Marcadores Moleculares

Los marcadores moleculares han sido definidos como cualquier diferencia notípica
controlada genéticamente. Se puede considerar que cualquier molécula, orgánica o
inorgánica, que sea característica de un organismo o proceso sea un marcador. Los
marcadores idóneos son los de ADN, siendo válido cualquier fragmento que se encuentre
muy cerca del gen o de la secuencia de interés y que lógicamente no afecte al carácter en
estudio (SIDTA, 1999). Para Valadez y Kahl (2000) un marcador se refiere a cualquier
molécula de proteína, ARN o ADN de tamaño o peso molecular conocido que sirve para
monitorear o calibrar la separación de las mismas utilizando electroforesis o
cromatografía, y un marcador genético como cualquier gen cuya expresión permite un
efecto fenotípico que puede ser detectado fácilmente (por ejemplo, un gen que ocasiona
resistencia para algún antibiótico).

Los marcadores del ADN se basan fundamentalmente en el análisis de las diferencias en

pequeñas secuencias del ADN entre individuos. Las técnicas empleadas para ello son muy
diversas y dan el nombre a los distintos tipos de marcadores, los cuales pueden ser de
carácter dominante o codominante (Karp y Edwards 1998).

Algunos ejemplos de ellos son: Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de

restricción (RFLP), Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), Polimorfismo en
la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), Microsatélites o Secuencias simples
repetidas (SSR), Amplificación aleatoria del polimorfismo de microsatélites (RAMPO) etc.
(Rallo et al. 2002).

1. Fenotípicos – Bioquímicos:
1.1. Isoenzimas:
Las Isoenzimas, o aloenzimas, son las proteínas más ampliamente usadas como
marcadores moleculares y estas fueron los primeros marcadores moleculares
usados en genética de plantas (Tanksley et al. 1981). Las Isoenzimas son variantes
de una misma enzima (son formas funcionalmente similares de enzimas), que
comparten un sustrato en común, pero difieren en su movilidad electroforética.
Incluyen todos los polímeros de subunidades producidos por diferentes loci o por
alelos diferentes en el mismo locus. Diferentes individuos en una población pueden
tener diferentes formas moleculares de la misma proteína. Esa variabilidad en
cuanto a la estructura de las proteínas es producida por factores genéticos o
epigenéticos.
 Su análisis se realiza extrayendo la enzima de los tejidos de la planta, tras lo cual,
las variantes son separadas con electroforesis y visualizadas mediante la tinción del
gel con colorantes específicos (Powell 1992; Haines 1994). Entre las variantes
enzimáticas frecuentemente empleadas se mencionan; malato deshidrogenasa,
fosfoglucomatasa, glutamato oxaloacetato transmitasa, shikimato deshidrogenasa
y peroxidasas (Jarret y Litz 1986). No obstante, Tanksley (1993) menciona que el
uso de las isoenzimas ha estado muy limitado por el escaso número de colorantes
enzimáticos disponibles y por la imposibilidad de contar con suficientes marcadores
para cubrir todo un genoma.
Forrest (1994) menciona que las isoenzimas han probado ser de gran valor en
estudios de mejoramiento tanto en poblaciones naturales como en plantaciones de
árboles y mantienen cierto valor de utilidad, especialmente en estudios a gran
escala de estructura poblacional y en relación con la resistencia a plagas y
enfermedades. Por ejemplo, González-Pérez et al. (2004) realizaron un estudio
sobre la estructura poblacional de las palmeras Phoenix canariensis y P. dactylifera
en Islas Canarias, España. También, Jarret y Litz (1986) utilizaron los sistemas
isoenzimáticos como marcadores para discriminar entre varios clones de bananos
y plátanos.
2. Genotípicos:
2.1. RFLPs
El análisis RFLP es una técnica usada en los programas de investigación desde los
años 1970. Inicialmente fue empleada para el mapeo físico de los adenovirus
(Grodzicker et al. 1974) y en la construcción de un mapa genético de ligamiento
para humanos (Botstein et al. 1980). Paterson (1996) menciona que a partir de
ambas publicaciones, especialmente la de Botstein et al. (1980), se presentan los
principios básicos que sustentan el uso de “Marcadores Moleculares” y que
representan el fundamento de los posteriores análisis genético - molecular en
plantas y animales. Valadez y Kahl (2000) definen los RFLPs como la variación en la
longitud de los fragmentos de ADN producida por una endonucleasa de restricción
específica a partir de ADNs genómicos de dos o más individuos de una especie. Los
RFLPs se generan por rearreglos o mutaciones que dan lugar a la creación o deleción
de sitios de reconocimiento para las endonucleasas específicas. Estas variaciones
también pueden deberse a la presencia de ADN repetido con diferente cantidad de
copias sobre una región cromosómica específica (por ejemplo, número variable de
repeticiones en serie).
El concepto principal fue que la mutación en el sitio de restricción, o la mutación
que altera la distancia entre los sitios adyacentes de restricción podría ser
visualizada como “Marcadores de ADN”. Para realizar el análisis se necesitan las
“enzimas de restricción”. Paterson (1996) menciona que éstas actúan como “tijeras
moleculares” altamente específicas. Estas enzimas reconocen y cortan el ADN en
sitios específicos. La alta especificidad para reconocer secuencias es la base para la
mayoría de estrategias de clonaje del ADN. La gran mayoría de las enzimas de
restricción utilizadas en el clonaje molecular reconocen secuencias de cuatro, cinco
ó seis nucleótidos de longitud.
Después de la publicación de Botstein et al. en 1980 los RFLPs han sido ampliamente
usados en plantas con diferentes objetivos: caracterización de germoplasma,
estudios filogenéticos, pureza de semillas híbridas, selección y/o localización de
genes específicos (mediante análisis de ligamiento) de características agronómicas
importantes, etc. (Phillips et al. 1995; Valadez y Kahl 2000). Los marcadores RFLP se
comportan como marcadores codominantes, en tanto que los marcadores
morfológicos y los marcadores basados en PCR, poseen alelos que interactúan de
manera dominante/recesiva. Además, el nivel de variación alélica de los
marcadores RFLP en poblaciones naturales de plantas es mayor que con los
marcadores morfológicos (Helentjaris et al. 1985). Los pasos generales para el
análisis RFLP son los siguientes:
Paso 1. Aislamiento del ADN.
Paso 2. El ADN se digiere con endonucleasas de restricción, que cortan el ADN en
puntos que poseen una secuencia particular de reconocimiento.
Paso 3. Los fragmentos son separados con base en su tamaño usando electroforesis
en gel de agarosa.
Paso 4. Luego se aplica la técnica denominada “Southern Transfer” (Transferencia
de ADN), la cual involucra la transferencia del patrón de fragmentos de
electroforesis, a un soporte sólido y manipulable, por ejemplo a una membrana de
“nylon”.
Paso 5. Luego de la transferencia, la membrana se expone a una sonda marcada,
que posee una secuencia homóloga a uno o más fragmentos o a parte de estos, de
tal manera que se produce la hibridación del ADN.
Paso 6 y 7. La técnica general para producir la sonda marcada se conoce como “Nick
Traslation” y se basa en la remoción en la sonda, de pequeños grupos de
nucleótidos (aproximadamente 10) con una exonucleasa. Mediante la acción de la
enzima ADN polimerasa I, la cadena se resintetiza a través de la reincorporación de
nucleótidos marcados radioactivamente o por medio de otras técnicas.
Paso 8. La detección de las bandas de hibridación se realiza por luminiscencia
(Phillips et al. 1995). Uno de los pasos del análisis RFLP incluye un procedimiento
de electroforesis. En general, la electroforesis es una técnica comúnmente
empleada para la separación, identificación y purificación de moléculas de ácidos
nucléicos. Se basa en el hecho de que las moléculas de los ácidos nucleicos están
cargadas negativamente y migran hacia el ánodo en un campo eléctrico. La
electroforesis del ADN usualmente se realiza en una matriz de agarosa o
poliacrilamida, inmersa en un buffer salino que permita el establecimiento de un
campo eléctrico (Paterson 1996). Según Paterson (1996) el costo, la complejidad
técnica y la gran cantidad de ADN que se requiere pueden ser limitantes para el
empleo de los RFLP como técnica de diagnóstico. Bernatzky (1988) menciona como
otra limitante, que en algunos casos, aunque la variación interespecífica es alta, los
individuos de una población o los cultivares de una especie muestran una variación
baja, lo cual reduce las posibilidades de encontrar polimorfismos útiles. Aunque
esto puede ser solucionado usando enzimas que corten el ADN más
frecuentemente, o simplemente, evaluando una mayor variedad de enzimas.
Para Paterson (1996), las limitaciones de los marcadores RFLP mencionadas
condujeron a la implementación de nuevas técnicas moleculares. Este mismo autor
menciona, que en el caso de las plantas, para cierto tipo de análisis, los RFLP
continúan teniendo relativa importancia como técnica molecular.
Los RFLP han sido utilizados como marcadores de caracteres agronómicos de gran
interés en especies de gramíneas y leguminosas, en el estudio de ligamientos e
incompatibilidades de polen y estilo en especies como manzano, cerezo y en la
identificación de resistencia a enfermedades en cebada, maíz, etc. (SIDTA 1999).
Lashermes et al. (1999) utilizaron marcadores RFLP, en combinación con hibridación
genómica in situ, para investigar el origen de la especie allotetraploide Coffea
arabica (2n=44). Mediante la comparación de los patrones RFLP de especies
diploides potencialmente progenitoras de C. arabica fueron identificadas las fuentes
de los dos genomas combinados en C. arabica. La organización del genoma de C.
arabica fue confirmada mediante hibridación genómica in situ usando
simultáneamente un marcaje total del ADN genómico de las especies donadoras
putativas. El resultado claramente sugiere que C. arabica es un anfidiploide formado
por la hibridación entre C. eugenioides y C. canephora, o por ecotipos relacionados
a estas especies. También, los resultados indican poca divergencia entre los dos
genomas constitutivos de C. arabica respecto a los genomas de sus progenitores,
sugiriendo que la formación de C. arabica como especie fue relativamente reciente.
La precisa localización de África Central como el lugar de formación de la especie se
basa en la presente distribución geográfica de las especies actuales de Coffea. Mayes
et al. (2000) utilizaron marcadores RFLP, para tasar la diversidad genética dentro de
54 palmas aceiteras. Estas palmas representan la mayoría de los padres en los cruces
realizados en los programas de mejoramiento. Se obtuvo un total de 157 bandas a
partir de las cuales se calculó la distancia genética entre las palmeras. El análisis
molecular corresponde correctamente con el origen y el pedigree esperado. Estos
autores resaltan el potencial de los marcadores en programas de mejoramiento, a
través del examen de la estructura genética de un grupo de plantas para estimar los
cruces que se pueden realizar con mayor o menor éxito. También mencionan, que
permite conocer el pool genético de los padres que son cruzados y estimar el de la
descendencia. Así como, evaluar la fidelidad genética de la descendencia. También,
N-Goran et al. (2000), mediante la utilización de marcadores RFLP, analizaron la
estructura genética de 175 genotipos de Theobroma cacao L. procedentes de Centro
y Sur América. Este análisis les permitió determinar: una alta diversidad genética
entre los materiales, que el número de alelos por locus nunca fue mayor de cuatro,
que los genotipos de Centro América son distintos a los de Sur América y por último,
determinaron que dentro de una población la diversidad de genes es alta. Por su
parte, Alston y Batlle (1992) utilizaron marcadores RFLP para realizar una selección
temprana de árboles de manzana en semillero, esto con el fin de acortar el tiempo
y reducir los costos en los programas de mejoramiento genético. Si la selección de
los árboles se realizara de manera tradicional, es decir, esperando a que los mismos
que expresen la característica buscada (por ejemplo sabor de fruto) todos los
materiales se deberían mantener en el tiempo y en el espacio necesarios hasta las
evaluaciones y selección, lo que implicaría un gasto, no necesariamente una
inversión, de una gran cantidad de recursos en árboles que probablemente no serán
seleccionados para continuar con el programa de mejoramiento
2.2. RAPDs
Este análisis fue descrito por primera vez en 1990 por dos grupos de investigadores
independientes Williams et al. (1990) y Welsh y McClelland (1990). Phillips et al.
(1995) mencionan que en esencia es la misma metodología PCR, por lo que a veces
se le refiere con este nombre. La modificación que les dio origen consistió en
sustituir en la tecnología PCR, el uso de un par de iniciadores cuidadosamente
diseñados y un poco largos, por un solo iniciador corto, de alrededor de 10
nucleótidos de longitud y de secuencia arbitraria, con la capacidad de unirse a
regiones específicas en el genoma (Waugh y Powell 1992; Valadez y Kahl 2000).
En el análisis PCR los dos iniciadores son usados para amplificar una secuencia
específica del genoma, y en el análisis RAPD, el iniciador se usa para amplificar
secuencias al azar de un patrón complejo de ADN (Phillips et al. 1995). Los
polimorfismos producidos con la técnica RAPD se denominan marcadores RAPD, y
pueden resultar de cualquier cambio en la secuencia o sitio de unión del iniciador
(mutación puntual), lo cual impide que el iniciador se una a la cadena, o también
pueden ser el producto de cambios que alteren el tamaño o impidan la exitosa
amplificación del ADN molde. Como regla general, el tamaño de las variantes se
detecta muy escasamente y los productos de amplificación individuales representan
un alelo por locus. En los estudios de herencia, los productos de amplificación se
comportan como marcadores dominantes (Waugh y Powell 1992). Los RAPDs
generan un número inmenso de marcadores y, al contrario de los RFLPs, no
requieren de sondas específicas para cada especie y la cantidad de ADN necesaria
para el análisis es mucho menor (Phillips et al. 1995). El análisis RAPD requiere de
cinco elementos básicos: 1). ADN molde: ADN proveniente de la muestra a analizar.
2). El iniciador: que es un oligonucleótido, con la propiedad de localizar y unirse a
sitios complementarios del ADN desnaturalizado. Debe tener un contenido de al
menos un 50% de guanina-citocina para funcionar correctamente. 3).
Desoxirribonucleótidos: se requiere de concentraciones adecuadas de dATP, dGTP,
dCTP y de dTTP para la síntesis de la cadena. 4). Solución buffer. 5). Taq-polimerasa:
es una enzima ADNpolimerasa ADN dependiente termoestable. Tiene la propiedad
de restituir la doble cadena de ADN usando una cadena simple como molde a partir
de un punto determinado, fijado en este caso, por el iniciador (Phillips et al. 1995).
Durante el análisis RAPD se dan una serie de reacciones químicas en forma cíclica de
manera similar a lo que ocurre en una reacción PCR pero contemplando la
modificación mencionada anteriormente. La eficiencia de los marcadores RAPDs
puede estar influenciada por varios factores, entre ellos: El número de ciclos de
amplificación, la cantidad de ADN inicial, la longitud del ADN, el iniciador y la
temperatura (Phillips et al. 1995).
Mediante el uso de la técnica RAPD se evaluó la estabilidad genética de las
selecciones regeneradas in vitro de Annona cherimola y A. muricata. 29 iniciadores
fueron evaluados, de ellos seis fueron seleccionados por su patrón de repetición en
ambas especies y selecciones. Los resultados confirmaron la estabilidad genética de
las plantas micropropagadas de acuerdo con los iniciadores seleccionados. Esta
investigación presenta por primera vez, hasta donde es conocido, un protocolo que
permite la propagación clonal in vitro de A. cherimola y A. muricata, el cual es
confirmado por la técnica molecular RAPD. Con este protocolo se pueden regenerar
y propagar árboles selectos de A. cherimola y A. muricata y conservando la
estabilidad genética de los mismos, por lo que se puede garantizar que el material
propagado es “fiel al tipo” (Bridg 2001). Se utilizó la tecnología RAPD para estudiar
la variabilidad existente en un banco de germoplasma de guisante, con objeto de
establecer una colección nuclear, además para la identificación de genes de interés
agronómico, los cuales serán utilizados en los programas de mejora (SIDTA 1999).
Con el uso de los marcadores RAPD fue posible caracterizar los genotipos de cacao
pertenecientes a la colección 95 de la Estación Experimental de Ocumare de la Costa,
Aragua, Venezuela. Los resultados permitieron la clasificación de los árboles de
cacao en dos grandes grupos; cacaos criollos antiguos y cacaos criollos actuales.
Además, se evidenció que los materiales que provienen de la misma localidad
presentan patrones de banda similares y conforman grupo locales, posiblemente por
presentar un origen común (Salazar y Efraín 2002). Para extraer el ADN y poder
caracterizar la población de árboles de cacao, utilizaron diferentes tipos de tejido
foliar; tierno y fresco, sazón y fresco, tierno y almacenado en congelación y sazón y
almacenado en congelación. Determinaron que el tejido idóneo para realizar la
extracción es el tejido joven y fresco, ya que presentó menos problemas de oxidación
y contenido de mucílago en las muestras procesadas, lo que favorece el proceso de
extracción de los ácidos nucleicos. También encontraron que concentraciones de
ADN por encima de 25 ng/μl resultan inhibitorias para el proceso de amplificación al
azar del ADN y que los geles de agarosa al 2% permiten la mejor separación de los
productos de amplificación así como una mayor resolución de los mismos. De los
iniciadores evaluados, tres fueron los que produjeron la mayor cantidad de
fragmentos amplificados, polimórficos y reproducibles (Salazar y Efraín 2002). La
técnica de RAPD es efectiva para caracterizar genotípicamente variedades de
mango. Para la extracción del ADN, en mango, fue preferible usar el tejido foliar
proveniente de hojas verdes con textura suave y tierna, evitando las de color bronce
o rojizas. Las concentraciones de ADN genómico por debajo de 20 ng/μl y por encima
de 25 ng/μl resultaron ser inhibitorias para la amplificación mediante PCR. Los
iniciadores que produjeron mayor cantidad de fragmentos polimórficos fueron OPA-
04, OPA-15, OPB-06, OPB-07 y OPM-05. Para lograr una mejor resolución y definición
de las bandas se usó un gel de agarosa al 1,4% con el bromuro de etidio incluido en
concentraciones de 0,1-0,5 μg/ml. Cada uno de los genotipos estudiados presentó
un conjunto de patrones de bandas RAPD que le son característicos y permite su
identificación. A pesar de la gran uniformidad morfológica que se observó en la
población de árboles, con solo el uso de los iniciadores mencionados se logró separar
genotípica los materiales de la colección, lo que demuestra el poder de resolución
de la técnica para discriminar, a nivel de variedad, en esta especie (Salazar y Efraín
2002). Galderisi et al. (1999) utilizaron RAPD para distinguir entre varios clones de
seis cultivares de Ficus carica. La utilización de los marcadores moleculares permitió
la identificación exacta, luego se estimó la relación genética entre los cultivares y sus
clones.

2.3 Simple Sequence Repeat (SSRs)

Los marcadores microsatélites llamados también SSRs (Simple Sequence Repeat) o STRs
(Short Tandem Repeat) son motivos de di, tri o tetra-nucleótidos (incluso pueden ser más
complejos) repetidos en tándem a lo largo del ADN. Normalmente, los microsatélites no son
codificantes. Los microsatélites (repeticiones en tandem de mono, di, tri, tetra o
pentanucleótidos) son herramientas muy útiles como marcadores genotípicos debido a que
son relativamente abundantes, multialélicos (hipervariables con respecto al número de
repeticiones), heredados en forma estable y codominantes (se distinguen los alelos de un
locus), permitiendo distinguir materiales estrechamente relacionados. Desde el punto de
vista metodológico, son fáciles de detectar mediante PCR, requiriendo poca cantidad de ADN
para el análisis y poco equipamiento. o actúan como señales en los procesos de conversión
genética y recombinación, se considera que la metodología del análisis por SSRs es
relativamente sencilla.

Se trata de marcadores muy polimórficos, multi-alélicos, codominantes y reproducibles entre

laboratorios. Además, el análisis requiere solamente una cantidad escasa de ADN, extraído
generalmente de un material disponible a lo largo del año como es el caso de las hojas en
olivo. La técnica SSRs es también susceptible de automatización. La interpretación de los
resultados generados por este tipo de marcadores es relativamente sencilla. El principal
inconveniente de los microsatélites es la labor y el coste bastante elevados que requieren el
desarrollo de los cebadores. Así pues, la técnica SSRs representa hoy día una herramienta de
confianza para resolver los problemas relacionados con la caracterización genética y la
identificación varietal en olivo. Los microsatélites han sido ampliamente utilizados en olivo.

Existen distintas herramientas computacionales basadas en la web para el descubrimiento

de SSRs y el diseño de iniciadores específicos para la amplificación de los mismos. Se pueden
mencionar como ejemplos el programa SSRPoly accesible desde el sitio http://
acpfg.imb.uq.edu.au/ssrpoly.php, que permite la identificación de SSR polimórficos que se
distinguen de las variantes monomórficas por la representación de tamaños variables del
microsatélite identificado en alineamientos múltiples de secuencias representadas en la
bases de datos. Otra herramienta valiosa disponible en la web es CUGI SSR Server
(http://www.genome.clemson.edu/cgi-bin/cugi_ssr).

2.4 Los marcadores AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) o polimorfismos en la

longitud de fragmentos amplificado

Los marcadores AFLPs se basan en la amplificación de fragmentos de

ADN predigeridos con enzimas de restricción y unidos a adaptadores específicos. Se usan
cebadores selectivos (marcados) diseñados para dichos adaptadores. Los AFLPs son muy
polimórficos y permiten obtener una gran resolución en el análisis, dando la posibilidad de
analizar individuos con mucha similitud genética. Además, se dispone de un número ilimitado
de marcadores AFLPs y su desarrollo no requiere un conocimiento previo de la secuencia.
Sin embrago, los AFLPs presentan una serie de inconvenientes ya que son marcadores
dominantes, generan un coste elevado de análisis, requieren un ADN de mayor cantidad
y pureza que en el caso de los RAPDs por ejemplo, son arduos en poner a punto y difíciles de
interpretar. También, puede que haya un cierto grado de subjetividad en el análisis con
este tipo de marcadores. En olivo, se han empleado los marcadores AFLPs en el estudio de la
variación genética inter y intra-cultivar en variedades españolas (Sanz-Cortés et al.,2003), en
variedades italianas y en variedades del Este del Mediterráneo. Dichos marcadores se han
estudiado en 29 variedades de olivo de Túnez y del Mediterráneo presentes en el Banco de
Germoplasma de ‘‘Kssar Ghriss’’en el Sur del país. Los AFPLs también se han utilizados
combinados a otros tipos de marcadores como los RAPDs, los SSRs y los caracteres
morfológicos, para la discriminación entre cultivares de olivo (Rotondi et al.,2003). En otro
trabajo, la asociación de los AFLPs y los RAPDs permitió estudiar la presencia de variabilidad
intra-cultivaren olivo (Belaj et al.,2004).

Desde su desarrollo y divulgación esta técnica se utiliza ampliamente en el análisis de plantas.

Consiste esencialmente en cuatro etapas:

i) el ADN genómico es cortado con dos enzimas de restricción. Generalmente una es

de corte raro (ej. EcoRI), que reconoce de 6 a 8 pares de bases y otra es de corte frecuente
(ej. MseI) que reconoce 4 pares de bases

ii) fragmentos de ADN doble cadena de 20 a 30 pares de bases llamados adaptadores

se ligan en forma específica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior,
generando así el molde para la amplificación posterior del ADN

iii) se amplifican selectivamente fragmentos por PCR. En esta etapa, se utilizan

iniciadores de aproximadamente 20 nucleótidos que contienen una secuencia específica
complementaria a la secuencia de los adaptadores y además, 1 a 3 nucleótidos selectivos
adicionales de secuencia arbitraria en su extremo 3´. Dado que sólo una subpoblación de los
fragmentos originales es amplificada, se obtiene un patrón de bandas que permite un registro
adecuado. La amplificación descripta en iii) se realiza en dos etapas:

- una primera amplificación selectiva empleando un nucleótido arbitrario

(amplificación +1 o preamplificación) y luego, este producto de amplificación
obtenido es empleado como molde en una nueva amplificación empleando
iniciadores que poseen 2 nucleótidos selectivos adicionales al anterior (amplificación
+3 o amplificación final)

iv) El análisis de los fragmentos así amplificados se realiza mediante electroforesis en

geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Si uno de los iniciadores empleados está
marcado radiactivamente, se visualizará mediante autorradiografía, si uno de los
iniciadores está marcado con un compuesto fluorescente, puede ser resuelto empleando
un secuenciador automático. Alternativamente, se puede visualizar mediante tinción con
nitrato de plata como se muestra en la siguiente imagen.
 La base genética del polimorfismo de AFLP es la ausencia o presencia de fragmentos
amplificados de un tamaño determinado dado por mutaciones puntuales, inversiones,
inserciones y deleciones que llevan a la pérdida o ganancia de un sitio de restricción o la
alteración de la secuencia reconocida o amplificada por los iniciadores. Al igual que en los
RAPDs, no es posible distinguir individuos heterocigotos por lo que se trata de un marcador
dominante. Una banda AFLP se interpreta como un locus, definido por las dos enzimas de
restricción, una combinación de primers que incluyen las bases selectivas (Ej. EcoRI-
ATC/MseI-AAG) y un peso molecular. Su implementación en laboratorio requiere de una
infraestructura considerable, son relativamente laboriosos para su obtención y el costo es
medio a alto. Estos marcadores presentan un alto poder de detección de la variabilidad
genética, ya que se explora simultáneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de sitios
de restricción (como los RFLP).

2.3. CRISPR/CAS9
Algunas bacterias y la mayoría de arqueas poseen un sistema de defensa adaptativo
que utiliza nucleasas guiadas por ARN (Cas), llamado repeticiones palindrómicas
cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) y protegen a las bacterias
de virus y plásmidos. Esta inmunidad la consiguen al introducir pequeñas secuencias
de ADN, que provienen de virus o plásmidos, en el locus de CRISPR generando un
registro de infecciones.
Se han identificado diferentes tipos (I – III) de sistemas CRISPR, cada uno tiene
asociado un clúster de genes que codifican para las Cas, ARN no codificable y
elementos repetitivos (Figura 2). Las repeticiones tienen intercaladas pequeñas
secuencias derivadas de ADN exógeno (por ejemplo ADN de virus), llamado spacer;
juntas, estas secuencias constituyen el array de ARN CRISPR (crRNA). En el ADN
exógeno cada protospacer (es la secuencia spacer en el organismo exógeno) está
siempre asociado a un motivo adyacente al protospacer (PAM), que varía según el
sistema CRISPR [1,2,3].

Figura 1. CRISPR tipo II, operón del gen cas con el tracRNA y las secuencias
que forman el crRNA [4].

La inmunidad mediada por CRISPR-Cas9 funciona en tres fases (Figura 2):

Fase adaptativa, en la que los enzimas asociados a CRISPR adquieren los protospacer
del ADN exógeno y lo integran en el locus CRISPR dentro del genoma procariota
seguido de la síntesis de una nueva repetición. Esta fase otorga memoria genética
para poder realizar las dos siguientes fases.
Fase de expresión, se transcribe la secuencia de repeticiones-spacer (locus CRISPR)
y, luego las Cas lo escinden en pequeños fragmentos (crRNA), cada tipo de CRISPR
actúa de forma distinta para generar estos fragmentos.
Fase de interferencia, el crRNA guía a la maquinaria al DNA complementario que está
flanqueado por la secuencia PAM para que corte el DNA exógeno en una zona
concreta, cada tipo de CRISPR efectúa el corte con un complejo distinto. En esta fase
se impide la infección [2,6,8].
 Figura 2. Fases de la inmunidad del sistema CRISPR del tipo I y II [7].

Existen tres tipos de sistemas CRISPR-Cas (I, II y III), todos ellos pueden coexistir en
un mismo organismo. El tipo I es reconocido por la presencia de Cas3, una proteína
con los dominios helicasa y DNasa que son los responsables de la degradación.
Actualmente, se conocen seis subtipos del Tipo I-A al Tipo I-F que tienen un número
variable de genes Cas. El pre-crRNA es procesado por Cas5 o Cas6. Aparte de Cas1,
Cas2 y Cas3, todos los sistemas Tipo I codifican un complejo de tipo Cascada. Este
complejo se une a crRNA y localiza el objetivo. Este tipo de CRISPR necesita de un
complejo multi-Cas para su funcionamiento.
En el tipo II la maduración del crRNA se produce por un trans-activador (tracrRNA)
que es complementario a las repeticiones en el pre-crRNA; lo más importante es
que sólo una endonucleasa (Cas9) es la responsable del corte después del guiado al
DNA exógeno por el crRNA-tracRNA. Hay dos subtipos, II-A y II-B.El sistema tipo III
se asocia a la proteína Cas10 con una función poco clara. También utiliza la Cas6
para el procesado del pre-crRNA. Las proteínas Cas se destinan a los complejos Csm
o Cmr, que son similares a las proteínas Cascada del tipo I.
 Lo más significativo es que en los tipos I y III, utilizan endonucleasas Cas
especializadas para procesar el pre-crRNA, y luego el crRNA maduro se asocia a un
complejo multi-Cas, el cual reconocerá y cortará el DNA exógeno. Y en los tipos II
la maduración del crRNA se produce por tracRNA y solo necesita Cas9 para el corte
del DNA objetivo (Figura 4) [1,7,8].

Figura 4. Fases de los tipos I-III de CRISPR y sus diferencias [7].

Se descubrió que esta técnica podía utilizarse para la ingeniería genética de una forma
muy específica, eficiente y fácil de diseñar para una gran variedad de tipos celulares y
organismos. Únicamente diseñando la secuencia de RNA guía se podía dirigir el corte de
la Cas9. Se eligió para llevar a cabo esta función el tipo II de CRISPR ya que solo necesita
una proteína (Cas9) guiada por ARN para cortar el ADN diana [1,8].
3. Importancia en el mejoramiento genético en plantas cultivadas.

En general, los marcadores moleculares son utilizados en estudios de enfermedades

genéticas, pruebas de paternidad y parentesco, también como herramientas en la
selección de plantas o animales, en programas de mejoramiento y finalmente, en
estudios de caracterización cuya finalidad son estudios sobre taxonomía, evolución y
conservación.

 Identificación de origen parental y tests de paternidad.

 Identificación y protección de variedades.
 Atribución de lineas a grupos heteróticos.
 Certificación de pureza genética de lineas y hibridos.
 Control de fecundación cruzada y autofecundación en plantones de semillas forestales.
 Evaluación de germoplasma y poblaciones de mejoramiento (variabilidad, diversidad,
clasificación, distancia genética y filogenia).
 Construcción de colecciones nucleares (“core collections”) en bancos de germoplasma
a partir de estudios sobre diversidad y distancia genética.
 Construcción de mapas genéticos de ligamiento.
 Mapeamiento genético de QTL y/o ETL (“Quantitative” y Economic Trait Loci”),
controladores de características cuantitativas y/o de importancia económica.
ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-ATCGATC
ATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGTGATCGATC    snp snp indel Individuo 1
Individuo
 Análisis de la arquitectura de características cuantitativas (número, posición, acción
genética, magnitud de efecto e interacciones de QTLs).
 Detección de loci homólogos en otras especies o generos a través de mapas
comparativos (“Comparative “ o Synteny mapping”).
 Introgresión de características por retrocuzamiento asistido por marcadores.
 selección y recombinación dirigida de genotipos superiores.
 selección durante el desarrollo de lineas endógamas.
 Predicción de fenotipos esperados.
 Selección indirecta para características de difícil evaluación (resistencia a factores
bióticos y abioticos, o para características industriales).
 Selección precoz en cultivos perennes.

Aplicación para estudios de caracterización

Los MM tienen un alto poder de discriminación, no presentan interacción con el

ambiente, producen resultados equivalentes entre distintos laboratorios, permiten el
cálculo de distancias entre genotipos en forma consistente con otros caracteres, como
información de pedigree. Preferentemente, debe conocerse el control genético de los
descriptores, y ser posible su localización cromosómica. Además, la metodología de
análisis de los perfiles generados, debe ser capaz de traducirlos e interpretarlos. Entre
las principales técnicas de marcadores moleculares, la más adecuada a esos parámetros
es la de 0microsatélites. Actualmente, este tipo de estudio tiene un gran impacto, pues
son apuntadas como las herramientas más poderosas para identificación y
caracterización de variedades, dando soporte a la propiedad intelectual de las mismas.

Aplicaciones de los marcadores moleculares en programas de mejoramiento

En programas de mejoramiento, los marcadores moleculares pueden ser utilizados con

finalidad de identificación de individuos, análisis de diversidad génica, mapeo genético,
mapeo de características cualitativas o cuantitativas heredadas, mapeo comparativo
entre distintas especies, estudios de evolución, caracterización genética de especies,
genética de poblaciones y clonaje de genes. La aplicación de marcadores moleculares
para identificación genética permite la optimización de bancos de germoplasma y
colecciones nucleares para programas de mejoramiento. Ese tipo de análisis asociado a
evaluación en software adecuados, conduce a los estudios de diversidad genética que
permiten al fitomejorador una base para la elección de individuos como progenitores,
pues analiza la proximidad o divergencia genética de los progenitores. De esa manera,
el fitomejorador puede optimizar los cruzamientos y alcanzar individuos híbridos con
características mejoradas en tiempo más corto. El mapeo genético es un estudio
importante en programas de mejoramiento, pues es necesario, en un momento dado,
saber en cual cromosoma está la característica de interés y como ésta segrega en la
población. El mapeo genético que se consigue por medio de trabajos con marcadores
moleculares, también puede ser utilizado para ubicar en el genoma de una planta
transgénica, el gen que otorgó la característica introducida a través de la
transformación. La utilización de los marcadores moleculares para mapeo de
características cuantitativas (Quantitative Trait Loci, QTL), es muy útil. Rasgos tales
como resistencia a enfermedades o producción, son características que dependen de
más de un gen y así son de difícil evaluación. Por eso, hacer selección asistida con
marcadores moleculares para fragmentos relacionados con QTL, tiene un gran impacto.
Además de eso, también se puede hacer el mapeo de características heredadas que
sean cualitativas. En esos casos, la técnica de SCAR es muy útil para hacer selección
asistida. La selección asistida fue señalada como una técnica que disminuye el costo de
un programa de mejoramiento. La selección asistida puede también ser utilizada para
reconocimiento de individuos en una progenie que contiene un gen introducido por
transformación genética de plantas. Los marcadores moleculares ya permitieron el
clonaje de un gran número de genes (Mapbased cloning). Así, la técnica de los
marcadores moleculares puede también relacionarse con las del DNA recombinante y
transformación genética de plantas. Es conveniente indicar que el estudio utilizando
marcadores moleculares en programas de mejoramiento con objetivo de análisis de
diversidad genética, mapeo de características cualitativas o cuantitativas o aún mapeo
genético, necesita no sólo conocimiento técnico de esas metodologías, sino también
conocimientos para análisis estadísticos en las progenies utilizando métodos
biométricos de evaluación. Actualmente, en el área de la genómica, los estudios de
secuenciación conducen al conocimiento de diversas secuencias génicas nuevas. La
caracterización de nuevos genes, asociados a alguna característica de interés, puede ser
una herramienta muy poderosa para dar soporte a los programas de mejoramiento y
están asociadas al análisis con marcadores moleculares. Por medio del conocimiento de
sus secuencias, se pueden hacer diseños con iniciadores específicos y así hacer
amplificación específica de los genes más importantes que se quieren fijar en una
población y analizar su segregación en ésta. Aún más. Se puede estudiar su presencia
genética (homocigosis o heterocigosis). El mapeo genético de organismos utilizando los
marcadores moleculares también da soporte a los trabajos de secuenciación completa
de genomas.

Selección asistida por marcadores moleculares (MAS)

Los trabajos de ligamiento se realizan con la finalidad de encontrar marcadores

asociados a ciertos genes de interés, como resistencia a una enfermedad, rendimiento,
entre otros. Para ello se identifican padres muy diferentes para ese gen, por ejemplo
uno debe ser susceptible y el otro resistente. Estos se hibridan y se genera la F1. Luego
se hace generalmente la F2 (por autofecundación) para observar la segregación. Este
material (población segregante y junto con los padres) debe ser evaluado con
cualquiera de las técnicas moleculares, como por ejemplo AFLP, y a la vez se debe
evaluar este material para su respuesta genotípica. Esta comparación nos lleva a la
asociación de ciertos fragmentos de DNA (conocidos como marcadores), ya que solo
estarán en un parental, por ejemplo resistente. Este marcador asociado a la resistencia,
cuanto más cerca está al gen, se considera mejor marcador para la selección asistida
(MAS) o facilitada por marcadores moleculares. Se considera mucho mejor cuando es
parte del mismo gen, esto significa que puede ser del promotor, o de la parte estructural
del gen (intron o exon). Luego de encontrar marcadores ligados con el gen de interés,
se puede utilizar esos marcadores para una selección en los programas de
mejoramiento genético. Este marcador ligado, obtenido ya sea por RAPD, AFLP, se debe
convertir en especifico, usando la tecnica SCAR o CAPs. Para facilitar su lectura, se
 obtiene uno o pocos fragmentos. En general la presencia de esta banda en el genotipo
nos indicaria que ese genotipo es resistente. Pero esto no necesariamente será así.
Entonces para evitar eso, hay que verificar su respuesta fenotípica en todos aquellos
que presentan ese fragmento de resistencia. Puede ser que genotipos susceptibles
tambien tengan ese marcador, esto significaria por ejemplo que ese genotipo tiene el
gen, pero seria como pseudogene.

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