferentes tipos de bacterias, levaduras y mohos si las
condiciones son favorables (Ray y Bhunia, 2011, p.27)
18
Fuente: nutricionesencial.es
incluyen Lis. Monocytogenes. Salmonella, Shigella, Escherichia coli patogénica (Esc. Coli
O157:H7), Campylobacter, Clo. Botulinum y Clo. Perfringers. También puede tener
protozoarios y parásitos patogénicos (Cyclospora, ISospora, Giardia). Si los vegetales están
dañados, entonces también pueden predominar los patógenos vegetales (p. ej., Erwinia).
Muchos de los microorganismos causan diferentes tipos de descomposición (de putrefacción)
de los productos crudos. Pueden crecer patógenos en los productos vegetales y provocar
enfermedades originadas en el alimento (p. ej., col fermentada). Diferentes métodos usados para
procesar los vegetales y los productos vegetales reducen en gran medida la población
microbiana. (Ray y Bhunia, 2011, p.27)
Fuente: Sodimac
1.6.1. Microorganismos
1.6.2. Crecimiento
Los microorganismos no se
Dulces, el chocolate, la miel, los fideos, las multiplican por debajo de una Aw
inferior
galletas, las papas fritas, las verduras secas, de 0,60 pero pueden permanecer
a 0,60
huevos y leche en polvo. vivos durante largos períodos de
tiempo.
Fuente:
1.6.3. Hábitat
o al principio de la fase estacionaria logrando acumular hasta 350 µ/ml, dependiendo de la cepa
reproductora.
Inducen vomito en 1 a 6
horas
2. PARTE EXPERIMENTAL
Cada proceso consta con su propia metodología para realizarse, las cuales serán
descritos a continuación:
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metálico con entrada para el flujo de gas, el cual se regula a través de una llave sobre la mesa
de trabajo.
Asa loop o asa en argolla es un instrumento de laboratorio que consiste en una base
que puede estar hecha de acero, platino y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o
platino que termina o en una argolla o en punta.
Se utiliza para transportar, arrastrar, transferir inóculos desde la solución de trabajo,
también llamada “solución madre” al medio de cultivo o para resiembras. Además, sirve para
la realización del frotis.
2.2.1.4. Autoclave
Equipo que tiene por función realizar un proceso físico que utiliza resinas de
intercambio iónico en el que se sustituyen las sales y minerales en el agua, H + iones OH. En
el agua los elementos más pequeños son las sales, por lo que requiere un tratamiento poco
convencional, la desionización produce un agua de alta pureza que es generalmente similar a la
del agua destilada.
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2.2.1.6. Micropipetas
Fuente: Biodiagnostica
Fuente Arquimed
Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos
celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado
óptimo, tales como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su atmósfera
interior.
- Autoclave
- Incubadora de CO2
- Mechero bunsen
- Cámara refrigerada
- Balanza analítica
- Pipetas
- Cuchillo estéril
- Espátula estéril
- Bolsas de polietileno (16 x 25). Estériles
- Placas Petri
- Asa loop
- Agua destilada
2.3.4. Procedimiento
Triptona 17g
Digestivo pancreático de caseína, Soytona 3g
Digestivo papaico de judía de soja, Manitol 2,5g
Cloruro sódico 100g
Fosfato dipotásico 2,5g
Rojo fenol 0,025g
pH final 7,3 ± 0,2 a 25°C
Método de preparación:
Almacenamiento:
+ = positivo, amarillo
− = negativo, sin cambios, rojo
Según Difco & BBL Manual. (s.f) el agar manitol se caracteriza por:
Uso: Es un medio selectivo usado para el aislamiento de estafilococos patógenos.
Introducción/ Principios:
Se prepara de acuerdo con la fórmula sugerida por Chapman. El crecimiento de la
mayoría de las bacterias diferentes a estafilococos queda inhibido por la alta concentración de
sal.
Koch, informó que sobre medios sólidos los estafilococos no eran inhibidos por una
concentración de cloruro de sodio 7,5%. Chapman confirmó esta observación y notó que la
adición de un 7,5% de cloruro sódico a agar con manitol y rojo fenol proporcionaba un medio
40
sobre el cual los estafilococos que coagulaban el plasma de conejo crecían de forma exuberante,
produciendo colonias con zonas amarillas. Los estafilococos no patógenos producían colonias
pequeñas sin cambio de color en el medio circundante. Otras bacterias eran generalmente
inhibidas, haciendo posible el empleo de un inoculo grande sin peligro de sobrecrecimiento.
Chapman recomendó la incubación durante 36 h a 37°C. en un estudio de resistencia a mastitis
bovina estafilococal crónica con terapia masiva de penicilina, McClullon manifestó que los
estafilococos resposnsables de la mastitis crecían bien y formaban ácido en agar con manitol y
rojo fenol al cual se le había añadido un 7,0% de cloruro sódico. Velilla, Faber y Pelczar usaron
agar con sal y manitol para el aislamiento de estafilococos productores de coagulasa en leche
con mastitis bovina. Ellos recomendaron el uso de agar con sal y manitol y medio para
estafilococos para asegurar la máxima recuperación de estos organismos.
Formula, ingredientes por litro de agua destilada:
Método de preparación:
Almacenamiento:
- Agar con sal y manitol por debajo de los 30°C
- Medio preparado de 2-8°C
- Control de calidad, especificaciones de identificación:
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Según Difco & BBL Manual. (s.f) el agar Baird-Parker se caracteriza por:
Uso: El Agar base de Baird Parker, cuando se suplementa con enriquecimiento con
telurito EY se recomienda para la detección y enumeración de estafilococos positivos a la
coagulasa en alimentos y en otros materiales.
Introducción/ Principios:
El medio completo se prepara añadiendo, asépticamente, enriquecimiento con telurito
EY al agar base de Baird Parker. El medio permite la detección, enumeración y aislamiento de
estafilococos positivos a la coagulasa, después de 24 horas de incubación en una variedad de
especímenes, tales como productos alimenticios, aire, suelos, especímenes fecales de la piel y
membranas mucosas.
El medio contiene litio y telurito potásico para suprimir el crecimiento de organismos
no deseados, en tanto que permite crecer Staphylococcus aureus. Además, incluye piruvato y
glicina para potenciar el crecimiento de estafilococos. El telurito y los componentes de la yema
de huevo son los responsables de la diferenciación de estafilococos positivos a la coagulasa por
la formación de colonias convexas, de color negro, brillantes, rodeadas por una zona
transparente debida a los estafilococos negativos a la coagulasa. El crecimiento de estos últimos
se puede observar sólo ocasionalmente, y las colonias, con anchas zonas opacas, que aparecen
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Triptona 10g
Extracto de carne 5g
Extracto de levadura 1g
Glicina 12g
Piruvato sódico 12g
Cloruro de litio 5g
Agar 20g
pH final 7,0 ± 0,2 a 25°C
Método de preparación:
Almacenamiento:
- Agar base de Baird Parker por debajo de los 30°C
- Enriquecimiento con telurito EY de 2-8°C
- Medio preparado de 2-8°C
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Procedimiento:
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Agar 15g
pH final 6,8 ± 0,2 a 25°C
Almacenamiento:
- Agar con nutritivo por debajo de los 30°C
- Medio preparado de 15 a 30°C
Es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque divide a las bacterias en dos
grandes grupos: gram negativos y gram positivos. Las bacterias reaccionan de forma diferente
a la tinción de Gram debido probablemente a diferencias químicas de sus paredes celulares, que
afectan a la retención o salida del complejo cristal violeta-yodo. Entre otras diferencias las
bacterias Gram positivas tienen una pared más gruesa compuesta de péptido glucano y la pared
de las Gram negativas tiene una capa externa con lipopolisacaridos.
Materiales y equipos
Reactivos y soluciones
- Cristal Violeta
- Yodo
- Yoduro de Potasio
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- Safranina
- Etanol 95% p/p
Preparación de soluciones
Procedimiento:
- Secar al aire.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas que ponen en evidencia la existencia
de una enzima o pasos metabólicos determinados y se realizan para la identificación de
microorganismos.
- Balanza analítica
- Autoclave vertical
- Incubadora de CO2
- Sistema de purificación de agua
La infusión cerebro-corazón es una fórmula muy rica que puede emplearse, ya sea
como caldo o medio sólido, con sangre adicional o sin ésta, para el crecimiento de una gran
48
Triptona 10g
Extracto cerebro de ternera 12,5g
Extracto corazón de buey 5g
Cloruro sódico 5g
Fosfato disódico 2,5g
Preparación:
2.4.5. Coagulasa
Permite separar Staphylococcus aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de
estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa negativos.
Staphylococcus aureus posee dos tipos de coagulasa:
- Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la pared
celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de
coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado
(test en lámina).
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Prueba de Coagulasa:
- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se siembra sobre tubos conteniendo medio
BHI, incubar a 35⁰C por 24 h.
- Mediante una micropipeta estéril de 1 ml, añadir 0,3 ml de Plasma reconstituido y 0,1
ml de cepa contenida en medio BHI a un tubo de ensayo.
- Incubar a 35°C por y examinar periódicamente por un lapso de 6 h para observar la
formación de coagulo, solamente un coagulo firme y completo que permanece en su
lugar al agitar o invertir el tubo, es considerado positivo para Staphylococcus aureus. Si
se obtiene una coagulación parcial, estas colonias deben ser confirmadas mediante la
prueba Dnasa.
2.4.6. Desoxirribonucleasa
Permite diferenciar Staphylococcus aureus que es la única especie dentro del género
Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies. La desoxirribonucleasa es una poderosa
enzima elaborada por las cepas patógenas de Staphylococcus aureus. Se caracteriza por
depolimerizar el ADN y por su termorresistencia, razón por la que se denomina termonucleasa.
Se basa en la presencia de la enzima que es capaz de separar los enlaces fosfodiester internos
de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se
combina con DNA altamente polimerizado.
50
Triptona 20g
Acido desoxirribonucleico 2g
Cloruro sódico 5g
Agar 12g
Preparación
Procedimiento
- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se siembra en estrías radicales o en una sola
estría, sobre la superficie de agar DNasa.
- Incubar a 37⁰C durante 18 a 24 h.
- Sobre el crecimiento se vierte ácido clorhídrico 1N y se espera unos minutos a que se
produzca la reacción, que consiste en la aparición de una zona transparente a su
alrededor, lo que indica que el germen en estudio ha liberado desoxirribonucleasa
(DNasa).
- Se puede sustituir el ácido clorhídrico 1N por solución de azul de toluidina. En este
caso, la reacción positiva se manifiesta por la aparición de un halo rosa que rodea la
zona de crecimiento.
51
2.4.7. Catalasa
𝐶𝐴𝑇𝐴𝐿𝐴𝑆𝐴
2H2O2 > 2H2O + O2
Procedimiento:
Resultados:
2.4.8. Oxidasa
artificiales, actuando como reductores del sistema citocromo C oxidasa, el reactivo N,N dimetil,
1,4 fenilendiamina clorhidrato es a la vez aceptor y dador de electrones. La prueba se realiza
utilizando un papel filtro que se impregna con el reactivo oxidasa en una solución acuosa al
1%, el cual es muy sensible a la luz y al aire.
Los microorganismos utilizan una gran variedad de compuestos orgánicos, incluyendo
carbohidratos. Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son muy complejos para entrar en
la célula bacteriana, por lo que primero son catabolizados a monosacáridos, siendo estos una
fuente energética de muchos microorganismos. Las vías y los productos finales de la
fermentación dependen del sustrato, de las enzimas presentes y de las condiciones en las que se
lleva a cabo la reacción. Las bacterias pueden clasificarse en fermentadores con producción de
ácido y fermentadores con producción de ácido y gas. Algunas bacterias pueden fermentar la
glucosa anaeróbicamente, otros la oxidan y algunos microorganismos pueden metabolizarla por
ambos mecanismos, mientras otras bacterias son incapaces de utilizarla.
Los productos finales detectables, característicos en una prueba bioquímica
relacionada con carbohidratos son:
a) ácido láctico
b) ácido láctico y fórmico
c) ácido láctico y alcohol etílico (etanol)
d) acetilmetilcarbinol (acetoína) y dióxido de carbono
e) etanol
f) ácido succínico -----> ácido propiónico y CO2
g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico
h) ácido butírico a butanol
Procedimiento:
Resultados:
Procedimiento:
El medio se utiliza en tubos inclinados, con fondo abundante y una cuña corta, que se
siembra en estría en la superficie y picadura en el fondo. Es recomendable utilizar tubos con
tapones de algodón para permitir la re-oxidación del indicador. Si se utilizan tapones de rosca,
estos deben aflojarse para permitir el intercambio gaseoso.
Resultados.
Procedimiento:
Se siembran un inoculo del microorganismo por picadura hasta el fondo del tubo y por
estría en la superficie de la cuña. Se deja incubar durante 24 h a 37°C.
Resultados:
Prueba positiva: Color púrpura turbio o púrpura amarillento apagado (producido por
la cadaverina).
Prueba negativa: Color amarillo claro y brillante (solamente fermentación de la
glucosa).
Producción de hierro: Precipitado negro en el fondo del tubo.
Son un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas que sirven para caracterizar bacterias
e diferente géneros que existen en la naturaleza. Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo,
Voges-Proskauer y Citrato.
2.4.11.1. Indol
Procedimiento:
El medio de cultivo para realizar esta prueba es agua peptonada (rica en triptofano), la
peptona se agrega al 1%.
Se distribuye en tubos de hemólisis a razón de 3 ml y de 5 ml en tubos de ensayo según
se utilice y se esteriliza en autoclave durante 15 min a 121ºC.
Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante
48 h.
La lectura se realiza con el reactivo de Kovacs, cuya composición es la siguiente:
p-dimetilaminobenzaldehido 5g
Alcohol isoamílico 75 ml
HCl concentrado 25 ml
La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo
de metilo, para determinar la concentración de iones hidrogeno presente cuando una bacteria
cataliza la glucosa.
Por medio de esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido-
mixta sobre los azúcares. Ésta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del tipo
fórmico, acético y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad de los ácidos orgánicos).
Procedimiento:
El medio es líquido, se prepara y se distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se
esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.
57
Procedimiento:
Resultados:
Para que el resultado sea positivo el medio vira de verde a azul, ocurriendo una
alcalinización de este. Si el medio permanece igual (verde) será un resultado negativo.
Resultados:
Resultados:
2.5.1. Liofilización
2.6.1.1. Homogeneización:
Coagulasa:
- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se traspasan a tubos con medio BHI, incubar
a 35⁰C por 24 h
- Mediante una micropipeta estéril de 1 ml, añadir 0,3 ml de Plasma reconstituido y 0,1
ml de cepa contenida en medio BHI a un tubo de ensayo.
- Incubar a 35ºC y examinar periódicamente por un lapso de 6 h para observar la
formación de coagulo.
Desoxirrinonucleasa:
- De las colonias aisladas en Agar nutritivo se siembra en estrías radicales o en una sola
estría, sobre la superficie de agar DNasa.
- Incubar a 37⁰C durante 18 a 24 h
- Sobre el crecimiento se vierte ácido clorhídrico 1N.
65
Catalasa:
Se siembra en un vidrio portaobjeto un inoculo del agar nutritivo. Se añade una gota
de peróxido de hidrógeno al 3% y se observa el resultado de la reacción.
Oxidasa:
Del agar nutritivo se extrae un inoculo de cultivo y coloca en contacto con el papel
filtro impregnado con el reactivo de oxidasa utilizando un asa de vidrio.
- Sembrar un inoculo del agar nutritivo por estría en la superficie y picadura en el fondo
del medio TSI.
- Incubar durante por 24 h a 37°C.
- Se siembran un inoculo del agar nutritivo por picadura hasta el fondo del tubo y por
estría en la superficie de la cuña en el tubo con medio LIA.
- Se deja incubar durante 24 h a 37°C.
Pruebas IMVIC
Indol:
- Se siembra un inoculo del agar nutritivo con asa loop y se traspasa a tubos con agua
peptonada.
- Incubar durante 48 h a 37°C
- Leer con reactivo kovacs
68
Prueba de Voges-Proskauer:
- Se siembra un inoculo del agar nutritivo utilizando asa loop en un tubo con citrato de
Simmons inclinado.
- Incubar durante 24 a 48 h a 37°C.
- Se siembra un inoculo del agar nutritivo en un tubo con el medio de cultivo por picadura.
- Se deja incubar durante 24h a 37°C
Hidrolisis de la Urea:
- Se siembra un inoculo del agar nutritivo con un asa loop a un tubo con caldo urea
- se incuba durante 24 h a 37°C
RESULTADOS Y RECOMENDACIONES
MUESTRA 1
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M) CEPA D (M)
TINCION GRAM + + + +
COAGULASA + + - -
Dnasa + + + -
CATALASA + + + +
MEDIO MOVILIDAD, INDOL Y
(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
ORNITINA (MIO)
LIA K/K K/K K/A A/A
TSI A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - + +
INDOL + + + +
ROJO DE METILO + + + +
VOGES-PROSKAUER + + + -
UREASA - - - -
OXIDASA - - - -
Fuente: Elaboración propia
MUESTRA 2
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M)
TINCION GRAM + + +
COAGULASA + + +
Dnasa + + +
CATALASA + + +
MEDIO MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA
(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
(MIO)
LIA K/K K/K K/K
TSI A/A A/A A/A
CITRATO - - -
INDOL + + +
ROJO DE METILO + + +
VOGES-PROSKAUER + + +
UREASA - - -
OXIDASA - - -
Fuente: Elaboración propia
73
MUESTRA 3
CEPA A CEPA B CEPA C CEPA D CEPA D
PRUEBAS (BP) (BP) (BP) (M) (M)
TINCION GRAM + + + + +
COAGULASA + + + + +
Dnasa + + + + +
CATALASA + + + + +
MEDIO
MOVILIDAD,
INDOL Y ORNITINA
(MIO) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
LIA K/K K/K K/K K/K K/K
TSI A/A A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - - - -
INDOL + + + + +
ROJO DE METILO + + + + +
VOGES-
PROSKAUER + + + + +
UREASA - - - - -
OXIDASA - - - - -
Fuente: Elaboración propia
74
MUESTRA 4
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (BP) CEPA D (M)
TINCION GRAM + + + +
COAGULASA + + + +
Dnasa + + + +
CATALASA + + + +
MUESTRA 5
CEPA A CEPA B CEPA C CEPA D CEPA E
PRUEBAS (BP) (BP) (BP) (M) (M)
TINCION GRAM + + + + +
COAGULASA + + + - +
Dnasa + + + + +
CATALASA + + + + +
MEDIO
MOVILIDAD,
(-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
INDOL Y ORNITINA
(MIO)
LIA K/K K/A K/K A/A K/K
TSI A/A A/A A/A A/A A/A
CITRATO - + - - +
INDOL + + + + +
ROJO DE METILO + + + + +
VOGES-
+ + + - +
PROSKAUER
UREASA - - - - -
OXIDASA - - - - -
Fuente: Elaboración propia
76
MUESTRA 6
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M)
TINCION GRAM + + +
COAGULASA + + +
Dnasa + + +
CATALASA + + +
MUESTRA 7
CEPA A CEPA B CEPA C CEPA D CEPA E CEPA F CEPA G
PRUEBAS (BP) (BP) (M) (M) (M) (M) (M)
TINCION
+ + + + + + +
GRAM
COAGULASA + + + + + + +
Dnasa + + + + + + +
CATALASA + + + + + + +
MEDIO
MOVILIDAD,
INDOL Y (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)
ORNITINA
(MIO)
LIA K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K
TSI A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A
CITRATO - - - - - - -
INDOL + + + + + + +
ROJO DE
+ + + + + + +
METILO
VOGES-
+ + + + + + +
PROSKAUER
UREASA - - - - - - -
OXIDASA - - - - - - -
Fuente: Elaboración propia
78
MUESTRA 8
PRUEBAS CEPA A (BP) CEPA B (BP) CEPA C (M) CEPA D (M)
TINCION GRAM + + + +
COAGULASA + + - +
Dnasa + + + +
CATALASA + + + +
NUMERO DE MUESTRA Aw T⁰
MUESTRA 1 0.926 22.93
MUESTRA 2 0.930 23.71
MUESTRA 3 0.936 23.91
MUESTRA 4 0.924 23.70
MUESTRA 5 0.914 23.11
MUESTRA 6 0.899 22.15
MUESTRA 7 0.933 23.90
MUESTRA 8 0.897 22.12
Fuente: Elaboración propia
80
Nº de cepas %
Positivas 31 89%
Negativas 4 11%
Total 35 100%
Fuente: Elaboración propia
Cepas Aisladas
11%
Positivos
Negativos
89%
Tabla 3-12. Tabla con las cepas aisladas según el medio de cultivo.
46%
Baird Parker
54% Manitol
Gráfico 3-3. Gráfico con las cepas aisladas según el medio de cultivo.
83
DISCUSIÓN
Figura 29. Criterios Microbiológicos Comidas y platos mixtos con ingrediente(s) crudo(s) y/o
cocido(s), incluidos emparedados
De acuerdo con los resultados obtenidos, se infiere que existen medidas sanitarias
insuficientes en la elaboración de este producto, para evitar intoxicaciones alimentarias es
importante la preparación de los manipuladores de alimentos con el objetivo de cumplir con
adecuadas medidas de higiene al procesar los alimentos.
86
CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFÍA
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