Práctica N°11: Enzimas Microbianas

1. Estudio de Exoenzimas: Hidrólisis del Almidón.

Se realizaron las siembras de cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli en una placa de Petri
con agar almidón. Tras una incubación de 3 o 4 días a 37°C se revisó la placa y tras evidenciar
crecimiento en ella se adicionó lugol hasta sumergir toda la superficie, obteniendo el siguiente
esquema:

Se pudo determinar que B. subtilis puede metabolizar el almidón realizando una hidrólisis total
(evidenciado por las zonas claras sin virar), por lo que se puede decir que esta cepa cuenta con
las exoenzimas α-amilasa (para la degradación parcial del almidón a dextrina) y β-amilasa (para
la degradación total de dextrina a maltosa). Por otro lado, E. coli no poseería estas enzimas ni
otras semejantes puesto que no presentó hidrólisis alguna del almidón y por ello viró a azul
intenso (al reaccionar con la fracción amilosa del almidón como tal). Se puede suponer también
que de haber revisado antes la placa, se pudo observar una coloración rojo vino en el lado de B.
subtilis, cuando solo hubiera habido hidrólisis parcial (quedando la fracción amilopectina), en
camino a la total que sí evidenciamos.

2. Estudio de Exoenzimas: Hidrólisis de la Caseína.

Se realizaron las siembras de cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli en una placa de Petri
con agar leche. Tras una incubación de 3 o 4 días a 37°C se revisó la placa y tras evidenciar
crecimiento se observó el cambio del medio alrededor del crecimiento microbiano
evidenciándose que no todo el agar leche seguía siendo opaco, según el esquema:
 Se pudo determinar que B. subtilis puede metabolizar la caseína, por lo que se puede decir que
esta cepa cuenta con la exoenzima caseinasa. Por otro lado, E. coli no poseería esta enzima ni
otras semejantes puesto que no presentó hidrólisis de la caseína.

3. Estudio de Endoenzimas: Producción del Ácido Sulfhídrico (H2S) y Liberación de Indol.

Se realizaron las siembras por punción de Proteus vulgaris y Escherichia coli en tubos de ensayo
con medio semisólido siguiendo el método de SIM (Sulfuro Indol Movilidad). El método de
SIM permite evaluar la producción de ácido sulfhídrico, pues contiene sales de plomo
(subacetato de plomo), la liberación de indol al agregar luego de cultivar entre 3 y 4 días el
reactivo de Kovacs (alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido
clorhídrico concentrado (Lab Sar, 2010)) y la motilidad pues un m.o. móvil se evidenciará fuera
de la punción del sembrado en el medio semisólido. Se obtuvo:
 Se pudo determinar que P.vulgaris puede reducir la cistina a dos cisteína produciendo ácido
sulfhídrico (H2S) (por la tinción negra) por lo que se puede decir que esta cepa cuenta con la
endoenzima cistina reductasa. Por otro lado, E. coli no poseería esta endoenzima ni otras
semejantes puesto que no presentó pigmentación negruzca. Además se vio la gran motilidad de
P. vulgaris que evidenció crecimiento en todo el medio semisólido, más allá de la punción del
sembrado; lo que no ocurrió para E. coli. Finalmente, tras agregar el reactivo de Kovacs, se
pudo determinar que E. coli puede metabolizar el triptófano liberando indol (por el halo rosa en
la superficie) por lo que se puede decir que esta cepa cuenta con la endoenzima triptofanasa;
mientras P. vulgaris no poseería esta endoenzima ni otras semejantes por la presencia de un halo
transparente.

4. Estudio de Endoenzimas: Metabolismo del Citrato de Sodio

Se realizaron las siembras por estriado de Enterobacter aerogenes y Escherichia coli en tubos de
ensayo con agar citrato de Simmmons, el cual consta de agar, sales, la única fuente carbonada
(citrato de sodio) y el indicador azul de bromotimol (que virará a azul intenso de presentarse un
medio alcalino por la presencia de carbonato de sodio producido de la liberación de CO2 propio
de la respiración celular). Se obtuvo:

Se pudo determinar que E. aerogenes puede metabolizar el citrato produciendo dióxido de

carbono y posteriormente carbonato de sodio (por el viraje a azul) por lo que se puede decir que
esta cepa cuenta con la citrato liasa. Por otro lado, E. coli no poseería esta endoenzima ni otras
semejantes puesto que no presentó viraje alguno y no metabolizaría el citrato como fuente de
carbono.

*Cabe resaltar que para para la práctica experimental se tuvieron resultados imprevistos que
dieron a entender que las cepas de E. coli no eran E. coli y bienera un cultivo contaminado.
Otras sepas tampoco dieron el resultado adecuado por lo que las fotos de aquella experiencia
con sus respectivos rótulos solo darían lugar a error, por ello se ha esquematizado todo
virtualmente evitando el uso de las fotos de la experiencia en el laboratorio.
5. Discusión

En la práctica, hubo un problema con la cepa rotulada como E. coli. Se presume que fue un
error propio del laboratorio donde se nos proporcionó una bacteria diferente a E. coli por los
resultados erróneos que se obtuvo en las 3 mesas de laboratorio en todas las pruebas realizadas.

6. Conclusiones

E. coli B. subtilis P. vulgaris E. aerogenes

Hidrólisis de la Caseína - +
Hidrólisis del Almidón - +
Producción de Ácido Sulfhírdrico - +
Liberación de Indol + -
Motilidad - +
Utilización del Citrato de Simmons - +
Tabla 1. Se resumen las conclusiones obtenidas de la experiencia sobre las enzimas
microbianas.

 A partir de la propiedades enzimáticas de las cepas bacterianas puede identificarse una

especie o al menos género bacteriano y descartar otros, tal como se pudo dictaminar que
la E. coli utilizada en realidad era otra bacteria la cual no se pudo precisar.