Aula 3 - SPE

Preparo de amostras para análise
de compostos orgânicos
Page ▪ 1
EXTRAÇÃO EM FASE
SÓLIDA
SOLID PHASE
EXTRACTION (SPE)
Page ▪ 2
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
Princípio:
É uma técnica de separação líquido-sólido baseada
nos princípios da cromatografia de baixa pressão.
Forma mais comum:

- material adsorvente (fase sólida) é fixado
em um tubo, através do qual passa a amostra
líquida submetida a uma vazão constante.
Page ▪ 3
CARTUCHO PARA SPE: seringa de polipropileno ou de vidro,

dentro do qual o material de empacotamento fica retido entre
dois discos (frits), de polietileno, aço inox, titânio.
Page ▪ 4
Escolha do cartucho depende:

volume da amostra, tipo de matriz, número
e tipo de analitos, entre outros...
Mais usados: volume pequeno 200 mg (1,2 mL amostra);

volume grande 500 mg (4-5 mL amostra).
Massa de sorvente varia entre 25 mg e 10 g.
Page ▪ 5
Configurações para o uso de cartuchos
Page ▪ 6
Page ▪ 7
Discos: formato alternativo em relação ao

cartucho
Page ▪ 8
Processo de extração – discos

- Filtração à vácuo (similar à filtração com kitassato);
- Imersão do disco diretamente na solução da amostra.
Page ▪ 9
Processo de extração – discos
Page ▪ 10
DISCOS: mais caros de que os cartuchos
Discos – 3 formatos
1. Membranas carregadas com partículas de 8-12 μm diâmetro
imobilizadas em fibras de politetrafloroetileno (PTFE), de
0,5 mm de espessura e de tamanhos variados.
2. Membrana carregada com partículas maiores, de 50 µm,

num disco mais espesso (1 cm diâmetro) e selada no interior
de um cartucho convencional. Na superfície superior têm um
pré-filtro de polipropileno.
3. Partículas de sorvente de diâmetros entre 10-30 m

embebidas em discos de fibra de vidro, tendo também pré-
filtro na superfície.
Page ▪ 11
Capacidade analítica típica
Analito: cafeína; sorvente: C18
Matriz Quantidade Disco empregado

máxima retida
plasma 160 µg 4 mm
375 µg 7 mm
1500 µg 10 mm
Page ▪ 12
Correspondência entre cartuchos e discos em SPE
Cartuchos Discos
50 mg/ 1 mL 4 mm/ 1 mL
100 mg/ 1 mL 7 mm/ 3 mL
200 mg/ 3 mL 7 mm/ 3 mL ou 10 mm/ 6 mL
Page ▪ 13
Vantagens do uso do disco
- Ausência de canais formados pelo material de

empacotamento;
- Fluxo mais uniforme;
- Maior capacidade de sorção;
- Maior repetibilidade e reprodutibilidade dos resultados;
Variedade relativamente pequena de sorventes e mais caros

que cartuchos
Page ▪ 14
Representação de formatos alternativos de dispositivos
para SPE.
Page ▪ 15
Extração em ponteira de pipeta descartável (disposable
pippete extraction – DPX)
Page ▪ 16
SPE usando dispersão da matriz
Fase sólida + Trituração da
amostra amostra + fase
sólida
Aplicação da Adição de
amostra solvente e
dispersa na eluição do
fase sólida no analito
cartucho
Bomba
vácuo
Page ▪ 17
Aplicações da SPE:
De maneira geral analitos não-voláteis e semi voláteis
em amostras aquosas + separação cromatográfica.
• Isolamento do analito;
• Concentração do analito;
• Isolamento da matriz;
• Estocagem da amostra.
Page ▪ 18
Isolamento do analito:
Objetivo principal: isolar o analito de interesse dos
interferentes da matriz.
Exemplo: resíduos de praguicidas em alimentos.
Page ▪ 19
Concentração do analito:
Objetivo principal: carregar o cartucho com grande
volume da amostra e eluir o analito de interesse com
pequeno volume de solvente.
Exemplo: poluentes em água.
Obs: não é um processo excludente ao anterior.
Page ▪ 20
Isolamento da matriz:
Objetivo principal: Reter na fase sólida os
interferentes da matriz (processo de clean up e não
concentração).
Page ▪ 21
Estocagem da amostra:
Objetivo principal: Empregado para análise de amostras
que se encontram em local distante do laboratório.
Exemplo: análise de água de rio localizado a grande

distância - carregamento do cartucho no local e
armazenamento a baixas temperaturas.
Page ▪ 22
Operação básica de SPE:
Depende:
• tipo de analito;
• tipo de matriz;
• natureza da retenção química.
Envolve:
• ajuste de pH;
• centrifugação;
• filtração;
• diluição;
Page ▪ 23 • adição de tampão, etc.
Etapas da SPE
Page ▪ 24
Etapa 1
Condicionamento:
Necessário para ativar a fase e para não permitir que o
material seque.
Sorvente é tratado com solução similar (em polaridade,

pH, etc) à matriz para maximizar a retenção dos
analitos.
Natureza do solvente: depende da matriz e do sorvente [sílica e

sorventes apolares – metanol; sorventes polares – solventes
orgânicos].
Page ▪ 25
Etapa 2
Aplicação da amostra:
Os analitos são retidos seletivamente e os interferentes são

eliminados total ou parcialmente.
- ajustes de pH e da força iônica pode ser feito;

- volume de L a L;
- passar a amostra com vácuo ou pressão;
- fluxo pode afetar a eficiência
Page ▪ 26 - velocidade deve ser lenta e constante.
Etapa 3
Lavagem (clean up)
Remoção dos interferentes remanescentes.
Característica do solvente:
Ter força o suficiente para eluir os interferentes mais
fracamente ligados, mas não ter força o suficiente para eluir os
analitos.
É comum o uso do composição

mesmo solvente que [ ] salina
constitui a amostra
Page ▪ 27 pH
Etapa 4
Eluição
Obtenção do analito de interesse.
Ter força o suficiente para eluir os analitos, mas não ter força o
suficiente para eluir os interferentes mais fortemente ligados.
- deve possibilitar dessorção completa

(quantitativa) dos analitos;
composição
- Volume do solvente: o menor possível [ ] salina
(pré-concentração)
Page ▪ 28 pH
Etapa 4
Eluição
Obtenção do analito de interesse.
- Dar preferência a solventes voláteis;
- duas alíquotas pequenas são mais eficientes que uma
grande;
- interação por vários segundos aumentam a eficiência da
extração.
Page ▪ 29
• Analito deve ter algum tipo de afinidade pelo

sorvente da SPE;
• Deve haver tempo suficiente de contato

analito/sorvente;
• Interferentes da amostra devem ser seletivamente

separados dos analitos;
• Analitos devem ser capazes de ser eficientemente

removidos do sorvente.
Page ▪ 30
Mecanismos de separação:
Baseados em :
-processos físicos
Ex: exclusão por tamanho
-processos químicos
Ex: interações químicas.
Interação iônicas
Ligações de hidrogênio;
Dipolo-dipolo;
Dipolo-dipolo induzido;
Page ▪ 31 Dipolo induzido-dipolo induzido
1. Adsorção: material sólido que não apresenta

filme líquido depositado na partícula.
Adsorventes mais empregados:
• Silica gel: (SiO2)n-OH

• Alumina: (Al2O3)n
• Florisil®: Mg.Al(SiO4)n
Page ▪ 32
Diferença entre Absorção e Adsorção

Page ▪ 33
Silica gel: (SiO2)n-OH

• Adsorvente + popular;
• Superfície ácida;
• Retenção compostos básicos;
• Retenção de água;
• Ativar o cartucho 80oC;
• Sílica: diâmetro da partícula: 30-50 m;
• Superfície: 500-600 m2 /g.
Page ▪ 34
Silica gel: (SiO2)n-OH
-Ligações de hidrogênio
entre entre os grupos
O O
H H
polares do analito e da
H H silica.
O O
Si Si -Eluição com solvente polar.
O
Page ▪ 35
Alumina: (Al2O3)n
• Superfície básica - Retenção compostos ácidos.
Florisil®: Mg.Al(SiO4)n
• Mais polar de todos - Adsorção irreversível.

Page ▪ 36
2. Partição: comportamento similar a de um

filme de sorvente líquido na superfície -
partição - fase quimicamente ligada.
Maior solubilidade em um
meio que em outro.
Objetivo

Page ▪ 37
Eliminar adsorção irreversível
Modificação da sílica
Si OH Si OH
Cl
Si OH Si O
Cl Si (CH2)x R Si (CH2)x R
+
Si OH Si O OH
Cl
Si OH Si OH
R = -OH, -CN, -NH2.... R = C18, C8, C2 ....

 
Fase normal Fase reversa
Interações indesejáveis com os grupos silanóis livres.

Page ▪ 38
Silanização/end-capping
Si OH Si O Si (CH3)3
CH3
Si O Si O
Si (CH2)x R Cl Si CH3 Si (CH2)x R
+
Si O OH Si O O Si (CH3)3
CH3
Si OH Si O Si (CH3)3
Objetivo

Eliminar grupos silanóis remanescentes
Page ▪ 39
Fase normal:
- Fase polar + matriz apolar - retém analitos polares e
os apolares são eluídos.
- atração do grupo funcional polar do sorvente pelo

grupo polar do analito.
Page ▪ 40
Fase normal: polares
-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)
CN Si C N
Cianopropil
H O
NH2
Si NH H
Aminopropil
H O
OH Si O O H
Diol
OH H NH
Page ▪ 41
Fase reversa
- Fase apolar + matriz polar = retém analitos apolares e

os polares são eluídos.
- 90% de uso em análises de fármacos e Toxicantes.
- Deseja reter um analito apolar não dissociado num
meio aquoso.
- Separação por polaridade: atração do grupo funcional
apolar do sorvente pelo grupo apolar do analito.
Page ▪ 42
Efeito do pH:
100
Aumento= maior retenção Analito básico
de compostos básicos
Diminuição= maior K
retenção de compostos Analito ácido

ácidos
0
0 2 4 6 8 10 12 14 pH
Page ▪ 43
Fase reversa: apolares
-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
C8
Octila Si
PH
Fenila Si
Retenção dos analitos

apolares e, eluição com
solvente pouco polar.
Page ▪ 44
Fases especiais e mecanismos mistos:
- Fase mista contém parte da molécula apolar e

parte com radicais polares: usadas para reter
analitos polares e apolares.
- Pouco eficiente: retém muitos interferentes.
Page ▪ 45
3. Pareamento iônico
- Fase apolar + matriz polar - com analitos

iônicos. Adição de contra-íon neutraliza o
analito que é retido na fase apolar (=mecanismo
da fase reversa).
- Passagem de um íon e depois um contra íon.
Page ▪ 46
4. Troca iônica
Fase modificada com funcionalidade iônica; analito de
carga oposta à fase será retido.
Trocador aniônico: Retenção

+
de moléculas básicas.
-
Forte: Tetra alquilamôneo.
Fraco: Amina.
Matriz onde são ligados covalentemente Trocador catiônico: Retenção

grupos iônicos R, cuja carga é de moléculas ácidas.
neutralizada por um contra-íon Y:
Forte: Ácido sulfônico .
Fraco: Ácido carboxílico.
Page ▪ 47
Fatores que influenciam a SPE envolvendo troca iônica:
100
Efeito do pH: Analito ácido
K
Avaliar de acordo com
pKa.
Analito básico
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Page ▪ 48
Fatores que influenciam a SPE envolvendo troca iônica:
Força iônica:
Força iônica baixa é desejável na etapa de retenção e força
iônica elevada favorece a etapa de eluição.
Solvente
O analito para ser eluído tem que estar na forma neutra e,
se solubilizar no solvente (sugestão: água + solvente
orgânico míscivel).
✓ Fluxo do eluente: reduzido.
Page ▪ 49
Troca iônica – interações eletrostáticas
O
CBA C
Si O- +
Ácido NH3 R
carboxílico
SCX
Si
Ácido
benzenosulfônico SO3- +
NH3
SAX
Trimetil Si N+(CH3)3 -
SO3 R
aminopropil
Page ▪ 50
Natureza dos solventes x SPE [ ] no equilíbrio:
Se for usada a partição: K = Cext / Cres Cext = na fase sorvente

extratora
afinidade sorvente
K=f { afinidade matriz/ solvente de eluição
Cres = na amostra ou
solvente de eluição
Passagem da amostra Clean up Dessorção dos analitos
Sorção dos analitos Dessorção de interferentes Dessorção de analitos
K alto K baixo K baixo
Matriz com menor afinidade Solvente com maior Solvente com maior
pelos analitos do que o afinidade pelos afinidade pelos analitos de
Page ▪ 51 sorvente interferentes de que o que o sorvente
sorvente
5. Exclusão - Eliminar compostos indesejáveis
por mecanismos físicos – processo mecânico -
tamanho
Page ▪ 52
Seleção da fase sólida
Critérios importantes!!
Informações na literatura a respeito do analito e da

matriz

Definir o mecanismo (adsorção, partição, troca iônica)
Presença de impurezas inorgânicas (sais)


Problemas com troca iônica!!
Page ▪ 53
Analitos solúveis em solvente orgânico PM < 2000 Da
Analito solúvel Mecanismo Fase

em solvente... de separação estacionária
...polar (metanol, Partição/ Ciano (CN)

acetonitrila, Adsorção Diol (C2(OH)2)
acetato de etila) (fase normal) Amina (NH2)
Sílica (SiOH)
...moderadamente
Adsorção Florisil® (Mg2SiO3)
polar (clorofórmio)
Alumina (Al2O3)
Octadecil (C18)
...não polar Partição/ Octil (C8)
(hexano, heptano, Adsorção Ciclihexil (C6H12)
éter etílico) (fase reversa) Fenil (C6H6)
Page ▪ 54
Ciano (CN)
Analitos solúveis em solvente orgânico PM < 2000 Da
Mecanismo Fase
Analito
separação estacionária
Ciano (CN), Ácido
carboxilido
Catiônico Troca iônica (COOH), Ácido
sulfônico (C6H6-
SO3H)
Iônico Aminas (NH, NH2,
Aniônico Troca iônica
NH3)
Partição/ Ciano (CN), Diol
Polar Adsorção (C2(OH)2), Aminas
(fase normal) (NH, NH2, NH3)
Sílica (SiOH),
Moderadament
Adsorção Florisil® (Mg2SiO3)
e polar
Alumina (Al2O3)
Não
Octadecil (C18),
iônico
Partição/ Octil (C8),
Não polar Adsorção Ciclohexil (C6H12),
Page ▪ 55 (fase reversa) Fenil (C6H6), Ciano
(CN)
Analitos com PM > 2000 Da
Mecanismo
Analito solúvel em Fase estacionária
separação
Partição/ Butil (C4H9-) (poros

Solvente orgânico Adsorção grandes-WP-wide
(fase reversa) pore)
Ácido carboxílico
Catiônico Troca iônica
(-COOH) WP
Iônico Troca iônica Amina (NH)-WP

Aniônico
Exclusão por Sephadex® G-25
tamanho (gel)
Água
Partição/
Adsorção Butil (C4H9-)-WP
(fase reversa)
Não iônico
Exclusão por Sephadex® G-25
tamanho (gel)
Page ▪ 56
Fases duplas
Mistura de duas fases diferentes

Seletividades diferentes se comparada a
cada fase atuando individualmente
Misto Em camadas
 
Mistura das fases Colocadas no mesmo cartucho
em um cartucho sem misturar (duas camadas)
Em série

As duas fases são colocadas
em dois cartuchos em série
Page ▪ 57
Seleção do solvente
Critério de escolha: série eluotrópica

Polaridade relativa do solvente
o  valor eluotrópico em determinado material
O valor de o do solvente

Determina a força de eluição, em relação
ao sorvente
A força de eluição, força eluente ou força eluotrópica, (εº), de
um solvente é a medida da energia de adsorção do solvente
tomando como referência o sistema puro pentano-sílica, a qual se
atribui
Page ▪ 58
o valor zero.
Série eluotrópica
Solvente o Solvente o Solvente o
Metil etil
Acetato de etila 0,45 Clorofórmio 0,31 0,390
cetona
Acetona 0,43 Diclorometano 0,32 Pentano 0,00
Acetonitrila 0,50 Éter anidro 0,29 Piridina 0,55

Ácido acético > Éter t-butil
0,29 2-propanol 0,63
glacial 0,73 metílico
> Tetracloreto de
Água Hexano 0,00 0,14
0,73 carbono
Álcool Tetrahidrofura
0,54 N-hexano 0,00 0,35
isobutílico no
Benzeno 0,27 N-heptano 0,00 Tolueno 0,22
1,1, 2-tricloro-
Ciclohexano
Page ▪ 59 0,03 Metanol 0,73 0,02
trifluoretano
Valor eluotrópico de algumas misturas

de solventes
Solvente o
Metanol:acetonitrila
0,67
(40:60)
Metanol:diclorometano
0,63
(20:80)
Metanol:éter etílico
0,65
Page ▪ 60
(20:80)
Seleção do solvente
Partição/ Adsorção de compostos polares em sílica quimicamente
modificada
com grupos polares amino e ciano

Eluir com solvente de o alto!
Partição/ Adsorção de compostos apolares em fase sólida apolar

como sílica
modificada com C18, C8,..

Page ▪ 61
Eluir com solvente de  o baixo!
Fases sólidas especiais
- Aplicações específicas;
- Não estão disponíveis comercialmente;
- Preparação no próprio laboratório.
- Ex: MIPs, RAMs.
Page ▪ 62
Vantagens da SPE
☺ uso de pequeno volume de solvente;
☺ pouco manuseio da amostra;
☺ ausência de emulsão;
☺ facilidade na automação;
☺ baixo consumo de vidrarias;
☺ menor tempo de análise;
☺ menor custo de mão de obra.
Page ▪ 63
Desvantagens da SPE
 maior dificuldade para otimizar seu uso
(desenvolvimento do método);
 precisão?;
 várias etapas e maior tempo requerido;
 maior custo por amostra.

Page ▪ 64

Aula 3 - SPE

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Preparo de amostras para análise

Forma mais comum:

CARTUCHO PARA SPE: seringa de polipropileno ou de vidro,

Escolha do cartucho depende:

Mais usados: volume pequeno 200 mg (1,2 mL amostra);

Configurações para o uso de cartuchos

Discos: formato alternativo em relação ao

Processo de extração – discos

2. Membrana carregada com partículas maiores, de 50 µm,

3. Partículas de sorvente de diâmetros entre 10-30 m

Matriz Quantidade Disco empregado

- Ausência de canais formados pelo material de

Variedade relativamente pequena de sorventes e mais caros

Exemplo: resíduos de praguicidas em alimentos.

Exemplo: poluentes em água.

Obs: não é um processo excludente ao anterior.

Exemplo: análise de água de rio localizado a grande

Sorvente é tratado com solução similar (em polaridade,

Natureza do solvente: depende da matriz e do sorvente [sílica e

Os analitos são retidos seletivamente e os interferentes são

- ajustes de pH e da força iônica pode ser feito;

É comum o uso do composição

- deve possibilitar dessorção completa

• Analito deve ter algum tipo de afinidade pelo

• Deve haver tempo suficiente de contato

• Interferentes da amostra devem ser seletivamente

• Analitos devem ser capazes de ser eficientemente

1. Adsorção: material sólido que não apresenta

Adsorventes mais empregados:

• Silica gel: (SiO2)n-OH

Diferença entre Absorção e Adsorção

Silica gel: (SiO2)n-OH

Silica gel: (SiO2)n-OH

• Superfície básica - Retenção compostos ácidos.

• Mais polar de todos - Adsorção irreversível.

2. Partição: comportamento similar a de um

R = -OH, -CN, -NH2.... R = C18, C8, C2 ....

Interações indesejáveis com os grupos silanóis livres.

- atração do grupo funcional polar do sorvente pelo

- Fase apolar + matriz polar = retém analitos apolares e

Aumento= maior retenção Analito básico

retenção de compostos Analito ácido

Retenção dos analitos

Fases especiais e mecanismos mistos:

- Fase mista contém parte da molécula apolar e

- Pouco eficiente: retém muitos interferentes.

- Fase apolar + matriz polar - com analitos

- Passagem de um íon e depois um contra íon.

Trocador aniônico: Retenção

Matriz onde são ligados covalentemente Trocador catiônico: Retenção

Efeito do pH: Analito ácido

Se for usada a partição: K = Cext / Cres Cext = na fase sorvente

Passagem da amostra Clean up Dessorção dos analitos

Sorção dos analitos Dessorção de interferentes Dessorção de analitos

K alto K baixo K baixo

Informações na literatura a respeito do analito e da

Presença de impurezas inorgânicas (sais)

Analito solúvel Mecanismo Fase

...polar (metanol, Partição/ Ciano (CN)

Partição/ Butil (C4H9-) (poros

Iônico Troca iônica Amina (NH)-WP

o  valor eluotrópico em determinado material

Acetonitrila 0,50 Éter anidro 0,29 Piridina 0,55

Valor eluotrópico de algumas misturas