Universidad Pedagógica Nacional

Facultad de Ciencia y Tecnología

Licenciatura en Química
Sistemas bioquímicos
BARBOSA, Yulima; QUIROGA, Jennifer; NARANJO, María; PEÑA, Alex Ferney.1

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA UREASA: VARIABLE TIEMPO

DE INCUBACIÓN Y EFECTO pH EN UNA MUESTRA DE HARINA DE SOYA.

Resumen: El presente artículo presenta los resultados obtenidos experimentalmente de la

actividad enzimática de la ureasa cuantificada por espectrofotometría UV. La observación de la
descomposición enzimática de la urea mediante ureasas la cual tiene un gran interés biológico,
este estudio permite identificar factores que afectan la actividad enzimática de la ureasa.
Adicionalmente, la reacción puede ser utilizada como introducción a la cinética de enzimas: a
partir de varias mediciones se puede determinar la velocidad máxima de reacción, la constante de
Michaelis y la concentración de enzimas. En esta práctica también se comparó el efecto de la
temperatura en la velocidad de la hidrólisis de la urea catalizada por la ureasa en harina de soya.
Palabras Clave: ureasa, espectrofotometría UV, actividad enzimática, cinética.
Abstract: The present article presents the results obtained experimentally of the enzymatic
activity of urease quantified by UV spectrophotometry. The observation of the enzymatic
decomposition of urea by ureases which has a great biological interest, this study allows
identifying factors that affect the enzymatic activity of urease. Additionally, the reaction can be
used as an introduction to the kinetics of enzymes: from several measurements the maximum
reaction rate, the Michaels constant and the concentration of enzymes can be determined. In this
practice, the effect of temperature on the rate of urea hydrolysis catalyzed by urease in soybean
meal is also compared.
Keywords: urease, spectrophotometry- UV, enzymatic activity, kinetics.
Introducción
Las enzimas son las encargadas de acelerar la velocidad de las reacciones químicas en el
organismo. A los productos de la reacción enzima-sustrato se le denomina actividad enzimática,
la cual se ve afectada por factores como el pH, inhibidor, concentración del sustrato o la enzima
y temperatura. Un ejemplo es la ureasa que es una enzima del grupo de las amidas, que escinde
enlaces C-N no peptídicos, es una enzima que cataliza la conversión de urea a amonio y
carbamato, en una reacción de orden cero:
[𝑁𝐻2 ]2 𝐶𝑂 + 𝐻2 𝑂 → 𝐶𝑂2 + 2𝑁𝐻3
En este ensayo de laboratorio se empleó la ureasa, perteneciente al grupo de las hidrolasas (que
rompen enlaces por hidrólisis) y se presenta según la siguiente reacción:
𝐻2 𝑁𝐶𝑂𝑁𝐻2 3𝐻2 𝑂 + → 𝐶𝑂2 + 2𝑁𝐻4 𝑂𝐻
Sustrato + Agua → Dióxido de carbono + Hidróxido
de carbono de amonio
La estructura tridimensional o terciaria de un enzima determina su sitio catalítico y, por lo tanto,
su actividad. Dicha estructura se encuentra estabilizada por una serie de enlaces no covalentes

1
Licenciados en ciclo de profundización
(hidrofóbicos, puentes de hidrógeno, atracciones electrostáticas) y covalentes (puentes de
disulfuro) que existen entre los grupos R de los aminoácidos. Los cambios de pH modifican las
cargas de los grupos R de los aminoácidos que no son neutros (como el aspartato, lisina, arginina
y glutamato) e interfieren con las atracciones electrostáticas y su estabilidad estructural
tridimensional, lo que provoca una pérdida total o parcial de la actividad enzimática (cada
enzima tiene un pH óptimo en relación con la actividad). (Quesada, 2007).
La cinética enzimática es el estudio de las reacciones químicas que son catalizadas por las
enzimas. Aquí, se determina la velocidad de la reacción y se investigan los efectos de variar
diversas condiciones de la reacción (como la temperatura o la concentración de enzima, por
ejemplo). Estudiar la cinética de la catálisis de una enzima, puede revelar su mecanismo
catalítico, su papel en el metabolismo, cómo se controla su actividad, y cómo un fármaco podría
inhibir a esta enzima. (González, López, Peréz, & Vázquez)
Las enzimas son generalmente moléculas de proteínas que transforman otras moléculas que se
denominan como los sustratos de la enzima. En toda reacción enzimática la enzima no es
consumida ni sufre modificación alguna, de manera que puede continuar transformando otra
molécula de sustrato en producto. Por lo tanto, si se garantiza que la concentración de sustrato no
será un elemento limitante, a mayor tiempo de reacción mayor será la formación de producto o la
degradación del sustrato; por otro lado, también la reacción se puede ver influenciada por la
concentración de enzima, si esta se incrementa se forma mayor cantidad de producto por unidad
de tiempo. El incremento de velocidad de reacción es directamente proporcional al incremento
de la concentración de enzima, siempre y cuando la cantidad de sustrato no sea un limitante.
(Quesada, 2007).
Para el desarrollo de estos análisis se aplica inicialmente la ecuación de Michaelis-Menten, ya
que se trabaja una proteína no alostérica. Se define como la situación en que una proteína se ve
alterada por su actividad como consecuencia de la unión de una molécula en un sitio diferente al
centro activo eje fundamental sobre el que gira la cinética enzimática y que describe la velocidad
de reacción de muchas reacciones enzimáticas:
𝑉𝑚𝑎𝑥 ∗ [𝑆]
𝑉=
𝐾𝑚 + [𝑆]
La ecuación de Michaelis-Menten es capaz de describir el cambio sufrido por la velocidad de
una reacción catalizada por una enzima al variar la concentración del sustrato. La reacción que se
establece entre la enzima y su sustrato va precedida de la formación de un complejo (Lopez &
Garcia, 2015):

Michaelis determinó la denominada constante de Michaelis (Km) que da una idea de la afinidad
que tiene la enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad (predominan las
formas E y S libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad (predomina la forma ES).
𝑘−1 + 𝑘2
𝐾𝑚 =
𝑘1
La velocidad máxima Vmáx estima el número de centros activos del enzima. A la constante kcat
(poder catalítico del enzima) se la reconoce con el nombre de número de recambio, es el número
de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo. Por lo que la Vmáx
depende de dos cosas, la cantidad de enzima presente y la capacidad catalítica de la enzima, es
decir la velocidad con que transforma al sustrato por unidad de tiempo (M. G. Claros et al,
2010), así como los factores que estimulan o inhiben dicha velocidad de reacción. Demostró que
las sucesivas adiciones de sustrato al medio de la reacción provocan un abrupto incremento de la
velocidad de reacción hasta un cierto punto en el que la enzima se satura y la adición posterior de
sustrato ya no afecta a la velocidad; es el momento en el que se alcanza la velocidad máxima de
reacción (Vmax). (Lopez & Garcia, 2015)
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉𝑚á𝑥 = 𝑘2 [𝐸] 𝐾𝐶𝐴𝑇 = [𝐸]𝑡

El diagrama de Lineweaver-Burk que se emplea como herramienta gráfica para calcular los
parámetros cinéticos de una enzima. Dada la ecuación:

1 𝐾𝑚 1
= +
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∗ [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar la Km (constante de
Michaelis-Menten) y Vmax (velocidad máxima); el punto de corte con el eje de ordenadas es el
equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de –1/ Km. Es cierto que la
representación de Lineweaver-Burk presenta algunos inconvenientes ya que, al requerir de
dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir a grandes errores. (Clavijo,
2002).
Metodología
1. Preparación de reactivos
Buffer Fosfatos pH 7

Diagrama 1. Preparación Buffer fosfato

Reactivo nitroprusiato Reactivo hipoclorito

2. Efecto de tiempo de incubación
Muestra

Diagrama 2. Extracción de ureasa en una muestra de Harina de Soya.

3. Curva de calibracion

Diagrama 3.Curva de Calibración del Cloruro de Amonio rango de 530 nm

4. Estudio cinético: UREASA 100mM-51mL

Diagrama 4. Estudio cinético con respecto a la actividad enzimática de la Ureasa

5. Efecto pH

Diagrama 5. Estudio enzimático del efecto pH en la Ureasa

Resultados y análisis
A. Datos obtenidos para la curva de calibración del cloruro de amonio
Volumen preparación de Concentración teórica Concentración corregida Absorbancia
soluciones (mL) de NH4+ ( ppm) de NH4+ ( ppm)
0 0 0 0,000
1 mL( 5 ppm) 0,1 0,1033 0,013
5 mL (10 ppm) 1 1,0331 0,095
1 2 2,0663 0,185
2,5 5 5,1658 0,3757
3,5 7 7,2321 0,396
4 8 8,2651 0,505
5 10 10,331 0,644

B. Gráfico de curva de calibración del cloruro de amonio

Curva de calibración NH4Cl a 530nm

0.700

0.600

0.500
Absorbancia

0.400

y = 0.0588x + 0.0256
0.300
R² = 0.9803

0.200

0.100

0.000
0 2 4 6 8 10 12
Concentraciòn (ppm)

Grafico 1. Valores curva de calibración a 530nm

Para establecer las concentraciones de NH₄⁺ y CO (NH₂)₂ en cada una de los factores
que pueden afectar la actividad enzimática de la ureasa, inicialmente se realiza la curva
de calibración como se muestra en la gráfica 1. Así mismos se establece el ajuste a la
ecuación de la recta con las correspondientes incertidumbres para los iones amonio
obteniendo Y= (0,0588 ± 0,00941 ) X + (0,0256 ± 0,01456).
 C. Tratamiento de datos estadísticos.
Para establecer el tratamiento de datos obtenidos, se realizan los cálculos estadísticos,
así mismo la gráfica de la recta con los correspondientes intercepto y pendiente,
necesarios para definir los límites de detección, cuantificación e incertidumbres de las
medidas.
A continuación se presenta la ecuación de la línea recta, sus variables: intercepto,
pendiente y coeficiente de correlación lineal. En la segunda parte de la tabla el valor de
incertidumbre de las medidas experimentales Solución Patrón NH₄⁺ por
Espectrofotometría Visible a 530nm.
Valores obtenidos de la curva de calibración
Ecuación de la recta y = 0,0588x + 0,0256
Valor intercepto 0,0256
Valor pendiente 0,0588
Coeficiente de correlación lineal R² = 0,9803
Incertidumbre de las medidas experimentales
Sy/x 0,1943
Sb 0,0182
Sa 11,7681
Ajuste de la recta con valor de incertidumbre
Y= (0,0588 ± 0,00941 ) X + (0,0256 ± 0,01456)

D. Límite de detección (LDD) y cuantificación (LDC) para absorbancia (y) y concentración

(x) en mg/L para iones NH₄⁺.
Límite de detección 𝒀𝑳𝑫𝑫 = 𝒂 + 𝟑𝒔𝒚⁄ = 𝟎, 𝟔𝟎𝟖𝟒 𝒀𝑳𝑫𝑪 − 𝒂
𝒙 𝑿𝑳𝑫𝑫 = = 𝟗, 𝟗𝟏𝟎𝟖
𝒃

Límite de cuantificación 𝑌𝐿𝐷𝐶 = 𝑎 + 10𝑠𝑦⁄ = 1,9681 𝑌𝐿𝐷𝐶 − 𝑎

𝑥 𝑋𝐿𝐷𝐷 = = 33,036
𝑏

𝑺𝒚⁄ ∑(Yi− ўi )2
𝒙
𝑠𝑦⁄ = √ (𝑛−2)
=0,1943
𝑥

E. Datos Experimentales según consumo de la urea con relación al tiempo rango 530 nm.
Y= (0,0588 ± 0,00941 ) X + (0,0256 ± 0,01456) 𝑪𝑶(𝑵𝑯𝟐 )𝟐 + 𝟐𝑯𝟐 𝑶 → 𝟐𝑵𝑯+𝟒 + 𝑪𝑶𝟐 + 𝑯𝟐 𝑶

Variables obtenidas Producido [NH4+ ] [CO(NH2)2 ]Consumido [CO(NH2)2 ]Restante

Tiempo Absorbancia [NH4] [NH4]/min 1/V 1/ [NH4] [CO(NH2)2] V 1/V 1/ [CO(NH2)2] V 1/ 1/V
ppm ppm [CO(NH2)2] Ppm [CO(NH2)2]
0 0,028 0,041 0,041 24,21 24,21 6,8E-02 1,1E-06 8,8E+05 1,5E+01 1E+00 1,0E+00 1,0E+00 1,0E+00

5 0,246 3,742 0,748 1,336 0,267 6,2E+00 1,2E+00 8,0E-01 1,6E-01 1E+00 2,0E-01 1,0E+00 5,0E+00

10 0,380 6,025 0,602 1,660 0,166 1,0E+01 1,0E+00 1,0E+00 1,0E-01 1E+00 1,0E-01 1,0E+00 1,0E+01

15 0,493 7,957 0,530 1,885 0,126 1,3E+01 8,8E-01 1,1E+00 7,5E-02 1E+00 6,7E-02 1,0E+00 1,5E+01
20 0,801 13,193 0,660 1,516 0,076 2,2E+01 1,1E+00 9,1E-01 4,6E-02 1E+00 5,0E-02 1,0E+00 2,0E+01

25 0,845 13,930 0,557 1,795 0,072 2,3E+01 9,3E-01 1,1E+00 4,3E-02 1E+00 4,0E-02 1,0E+00 2,5E+01

30 0,839 13,827 0,461 2,170 0,072 2,3E+01 7,7E-01 1,3E+00 4,3E-02 1E+00 3,3E-02 1,0E+00 3,0E+01

F. Datos del estudio cinético del efecto tiempo de incubación Se determina el tiempo óptimo
de incubación de la enzima ureasa en el cual es posible formar la mayor concentración
de NH₄⁺ formado a partir de la CO (NH₂)₂, corresponde al intervalo de la variable
tiempo entre de 20 a 30 min teniendo como resultado [13,193 - 13,827] ppm de
producto, como se establece en los siguientes resultados:

Tiempo vs [NH+4]
16.0

14.0

12.0
Concentracion (ppm)

10.0

8.0

6.0

4.0

2.0

0.0
0 5 10 15 20 25 30 35
-2.0
Tiempo (min)

Grafico 2. Actividad de la enzima ureasa con respecto a tiempo de incubación

En esta grafica se encuentra la relación entre tiempo de incubación con respecto a la

concentración de producto, esto permite deducir que el tiempo de incubación más óptimo
para el amonio es a 25 minutos donde se genera la más alta concentración de producto
obteniendo como resultado 13,930 ppm.
Respecto a dichas concentraciones del amonio formado en los diferentes intervalos de
tiempo se deduce que la velocidad con la que cambia la concentración de urea con respecto
al tiempo de incubación al estar en contacto con la enzima ureasa. Adicionalmente se
observa el cambio de la velocidad con respecto a la cantidad de sustrato (urea) que no
reacciona en el sistema según transcurre el tiempo de incubación como se puede observar
en la siguiente gráfica:
 1/V [NH+4] vs 1/[NH+4] producido
2.5

2.0

1/Velocidad 1.5

1.0

0.5

0.0
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300
1/ concentracion

Grafico 3. Actividad enzimática de la ureasa con respecto a la concentración de amonio producido

El estudio de la cinética o actividad enzimática de la ureasa se puede determinar graficando

la cantidad de producto formado( NH4+) o sustrato consumido CO(NH₂)₂,en una unidad de
tiempo. Es así como se grafica No. 2 de la velocidad (Concentración de amonio producido/
unidad de tiempo) con respecto a la concentración de NH4+ producido de la gráfica No. 3,
bajo la misma temperatura por un tiempo determinado.

1/V vs 1/[CO(NH₂)₂] consumida

1000000

800000

600000
1/Velocidad

400000

200000

0
0.0E+00 5.0E+00 1.0E+01 1.5E+01 2.0E+01 2.5E+01
-200000

-400000
1/ concentracion

Grafico 4. Actividad enzimática de la ureasa con respecto a la concentración de [CO (NH₂)₂] consumida
 Mientras que en la gráfica 4. (Actividad enzimática de la ureasa con respecto a la
concentración de [CO (NH₂)₂] consumida) se puede observar la relación de la velocidad
de reacción de la urea va disminuyendo proporcionalmente al consumo de dicho sustrato,
existiendo un equilibrio de los complejos o productos intermedios (E + S) que contribuyen
en la producción de amonio. Así mismo en la gráfica 5 Curva actividad enzimática de la
ureasa con respecto a la concentración de [CO (NH₂)₂] restante se evidencia que la
concentración de urea restante aumenta (pendiente positiva) debido a que está siendo
catalizada por la enzima ureasa, hasta llegar a un punto en el cual su concentración
permanece constante, esto es posible debido a la pérdida de actividad de la ureasa para la
hidrólisis de la urea en amonio.

1/V vs 1/[CO(NH₂)₂] Restante

$35.00

$30.00

$25.00
1/Velocidad

$20.00

$15.00

$10.00

$5.00

$-
0.0E+00 2.0E-01 4.0E-01 6.0E-01 8.0E-01 1.0E+00 1.2E+00
1/ concentracion

Grafico 5.Actividad enzimática de la ureasa con respecto a la concentración de [CO(NH₂)₂] restante

G. La actividad de la enzima ureasa con respecto al pH

Las proteínas presentan cierta distribución de cargas en su estructura, cualquier
modificación en sus cargas altera su pH y por ende el carácter iónico de los grupos amino
y carboxilo de su superficie proteica; dado que las enzimas son proteínas cualquier
cambio en su distribución de carga tendrá directa relación con el pH, afectando las
propiedades catalíticas de la enzima, las reacciones catalizadas por las enzimas en este
caso la urea en presencia de ureasa, muestran una dependencia importante de la
concentración de iones hidrogenión, por tanto la mayoría de enzimas tienen una actividad
óptima a pH 5 - 9.
A continuación se encuentran los datos experimentales de los valores de pH.
pH Absor. ppm(NH4) T Velocidad
1 0,111 1,45238095 10 0,1452381
5 0,684 11,1972789 10 1,11972789
7 0,068 0,72108844 10 0,07210884
 Todas las curvas de actividad frente al pH tienen forma de campana, de acuerdo a la
gráfica no. 6 Valores de pH contra la concentración. Se observa el efecto pH, se puede
afirmar que a pH 4, la ureasa genera mayor concentración de iones amonio en un rango
de 3 a 5 valor de pH obteniendo un valor mayor a 12,00 ppm NH₄⁺en la cima de la
campana, debido a la desnaturalización de la enzima y efectos generados por el medio
ácido sobre el estado de carga de la ureasa.

pH vs. Concentracion.
14 Con respecto a esta
12 gráfica se evidencia que
10
a pH de 1 la actividad
enzimática es bajita, de
8
Conc.

lo cual se puede inferir

6
que a pHs ácidos la
4 actividad enzimática se
2 ve afectada
0 negativamente. Cuando
0 2 4 6 8 aumentó el pH de 3 a 5 la
pH actividad enzimática de
la ureasa aumentó. Sin
Grafico 6. Valores de pH contra la concentración embargo, no es posible
especificar si a pH 4 es el
pH vs. Velocidad. pH óptimo ya que se
tenía que haber tomado
1.4
1.2
en cuenta una mayor
1 cantidad de puntos para
Velocodad

0.8 asi determinar el

0.6 comportamiento de la
0.4 enzima a pH alcalinos,
0.2
neutro y ácido. Por tanto,
0
0 2 4 6 8
solo se puede inferir que
pH
en esta práctica el pH de
mayor actividad
Grafico 7. Valor de la velocidad (ppm/min) contra el pH enzimática fue a pH
neutro.

H. La actividad de la enzima ureasa con respecto a la temperatura

La velocidad de reacción catalizada por una enzima normalmente aumenta cuando se
incrementa la temperatura, por tanto permite que la actividad enzimática de la ureasa
aumente por el incremento en la energía cinética y los choques efectivos generados por el
sustrato urea, cuando se excede la barrera de la energía de activación, posiblemente la
cadena poli peptídica comienza a desdoblarse afectando la actividad catalítica de la
ureasa, (Quesada, 2007) de acuerdo a el grafico No. 8Actividad de la enzima ureasa con
respecto al Temperatura , se establece que el rango de temperatura en el cual la ureasa
mantiene su actividad competente y estable es por debajo de los 100°C.
Este comportamiento se puede explicar cómo el resultado de dos fenómenos
concurrentes:
 Un incremento genuino en la velocidad de la reacción catalizada como respuesta
a un aumento de temperatura.
 Una progresiva inactivación (desnaturalización de la enzima) por un aumento de
temperatura
La mayoría de las proteínas, incluidas las enzimas están notoriamente más expuestas a
una desnaturalización irreversible a temperaturas mayores de 40-50ºC. Los cambios
progresivos de temperaturas a las que se somete una proteína puede explicar la pérdida
radical de la actividad catalítica de una enzima. La exposición prolongada de la enzima a
una temperatura superior a su temperatura óptima disminuye su efectividad catalítica, ya
que la fracción de enzima total que se desnaturaliza en el sistema aumenta con el tiempo.
Por consiguiente la temperatura óptima de una enzima es significativa cuando se registra
el tiempo de exposición a la cual es sometida la enzima a determinada temperatura.

Velocidad vs Temperatura
0.2

0.15
Velocidad (ppm/min)

0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120
-0.05

-0.1
Temperatura°C

Grafico 8.Actividad de la enzima ureasa con respecto al Temperatura

Por ende es indispensable determinar la estabilidad térmica de la enzima midiendo su

actividad anterior y posterior (cantidad de producto formado) usando un rango de
temperatura en el que pueda encontrarse una favorable para la reacción.
Según lo realizado en el laboratorio sería recomendable repetir este ensayo al encontrar
valores de la temperatura ya que las primeras absorbancias arrojan valores fuera del
rango de la recta, llevando erróneamente a calcular una concentración y velocidad
negativa llevando a una mala interpretación de resultados.
Discusión general de resultados
A. Curva de calibración.
Se realizó la curva de calibración para este análisis y establecer el intervalo en el cual se
cuantifico el compuesto por analizar, en este caso el producto de la hidrolisis de la urea,
que es amoniaco a 530 nm. Interpretando los resultados obtenidos en la tabla N° 1 y la
gráfica N° 1, se evidencio la linealidad de la curva ya que el coeficiente de regresión
lineal es superior a 0,95 es decir de 0,9803. La falta de correlación lineal siendo la ideal la
más próxima a 1 en este tipo de análisis, pudo estar en el cambio de celdas de vidrio, estas
podrían presentar un rayón o el deterioro de su uso, otra razón pudo ser la contaminación
de alguno de los reactivos o error del analista, por lo tanto, se recomendaría volver a
realizar el ensayo de la curva de calibración del instrumento.
B. Tiempo de incubación
Una de las maneras más común para medir la actividad enzimática de una enzima es
incubar la preparación, generalmente a 37°C, por periodos variables de tiempo, y medir el
producto de reacción en un tiempo determinado. Si la reacción es lineal en el tiempo, hasta
un periodo determinado, se puede expresar la actividad enzimática en términos de
velocidad, lo que quiere decir es la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.
(Bolaños, Lutz, & Herrera, 2003)
Sin embargo, las gráficas no siempre son lineales como se evidencia en la gráfica No.2
concentración vs tiempo debido a que se debe tener en cuenta que la reacción al llegar a un
equilibrio, es decir, que el sustrato se haya agotado para formar el producto. Además, la
enzima al ser una proteína, empieza a desnaturalizarse al cabo de cierto tiempo, y por lo
tanto pierde su actividad. Se debe tener en cuenta que la reacción puede tener un efecto
inhibidor sobre la actividad enzimática, de modo que esta disminuye cuando el producto
llega a cierta concentración. Según los datos obtenidos, se halló que el tiempo de
incubación más óptimo para la ureasa en este caso es de 25 min, ya que en este tiempo
alcanza la concentración más alta. Es importante que al revisar el comportamiento de la
velocidad de reacción Vs. tiempo de incubación esta disminuye al aumentar en el tiempo.
C. Efecto pH
Con respecto al pH en la Grafica no. 6 se evidencia que a pH de ácidos la actividad
enzimática disminuye, de lo cual se puede inferir que a los extremos en un pH muy ácidos
o muy básicos, la actividad enzimática se ve afectada negativamente. Cuando se aumentó
el pH de 3 y a 5 la actividad enzimática de la ureasa aumentó significativamente. Sin
embargo, no es posible especificar si a pH 4 es el pH óptimo ya que se tenía que haber
tomado en cuenta otro punto de pH superiores a 7 para determinar el comportamiento de la
enzima a pHs alcalinos, neutro y ácido. Por tanto, solo se puede inferir que en esta práctica
el pH al cual se evidencio mayor actividad enzimática fue entre ese rango.
D. Efecto de la concentración sobre la actividad enzimática.
La gráfica No.2 fue realizada con los datos obtenidos durante el laboratorio con la lectura
de la absorbancia, además se calculó la velocidad a cierta concentración y tiempo, al
obtener altas concentraciones de la enzima, permite graficar hasta alcanzar la velocidad
máxima de reacción por lo que se aprecia una línea perpendicular ascendente indicando
que a altas concentraciones de enzima la velocidad de reacción va en constante ascenso
hasta alcanzar la velocidad máxima de reacción y llegue a ser constante. En la gráfica se
observa que a medida que aumenta la concentración de la enzima (ureasa) la absorbancia
es más baja, esto es debido que mientras la enzima está en reacción con una velocidad
determinada, degradando rápidamente el sustrato, por lo que se obtuvo un ascenso y luego
un descenso resaltando que a altas concentraciones de enzima la velocidad de reacción
aumenta. Mientras que a mayor concentración de la enzima mayor será concentración
obtenida del producto (amoniaco), lo que se afirma es que la concentración de la Ureasa es
inversamente proporcional a la velocidad, igualmente ocurre con la concentración
obtenida de amoniaco.
Según (Barcelona, 2016), la velocidad de la reacción o catálisis varía de acuerdo a la
concentración del sustrato, ósea que al aumentar esta concentración, la actividad
enzimática aumenta, hasta alcanzar la velocidad máxima, punto en donde la enzima se
satura, ya que las enzimas tienen todos sus sitios activos ocupados. Durante la práctica se
pudo evidenciar en los resultados que a mayor concentración de sustrato será mayor su
velocidad, es decir que la concentración es inversamente proporcional a la velocidad,
comprobando la teoría.
E. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
Durante la práctica se expuso la enzima a una temperatura de 0°C, es decir, en un baño de
hielo, en donde se esperaba que la actividad enzimática redujera, dado que a esta
temperatura no se desnaturaliza, por lo cual no pierde su función catalizadora, pero si se
obtienen valores bajos de concentración (Guerra, 2014). Sin embargo, al observar la tabla
de resultados se puede evidenciar que en vez de bajar su concentración aumenta, por lo
cual no se tuvo en cuenta a la hora de graficar, se cree que fue un error experimental
debido a que se dejó bastante tiempo en reposo sin leer rápidamente ocasionando un
cambio de pH en el mismo.
Al realizar la comparación de la enzima a temperaturas elevadas como 25, 37 y 100°C;
puede recuperar completamente su función al ser expuesta a una temperatura óptima como
lo fue de encima de 60°C, donde no se evidencia mayores cambios en cuanto a la función
o acción. Según los resultados obtenidos debe repetir este análisis.
Por otro lado, en la exposición de la enzima a baño de maría a 100°C se esperaba la
desnaturalización perdiendo sus características y también sus funciones, lo cual no se pude
asegurar al hacer falta más puntos de lectura frente a la temperatura, pero a a mayor
temperatura se desnaturaliza la enzima dando consigo un aumento de concentración y
asimismo de velocidad.
Muestra de tratamiento de datos
A. Muestra de cálculo para la Corrección de la concentración de iones amonio a partir de una
solución de 10 ppm de NH₄Cl
1000𝑚𝑔 92𝑚𝑔𝑁𝐻4 𝐶𝑙
0,092𝑔𝑁𝐻4 𝐶𝑙 ∗ = = 306,67 𝑝𝑝𝑚𝑁𝐻4 𝐶𝑙
1 0,3𝐿

Corrección para concentración de 10ppm 𝑁𝐻4+

5𝑚𝐿 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝑁𝐻4 𝐶𝑙 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝑁𝐻4 18,007𝑚𝑔𝑁𝐻4
306,7𝑝𝑝𝑚𝑁𝐻4 𝐶𝑙 ( )( )( )( )=
50𝑚𝐿 53,45𝑚𝑔𝑁𝐻4 𝐶𝑙 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝑁𝐻4 𝐶𝑙 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝑁𝐻4
=
10,331𝑝𝑝𝑚𝑁𝐻+ 4

A. Estudio cinético. Efecto del tiempo sobre el periodo de incubación

Absorbancia= 0,028 𝑌𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑁𝐻4+ = 𝑚𝑋 + 𝑏
0,028 − 0,0256
𝑋𝑁𝐻4+ = = 0,041𝑝𝑝𝑚
0,0588

B. Concentración de urea efecto tiempo

𝐶𝑂(𝑁𝐻2 )2 + 2𝐻2 𝑂 → 2𝑁𝐻4+ + 𝐶𝑂2 + 𝐻2 𝑂

𝑚𝑔 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝑁𝐻4 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝐶𝑂(𝑁𝐻2 )2 60,06𝑚𝑔

0,041 𝑁𝐻4 𝐶𝑙 ( )( )( )
𝐿 18,04𝑚𝑔𝑁𝐻4 2𝑚𝑚𝑜𝑙𝑁𝐻4 1𝑚𝑚𝑜𝑙𝐶𝑂(𝑁𝐻2 )2

= 0,0682 𝑝𝑝𝑚 𝐶𝑂(𝑁𝐻2 )2

C. Tratamiento estadístico de datos espectrofotometría visible para curva de calibración

cloruro de amonio a (530nm)

C Patrón(Xo) Absorbancia(Yi) Xi^2 ( Xo -Ẋ)2 Ўi (Yo- Ў )2

0 0,000 0,000 18,272 0,0588 0,003

0,1033 0,013 0,011 17,400 0,0614 0,002
1,0331 0,095 1,067 10,507 0,0852 0,000
2,0663 0,185 4,270 4,877 0,1117 0,005
5,1658 0,376 26,685 0,794 0,1910 0,034
7,2321 0,396 52,303 8,747 0,2439 0,023
8,2651 0,505 68,312 15,924 0,2704 0,055
10,331 0,644 106,730 36,680 0,3233 0,103
PROMEDIO 4,275 0,277 32,422 14,150 0,168 0,028
Sumatoria 34,197 2,214 259,378 113,201 1,346 0,226
 D. Calculo de actividad enzimática: Vmax , Kcat y Km del efecto tiempo de incubación
1 1
Vmax = → Vmax = = 1,016 M/min
b 0,9840

Km = m. Vmax → Km = 2,0436 ∗ 1,016M = 2,076M

Vmax 1,016 M/min

K cat = → Kcat = = 1,016𝑚𝑖𝑛−1
[E]t 1M

Conclusiones
 Se lograron identificar ciertos factores que afectaron la actividad enzimática de la ureasa
como el pH, temperatura, delta de tiempo en incubación, concentración, por tanto se
establece los resultados óptimos para cada caso en los cuales se generaban mayor
concentración de amonio lo cual se facilitó con la construcción de cada una de las gráficas.
Se realizó la hidrólisis de la urea, catalizada por la enzima ureasa, obteniendo como
productos dióxido de carbono y amoniaco. Adicionalmente reconocer el amoniaco ya que
se caracteriza por dar un pH alto a la disolución y un olor característico.
 De acuerdo al tratamiento estadístico realizado en los datos experimentales
correspondientes de la curva de calibración se obtiene una ecuación de la recta Y= (0,0056
± 0,000965) X - (0,0019 ± 0,00285) y un R2 0,9862, dicho valor permite establecer con
buena precisión y exactitud la concentración de iones amonio, en cada una de las variables
que afectan la actividad enzimática, por tanto se recomienda realizar de nuevo una curva así
mismo los blancos para cada variable.
 Se determinó que el tiempo óptimo de incubación de la enzima ureasa se encuentra en el
intervalo de la variable tiempo de 20 a 30 min teniendo como resultado [13,193 - 13,827]
ppm. Por medio de los resultados experimentales se establece que el pH óptimo de la
enzima ureasa es pH 4 donde se generó una mayor concentración de iones amonio.
 El comportamiento de la actividad enzimática con respecto al pH es similar al efecto de la
temperatura, esto quiere decir, que las dos aumentan la velocidad de reacción hasta
encontrar el valor óptimo y superando este, la enzima se desnaturaliza disminuyendo la
velocidad de reacción.
 En este laboratorio no se realizó la comparación con inhibidor para hacer comparaciones al
respecto por falta de tiempo pero se logró realizar un trabajo aceptable de laboratorio y
partir de los datos experimentales se realizaron todos los respectivos análisis.
 La actividad enzimática se ve afectada negativamente y positivamente por variaciones del
tiempo de incubación, pH, temperatura y el efecto de la concentración de enzima y sustrato.
Por ejemplo, en cuanto a la variación del tiempo de incubación de o a 25 min. se presenta
una afectación positiva, porque va aumentando la concentración de amoniaco. De tal forma,
se determinó que 25 min. de incubación sería el tiempo óptimo ya que presenta una
concentración más alta y al seguir aumentando el tiempo desnaturaliza la enzima, lo que la
afecta negativamente y esto se evidencia porque la velocidad de reacción disminuye.
Bibliografía
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