ISSN 2448-6035

Resumen
El objetivo de esta investigación, es desarrollar un protocolo para la obtención de
microorganismos endógenos bioaumentados que aceleren el proceso de
compostaje de los residuos sólidos, de la industria de la palma de aceite (Elaeis
guineensis).Se aislaron 11 cepas de actinomicetos de 30 muestras de compost de
raquis de palma. Se optimizo un medio de cultivo a partir de residuos de raquis puro
en diferentes concentraciones, con la finalidad de evaluar el comportamiento de las
cepas en este medio, obteniendo como resultado una mejor expresión y velocidad
de crecimiento de las cepas M3 y M7 en la mayor concentración de raquis al 5 %
tanto en medio sólido como medio líquido. Se desarrolló un protocolo modificado de
ADN a partir, de las cepas aisladas, se aplicaron distintos ensayos hasta conseguir
el más apropiado para este tipo de microorganismos, logrando estandarizar un
protocolo de extracción de ADN con fenol-cloroformo y un kit comercial de
extracción, la cuantificación se realizó mediante microdrop para determinar la
pureza usando como indicador la relación de absorbancias a las longitudes de onda
de 260nm y 280nm y Electroforesis en gel de agarosa, para determinar la integridad
y el tamaño de la molécula de ADN. La amplificación del ADNr 16S fue exitosa,
genero fragmentos cuyos tamaños oscilaban entre 1 500 pb y 1540 pb
aproximadamente, demostrando así que el protocolo de extracción desarrollado
permite obtener DNA en condiciones de pureza y cantidad suficiente.
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Palabras claves: Actinomicetos, extracción de ADN y raquis de palma.

I. Objetivo general
Evaluar un protocolo de extracción de ADN y PCR de actinomicetos aislados del
compostaje de la industria de la palma de aceite (Elaeis guineensis).

Objetivos específicos
1. Aislamiento y caracterización de actinomicetos del compost de raquis de palma
de aceite en etapa termofilica y de maduración.

2.Extracción de ADN mediante el uso de la técnica convencional con fenol

cloroformo y un kit comercial (Promega) a partir de un medio de cultivo natural a
base de raquis de palma.

3. Detección de actinomicetos procedentes de compost de raquis mediante la

técnica PCR.

VI.Materiales y método

A. Toma de muestras
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Para la obtención de los microrganismos autóctonos se realizó de manera previa
una caracterización de las pilas de compostaje de raquis en las etapas (termofilicas
y de maduración) de las cuales se tomaron un total de 50 muestras representativas
para su posterior análisis físico-químicos y microbiológicos como lo sugiere la
Norma TécnicaColombiana NTC 5167. Se seleccionaron 30 pilas de compostaje,
tomando 10 submuestras para formar una compuesta de 50gr por cada muestra, a
una profundidad de 15 cm cada una.

B.Aislamiento primario

Se aislaron 11 cepas de actinomicetos celulíticos de la etapa termofilica y de

maduración, mediante un aislamiento primario en agar czapek-Dox y agar avena
más nistatina por la técnica de diluciones seriadas dilución hasta 10-8 los cultivos
fueron incubados a 370C por diez dias.

C.Aislamiento secundario

Luego del tiempo de incubación se realizó una segunda siembra en agar zapec dox
mas nistatina para purificar las cepas de actinomicetos presentes en el aislamiento
primario, la identificación se realizó mediante la caracterización macroscópica
donde se tuvo en cuenta textura, coloración del micelio aéreo y del sustrato, forma
y tamaño de la colonia y producción de pigmentos (Bergey & Hendricks, 1984), en
cuanto a la identificación microscópica se realizó mediante la técnica de microcultivo
(Bergey et al; 2000). La evaluación de actividades metabólicas determinantes para
realizar la identificación se baso en la reducción de azucares presentes en el kits
BD BBL CrystalTM E/NF( Microorganismos entéricos no fermentadores) [1].

D.Identificación molecular

Se siguió la metodología propuesta por cook y meyers (2003) realizándose a nivel

de genero mediante el uso de patrones de restricción de un segmento de la región
DNAr 16S
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E.Extracción de DNA

Los aislados se hicieron crecer en 50 ml de medio líquido a base de raquis de palma

al 5 % con agitación a 100 RPM (agitador orbital Thermo SCIENTIFIC, MAXQ 4450),
a temperatura de 35°C durante 24 a 36 Horas y se examinó la pureza mediante la
coloración de Gram. Se tomaron 5ml del cultivo, las muestras fueron congeladas a
-20°C por 25 min, luego se llevaron a baño maria 85°C por 15 min (baño
termostatado Thermo scienfic ), se repite el ciclo de congelación y descongelación
2 veces. A continuación se centrifugaron a 10.000 RPM por 10 min (microcentrifuga
MicroCL 21R Thermo scientific) se retira el sobrenadante
macera con 600µl de buffer de lisis celular (promega), las muestras fueron
resuspendias en 500µl en Tampón TE, adicionando 10µl de lisozima (0.66 mg/ml),
se llevó a incubar durante 30min a 37°C, se agregó 20µl de proteinasa K y 20µl de
SDS 10%, vorterizar e incubar a 55°C por 30min, se dejaron enfriar por 10min y se
agregó una proporción de 1.1 de fenol-cloroformo 550µl : 550µl, se centrifugaron a
10.000RPM por 5 min, se recuperó el sobrenadante y posteriormente se adiciona
600µl de etanol al 90%. Y se mantuvieron en congelación a 20°C por 30 min, luego
se centrifugo a 10.000RPM por 10 min, se descartó el sobrenadante y se lavó 2
veces con 300µl de etanol al 70%. A cada una de Las muestras se les adiciono 50µl
de buffer de rehidratación de DNA (promega) y se mantuvieron a temperatura
ambiente por 24 horas.

Posteriormente se procedió a realizar la técnica de electroforesis para la

confirmación de la presencia de ADN; utilizando una cámara horizontal con gel de
agarosa al 1% y Buffer TAE.

F. Amplificación y purificación del ADN 16S a partir de las extracciones de

ADN de los actinomicetos aislados
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A partir de ADN extraido de cada una de las cepas de los actinomicetos, se amplifico
por PCR el gen codificante del ADNr 16S. Posteriormente se realizó la reacción de
PCR para amplificar la región ADNr 16S. Lo anterior se llevó cabo utilizando los
¨primers¨:

Las condiciones cíclicas fueron los siguientes: desnaturalización inicial a 94 ° C

durante 3 min, 35 Ciclos de 94 ° C durante 1 min, 54 ° C durante 1 min, 72 ° C
durante 2 min, y extensión final de 10 min 72° C, ya los 10 min mantenidos a 4ºC.
Los productos se confirmaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
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Núñez6, Liliana Bueno Lopez7.Actinomicetos aislados del suelo del Jardín botánico
de la Universidad Tecnológica de Pereira.

[7]Piñero B. J., Rivas N. 2004. Aislamiento y Caracterización de una Cepa de

Actinomicetos Celulolítico Termófilo Moderado y Acidófilo. Revista Científica.

[8]RAMIREZ P. COHA J. 2003. Degradación Enzimática de Celulosa por

Actinomicetos Termófilos: Aislamiento, Caracterización y Determinación de la
Actividad Celulolítica. Revista Peruana de Biología

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