Cariotipo molecular y longitud cromosoma polimorfismo en Cochliobolus sativus

Los hongos son conocidos por tener genomas variables que pueden generar nuevos tipos de
virulencia capaces de atacar importantes plantas de cultivo. Para evaluar los polimorfismos de
longitud de los cromosomas en el patógeno tizón foliar de la cebada (Cochliobolus sativus), se
analizaron los cariotipos de 16 aislamientos utilizando electroforesis contorno de apriete de
campo eléctrico homogéneo (CHEF). La colección de las cepas estudiadas eran de diversas
regiones del mundo (Estados Unidos, Canadá, Japón, Brasil, Uruguay y Polonia) e incluyó a
representantes que comprenden los tres conocidos patotipos de C. sativus 0,1 y 2. Bajo dos
condiciones de funcionamiento diferentes, el número de bandas CHEF observados varió de 8 a 13
con un intervalo de tamaño de 0,85 a 3,80 megabytes (MB). Cada una de las 16 cepas mostraron
un patrón de bandas único, a excepción de dos de Dakota del Norte aislados ND90Pr y ND91-
Bowman, que eran muy similares. Las sondas de ADN de una sola copia, previamente asignados a
cada uno de los 15 cromosomas identificados en referencia aíslan ND93-1, se hibridaron a
transferencias Southern de los cromosomas separados-CHEF y reveló cromosomas altamente
polimórficos entre los aislados. Reordenamientos cromosómicos (translocaciones, deleciones,
duplicaciones) fueron encontrados en varios aislamientos. Marcadores de ADN que anteriormente
se encontraban vinculados a VHv1, un gen en aislamientos de patotipo 2 que confiere virulencia
de cultivar cebada Bowman, también se utilizaron como sondas en hibridaciones con las manchas
de CHEF. Los resultados mostraron que el cromosoma que lleva el gen de virulencia en patotipo 2
aislados es más grande que su homólogo sin el gen en otros aislados. Esto sugiere que la región
genómica que lleva el locus de virulencia VKv1 es única para patotipo 2 aislados. Este estudio
proporciona información útil sobre la estructura del genoma y la divergencia, que es esencial para
avanzar en nuestra comprensión de la biología y la genética de C. sativus

INTRODUCCION

La mayoría de los hongos tienen cromosomas muy pequeños, que son difíciles de distinguir de
forma clara y que se caracteriza por cariotipo clásica usando microscopía de luz. El desarrollo de la
electroforesis de campo pulsado en gel fue un avance importante en la determinación del
cariotipo de hongos, ya que hizo posible la separación de cromosomas de moléculas de ADN

Esta técnica se ha utilizado para estudiar los cariotipos de un número de especies de hongos con el
número de cromosomas que van de cuatro a dieciocho y tamaños desde 0,2 a 12,0 pares de
megabases. Al resolver los ADN del cromosoma de tamaño de hongos en geles de agarosa, se
puede obtener una estimación del número de cromosomas en el genoma y asignar los genes diana
y los grupos de ligamiento genético de fragmentos específicos del cromosoma de tamaño
mediante hibridación de Southern. Cariotipo electroforético también proporciona un poderoso
medio por el cual los polimorfismos de longitud en el cromosoma hongos pueden ser estudiados

Cochiabolus sativus ( anamorfo : sorokiniana bipolaris ) es un hongo haploide ascomycetous que

causa el tizón foliar , pudrición o descomposicion de la raíz común , y el punto negro en la cebada
y el trigo. ( Mathre 1997 Wiese 1977) . En la región del Medio Oeste de los EE.UU. , tizón foliar fue
una de las enfermedades más importantes de la cebada . A menudo causando graves reducciones
de rendimiento y calidad de grano durante los años de epidemia . A pesar de que la enfermedad
ha sido controlada en la cebada de seis enfilados desde hace más de cuatro décadas por el uso de
la resistencia del huésped (Steffenson et al 1996), sigue siendo un problema cultivar en dos
enfilado de cebada debido a su menor resistencia general y la vulnerabilidad a la nueva tipos de
virulencia (por ejemplo patotipo 2 ) en el patógeno ( Fetch y Steffenson 1994 ) . Uno de nuestros
objetivos a largo plazo es entender la base genética de la variación en C. sativus, especialmente
para la virulencia de cebada . La comprensión de los mecanismos de la variación genética en el
patógeno es esencial para el desarrollo de medidas eficaces de control de la enfermedad. Estudios
anteriores, la variación de la virulencia en C. sativus se caracterizó por las pruebas de aislamientos
en un conjunto anfitrión diferencial que consiste en líneas de cebada NDB112 Bowman, y ND5883
(Fetch y Steffenson 1995 Valjavec-Graciano y Steffenson 1997a). Tres patotipos (designados 0, 1,
2) fueron identificados entre los aislados recogidos de Dakota del Norte y otras regiones del
mundo (Valjavec-Graciano y Steffenson 1997a). Evaluación molecular de la variación genética
también se han estudiado en este hongo. El análisis de marcadores AFLP en 58 C. sativus los
aislamientos de Dakota del Norte y otras regiones del mundo revelan un alto nivel de variación
genética en el hongo (Zhong y Steffenson 2001). Los análisis de chef y los telómeros se realizaron
en dos aislamientos de Dakota del Norte (ND93-1 y ND90Pr) que muestran baja y alta virulencia,
respectivamente, en la proa de la cebada, y se resolvieron 15 cromosomas (Zhong et al., 2002 ).
Mediante la comparación de los cariotipos electroforéticos de los dos aislados, se observó un alto
nivel de polimorfismo cromosomico, y unos pocos translocaciones cromosómicas y supresiones de
ADN fueron documentadas. Además, se encontró que el cromosoma que lleva el locus para la
virulencia en Bowman en aislado ND90Pr es de aproximadamente 600 KB más grande que su
cromosoma homólogo sin el locus virulencia en aislado ND93-1, Aparte de este trabajo inicial,
estudios completos sobre los polimorfismos cromosómicos entre diferentes campo aislados de los
hongos no han sido completadas. Por lo tanto, el objetivo del estudio fue determinar el grado de
polimorfismo cromosómico en 16 cepas de C. sativus recogidas en diferentes regiones del mundo.

MATERIALES Y METODOS

Aislamientos fúngicos

Dieciséis aislamientos de C. sativus se utilizaron en este estudio. El año de recogida, el origen del
hospedador, origen geográfico, y patotipo de estas cepas se enumeran en la tabla 1. Los aislados
ND93-1 y ND90Pr son los padres de una cruz usada anteriormente para los estudios de mapeo
genético y molecular de C. sativus. Sus cariotipos completos se resolvieron basandosen en el
análisis de los telómeros CHEF y en un estudio anterior. Todos los cultivos en este estudio se
conservan en la colección del Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Minnesota,
St. Paul, MN.

Cariotipo electroforético

Preparación de protoplastos de C. sativus se llevó a cabo como se describió previamente. ADNs

tamaño de los cromosomas se separaron en tampón TAE 1x a 14 ° C con un sistema de contorno
de apriete del campo eléctrico homogeneo (CHEF). Se utilizaron dos condiciones de
funcionamiento diferentes. Para resolver bandas inferiores moleculares cromosómicas peso, la
tensión, el tiempo de conmutación, y el tiempo de funcionamiento fueron de 3,0 V / cm, 480 a 600
seg, y 96 horas, respectivamente. Para resolver bandas de mayor peso molecular de cromosomas
(2,5-4,0 MBP), una tensión y cambiar el tiempo de 2,0 V / cm y 1200- 960 seg, respectivamente,
fue empleado durante 24 horas, seguido de 2,5 V / cm y 960 a 480 seg para 96 horas. Bandas
cromosómicas separadas se tiñeron con SYBR Gold mancha de gel de ácido nucleico (Molecular
Probes, Eugene, OR). Una banda de ADN. Estas bandas de ADN podrían contener uno, dos, o más
cromosomas co-migración.

Hibridación del sur

Clones de ADN previamente asignadas a los quince cromosomas de Cochliobolus sativus aislado
ND 93-1 y ND90Pr fueron seleccionados para la hibridación con las manchas de CHEF. Cada clon se
marcó con dCTP (32p) mediante cebado aleatorio utilizando el kit High Prime DNA Labeling. La
hibridación se realizó durante la noche a 65 ° C en tampón de hibridación (fosfato de sodio 500
mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, 7,0% de SDS, 1% de BSA) que contiene la sonda marcada. Después de la
hibridación, se realizaron tres lavados. El primer lavado fue a 65 ° C con 2 x SSC / SDS al 1%
durante 10 minutos. El segundo lavado fue a 65 ° C con 1 x SSC / 0,5% de SDS durante 10 min, y el
lavado final se realizó a 65 ° C con 0,5 x SSC / 0,25% de SDS durante 60 min. Entonces, la
membrana de filtro se expuso a película de rayos X a -80 ° C durante 2-7 d dependiendo de la
intensidad de la radiactividad. Los filtros fueron despojados con 0,1% de SDS en agua a 95 ° C
durante 2 min antes de que se utilizaron para reprobing con un clon de ADN diferente.

RESULTADOS

Análisis de cariotipo electroforético

Dos condiciones de funcionamiento se utilizan para separar los cromosomas de los 16 aislamientos
de Cochliobolus sativus. En las mismas condiciones electroforéticas, los patrones de bandas fueron
altamente reproducible por las mismas cepas, pero diferían drásticamente entre los diferentes
aislamientos. Cuando se utilizaron las condiciones para la separación de los cromosomas de alto
peso molecular, se observaron tres y cuatro bandas de cromosomas de tamaño más grande que
2.7Mbp respectivamente en aislamientos de Dakota del Norte ND93-1 y ND90Pr (Fig 1A). En las
condiciones de funcionamiento para bandas de peso molecular más bajo (1,0 a 2,5 MBP), se
observaron cinco y cuatro bandas cromosómicas más pequeño que 2,7 Mbp respectivamente en
aislamientos ND93-1 y ND90Pr (Fig 1B). las dos bandas de peso molecular más bajos de ND90Pr
podrían resolverse además a cuatro bandas cuando el gel se tiñó un poco más ligero y observados
directamente bajo un transiluminador UV (datos no mostrados). La combinación de los resultados
de ambas condiciones CHEF, 8 y 10 bandas cromosómicas se resolvieron respectivamente para
aislamientos ND93-1 y ND90Pr.

Figura 1- Cariotipo electroforético de 16 aislamientos Cochliobolus sativus. A. bandas

cromosómicas resueltos por las condiciones de funcionamiento para la separación de los
cromosomas de alto peso molecular y B. bandas cromosómicas resueltos por funcionamiento de
las condiciones de separación de los cromosomas de bajo peso molecular. Los aislamientos se
indican por encima de sus correspondientes carriles. Cromosoma de wingei Hansenula y
Schizosaccharomyces pombe se utilizaron como estándares de tamaño.

Para los otros aislamientos de campo, tres (por ejemplo ND89-33) a seis (por ejemplo VA98-1) de
las bandas de peso molecular más alto (> 2.7Mbp) se resolvieron bien en las condiciones para la
separación de los cromosomas de alto peso molecular, y sus tamaños eran bastante variable en
función de las posiciones de migración (Fig 1A). En las condiciones para la separación de los
cromosomas de bajo peso molecular, la mayoría de los cromosomas en la parte inferior del gel
(1.0 a 3.0 Mbp) fueron separadas, aunque el cromosoma de mayor peso molecular (>3.0Mbp) a
menudo co-migrar juntos (Fig 1B). Sobre la base de las dos condiciones CHEF, el número de
bandas cromosómicas resuelto osciló 9-13 para estos aislamientos de campo. En cada aislado,
hubo algunas bandas con mayor intensidad de tinción. Esto puede ser indicativo de la co-
migración de más de un cromosoma. Aunque se intentaron varias otras condiciones
Funcionamiento del cocinero, no hay bandas cromosómicas adicionales se resolvieron para estos
aislados (datos no mostrados). Fig 2 Diagramas de las bandas cromosómicas resueltos de cada
aislamiento basan en las dos condiciones Funcionamiento del cocinero y también las sondas
específicas del cromosoma que se hibridaron con ellos (ver abajo).

Análisis de hibridación Southern

En un estudio previo, hemos desarrollado un mapa genético molecular del Cochliobolus sativus
cruzando ND90Pr x ND93-1 y marcadores de ADN asignado a cada uno de los 15 cromosomas
resueltos en las cepas parentales (Zhong et al. 2002). Para identificar los cromosomas homólogos
en diferentes aislamientos de campo, se seleccionaron los marcadores de una sola copia de cada
cromosoma de la cepa ND93-1 (seleccionado como la cepa de referencia de C. sativus) como
sondas para la hibridación con las manchas CHEF del ADN cromosómico separado. Como se
muestra en la figura 3A y la figura 3B y resumen en la Tabla 3Se observó cromosoma polimorfismo
con un alto nivel de longitud. Cada cromosoma exhibido tiene varias diferencias de rango de
tamaño. Cuatro cromosomas (3,4,6,7) exhibió una diferencia de más de 1,0 Mbp entre los
homólogos de menor y mayor de los aislados analizados (Tabla 3).

Dos o tres marcadores se utilizaron para seis cromosomas (1,3,4,6,8,10) (Tabla 2), y por lo tanto
translocaciones cromosómicas podrían ser identificados en base a sus patrones de hibridación.
Cuando los marcadores situados en el mismo cromosoma en el aislamiento ND 93-1 (aislado de
referencia) se separan en diferentes bandas cromosómicas en otro aislado, es sugerente de una
translocación cromosómica. Cuatro de los seis cromosomas analizados estaban involucrados en
reordenamientos cromosómicos. En los aislamientos ND90Pr, ND92-11, ND91-Bowman, y ND92-
10, los dos marcadores (G311 y B91) localizados en el cromosoma 3 en aislamiento ND93-1 se
separaron en dos bandas diferentes (Figura 2), lo que sugiere que translocaciones cromosómicas
se produjeron en estas cepas. Los desplazamientos que se produjeron en el cromosoma 4 de los
aislados ND90Pr y ND91-Bowman porque marcadores B405 y B71, localizado en el cromosoma 4
de la referencia aislamiento ND93-1, se separaron en dos bandas diferentes en estos dos
aislamientos. El cromosoma 6 de los aislados ND90Pr, ND92-11, ND91-Bowman, Dakota del Norte
89 a 33, y ND92-10 también estuvo implicado en una translocación cromosómica basado en el
patrón de hibridación con sondas B285 y B125. Para el cromosoma 10, una translocación
cromosómica se encontró en EL aislamiento ND95-31.

When clone G300 (code q) was used for hybridization, no se observaron señales de hibridación en
el aislamiento JPN 95-1, URY98-Gamba54, y ND89-33, lo que indica que este fragmento de ADN no
se encuentra en estas cepas. El B125 sonda (código k) mostró hibridación con dos bandas
cromosómicas en todos los aislados excepto por ND92-8 y Brier, lo que sugiere que una de las
copias es ausente en estos dos aislamientos. En contraste, las sondas B257 (código u) y G235
(código v) se hibridaron con dos bandas cromosómicas en aislamientos JPN95-1, Brier, ND89-33, y
BRZ97-PF3 y el aislamiento URY 89-Gamba 18, respectivamente, donde ya que hibridaron con sólo
un cromosoma en los otros aislamientos analizados. Este resultado indica que los duplicados
podrían haber ocurrido por estos fragmentos de ADN en algunos aislamientos del hongo

Seis patotipos 2 aislamientos fueron analizados en este estudio, y todos llevan el gen VHv1 para la
virulencia al cultivar Bowman. Utilizando el VHv1 marcadores AFLP ligados a E-AG/M-CA-207 y el
gen CSMAT tipo de apareamiento (asociado con VHv1 en el cromosoma 8 del aislamiento ND90Pr)
como sondas para la hibridación con las manchas CHEF, hemos sido capaces de identificar los
cromosomas homólogos con o sin el lugar VHv1 en todos los aislamientos estudiados. Se encontró
que el cromosoma más pequeño que lleva VHv1 estaba cerca de 2.4Mbp (en el aislamiento ND 93-
12) y el más grande era de 2,8 Mbps (en aislamientos ND90Pr y ND91-Bowman). Aunque el
cromosoma que lleva vhv1 fue muy variable en tamaño entre los 2 patotipos diferentes aislados,
era siempre mayor que su homologo sin VHv1 en otros patotipos aislados.

Fig. 2 El diagrama electroforético de los 16 cariotipos de Cochliobolus sativus son aislados y

localizados del ADN con marcas en la bandas de los cromosomas un CHEF- separado de la banda
de ADN puede contener uno o más cromosomas. Las pruebas de mapeo (ver la lista en la tabla
2). Son indicadas por letras que representan cromosomas. La aislación indica su correspondiente
cariotipo. Las bandas de cromosomas no mapeadas no se le asignan unidades que indican que
no hay seña de hibridación y se asigna a una de las pruebas utilizadas.

DISCUSION

En este estudio, hemos descubierto los 16 cariotipos de Cochliobolus sativus aislándolos mediante
el CHEF electroforesis combinándolos con la hibridación de cromosomas específicos. Se
encontraron que cada aislación muestra un único cariotipo, excepto la aislación de ND90Pr y
ND92-Bowman, que eran similares en su cariotipo y su hibridación con las pruebas de ADN la
mayoría de las cepas se obtuvieron de Dakota del norte, pero algunas eran de diversas regiones
del mundo donde se produce la mancha de la cebada. La singularidad del cariotipo en cada
aislación surge la divergencia significativa que se ha producido en la población de hongos. Aunque
ND9OPr y ND)”- Bowman se obtuvieron de los sitios en Dakota del Norte que son cercanos a 300
kilómetros de distancia, todavía se pueden derivar del mismo linaje, porque el patógeno puede
difundirse fácilmente en la semilla infectada. Sus cariotipos electroforéticos similares fueron
consistentes con el análisis AFLP (Zhong y Steffenson 2001), que agrupan los dos aislados en el
mismo grupo AFLP.

Los análisis de cariotipos y las hibridaciones de ADN a las manchas de CHEF reveló un gran
polimorfismo de longitud de los cromosomas entre los cromosomas homólogos de C. sativus, que
podrían haber sido causados por translocaciones cromosómicas y otros cambios cromosomales.
Cuatro de los seis cromosomas analizados con dos a tres marcas señaladas mostraron
translocaciones según lo revelado por su hibridación con sólo un cromosoma en referencia del
islote frente a dos cromosomas en otros islotes. El número de cromosomas implicados en la
translocación fue probablemente subestimada porque no estábamos en condiciones de
determinar los cambios de los cromosomas para los que se hibridó sólo un marcador. El uso de
marcadores adicionales para cada cromosoma probablemente revela cambios estructurales
cromosómicos. Además de las translocaciones, supresiones y duplicaciones cromosómicas
también pueden haber contribuido a la variación observada en el cariotipo de este hongo. La
evidencia de las supresiones se basa en el hallazgo de que varias exploraciones con un solo
ejemplar en algunos islotes no mostraron ninguna hibridación con las manchas de CHEF de los
cromosomas en otros islotes. Las duplicaciones eran sospechosas en los casos en que dos
exploraciones de una sola copia mostraron hibridación con dos cromosomas en varios islotes y
sólo un cromosoma en otros islotes.

Figura 3 – La hibridación de la exploración del ADN en CHEF- separación del ADN cromosómico
ejecuta clones. El ADN indican en el lado derecho de las manchas CHEF condiciones A (A) y B (B).
Las mismas manchas CHEF estaban antes de la reutilización con una exploración diferente. Los
autorads con señales de hibridación de dos exploraciones eran de dos experimentos diferentes
sin un tratamiento de arrastre de los cromosomas que portan el gen de virulencia VHv1 en siete
aislamientos (ND "Pr, ND92-11, ND92-8, ND91-Bowman, ND92-10, ND93- 12, y ND95-31) se
indican con una flecha. El cromosoma ThBe hibridó con el gen OEMAT y el marcador AFLP e-AG /
M-CA-207, que WAG previamente muestra que se asocia con WVL (Thong y Steffenson 2002).
Los cromosomas homólogos sin el gen de virulencia en otros islotes solamente hibridan con el
gen CSMAT.

En los hongos cuyos cariotipos se han estudiado, polimorfismos de longitud del cromosoma
causados por translocaciones cromosómicas, por eventos de supresión / inserción / duplicación,
los cambios en las secuencias del ADN repetitivas, y cromosomas prescindibles han sido bien
documentados (Fierxo & Martin 1999; Kim et al 1998; Kistler y Miao 1992; Orbach et al 2000:
Zolan 1995).. En Fusarium oxysporum y Magnapothe grisea, se identificaron numerosas familias de
elementos de transposición (TES) (Davière et al 2001; Nitta et al., 1997) y los implicados como
factores principales que causan la inestabilidad cariotípica. Un alto nivel de polimorfismo en la
longitud del cromosoma de algunos cromosomas correlacionados en altas densidades de TES
(Davière et al. 2001), y la ocurrencia de reordenaciones cromosómicas se asocian con frecuencia a
la agrupación de los TES en los cromosomas (Hua-Van et al 2000; Nitta ct al, 1997; Panaccione et
al., 1996). Estos hallazgos sugieren que probablemente el resultado de la recombinación ectópica
entre TES dispersos por todo el genoma. En C. sativus, la información sobre TES es careciente; Sin
embargo, se informó de secuencias de tipo transposón en el locus de la TOX2 relacionada al hongo
C. carbonum (Panaccione et al., 1996). Los estudios futuros deben explorar la cuestión de si TES
están presentes en C. sativus y si juegan un papel importante en la inducción de variación
cariotípica en el hongo.

Kistler y Miao (1992) propusieron que la reproducción asexual en poblaciones de hongos

mostraría un nivel más alto de variación del cromosoma, mientras que la población de
reproducción sexual mostraría un menor grado de polimorfismo. La primera situación se ha
observado en varios Fusarium asexuales (Fekete et al 1993; Boehm et al 1994;. Alves-Santos et al
1999). Esta última situación se ha observado en los grupos de compatibilidad heterocarión de
Aspergillus nidulans (Geiser et al. 1994) y las poblaciones de apareamiento de Gibberella fuJlkuroi
(Xu et al. 1995). Aunque la fase sexual de C. sativus puede ser inducida en cultivo, no se ha
encontrado en el campo el hecho de que un muy alto nivel de polimorfismo cromosomal existe en
C sativus, parece apoyar la hipótesis de Kistler y Miao (1992) que la reproducción asexual
predomina en el hongo.

Los seis patotípicos, de 2 islotes tienen un cromosoma que lleva el gen de virulencia VHv1 según lo
revelado por la hibridación con el marcador de ADN ligada al VHv1. Este cromosoma es mayor que
su contraparte homóloga en otros islotes patotípicos que no llevan el gen de virulencia. Este
resultado es una confirmación adicional de que no es única de ADN genómico 'extra' en patotipo
de 2 islotes, que está asociado con la virulencia de cebada al cultivar Bowman (Thong et al. 2002).
Es muy común que los cromosomas que llevan genes de virulencia son únicos en aislamientos
patógenos en comparación con las de cepas no patógenas, en especial en hongos patógenos cuya
patogenicidad depende de la producción de una toxina selectiva host (HST). En C. heterostrophus,
alrededor de 1,2 Mbps de ADN extra se encontró alrededor del locus TOXI la síntesis de toxinas en
la carrera-T los islotes que estaban ausentes en la carrera-O (productor no de toxina) (Kodama et
al., 1999). En C. carbonum, más de 540 kb de ADN que lleva el locus TOX2 para la toxina está
ausente en cepas no productoras de toxinas (Ahn y Walton 1996). Los genes para HSTs de C.
carbonum se agrupan juntos en el genoma y se han planteado la hipótesis de que se derivan de
otros microorganismos por transferencia horizontal de genes, ya que están presentes sólo en
algunos islotes de una especie y son completamente ausente de los demás (Walton 2000). Lichter
et al. (2002) en comparación a los trigo patógenos y no patógenos aislados de Pyrenophora tritici-
repentis por análisis de cariotipo combinado con hibridación de Southern. Ellos encontraron que la
ToxA gen de la toxina se encuentra en un cromosoma de las cepas patógenas que es mayor que su
contraparte sin ToxA en cepas no patógenas, aunque la mayor parte del contenido genético del
cromosoma es compartida por ambos aislamientos patógenos y no patógenos. Además, muchos
componentes únicos y repetitivos genéticos contribuyen a las diferencias encontradas entre los
aislamientos patógenos y no patógenos en todo el genoma.

HSTs se han sugerido para participar en la capacidad de C. sativus que causan enfermedades en
diversos huéspedes basado en los síntomas típicos de la mancha de punto de necrosis y clorosis
(Pringle 1976); sin embargo, ninguno ha sido aislado y caracterizado de manera inequívoca al
hongo. Los experimentos preliminares con fluido de lavado intracelular del patotipo-2 las hojas de
cebada infectados revelaron una supuesta HST producida por el hongo (L. M. Ciuffetti y J. P.
Martínez, com. pers.). Es posible que el locus para la HST en C. sativus es también un complejo
como se encuentra en C. heterostrophus (Kodama et al. 1999) y C. carbonum (Ahn y Walton 1996).
Hemos construido recientemente bibliotecas Fosmid para aislamientos de ND90Pr (con VHv1) y
ND93-1 (sin VHv1) (datos no publ.). La proyección de estas bibliotecas Fosmid facilitará la
caracterización de la región genómica única de VHv1 en el islote patógeno y, finalmente, el
aislamiento del gen de virulencia o grupo de genes.