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IMPUNIDAD”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL
INFORME N°02
TEMA:
INMOVILIZACION DE CELULAS MICROBIANAS
ALUMNOS:
GARCIA CRISANTO SILVIA EDITH
DOCENTE:
CURSO:
BIOTECNOLOGÍA
FECHA:
PIURA – PERÚ
I. INTRODUCCIÓN
En este caso, el uso de células inmovilizadas dentro de procesos continuos para la producción de bebidas
fermentadas representa una línea de investigación de elevado interés debido a las ventajas económicas
y técnicas que presenta en comparación a los sistemas discontinuos con células libres. En ese sentido,
los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes, proporcionan la oportunidad
de superar los largos tiempos de fermentación y maduración encontrados en las industrias cerveceras
tradicionales; dichos geles que contienen levaduras inmovilizadas en su estructura, se utilizan para
controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el paso del tiempo. Los geles comprenden una
matriz de polisacárido natural como base del gel, y células de levaduras inmovilizadas en la estructura
de dicha matriz.
Los geles así constituidos permiten tanto corregir el color de una bebida que ya ha pardeado, como para
prevenir el desarrollo de color en una bebida susceptible de pardear con el paso del tiempo. En el
presente informe se desarrolla uno de los diversos métodos de inmovilizar levaduras con capacidad de
reutilización, a fin de valorar su importancia en procesos industriales
El objetivo del presente artículo es revisar las aplicaciones de la inmovilización de diversas especies
microbianas durante la biodegradación de contaminantes, con énfasis en la aplicación de esta tecnología
para la biorremediación de suelos contaminados con compuestos orgánicos.
En la última sección se hace una revisión del estado del arte de la aplicación de los microorganismos
inmovilizados en el tratamiento de suelos contaminados. En general los reportes se refieren a trabajos
realizados a nivel de laboratorio, en los que se han empleado preferentemente soportes
convencionales en forma de mezclas que permiten lograr una mayor resistencia del soporte. Estos
estudios han reiterado el incremento de la eficiencia de las células inmovilizadas.
II. OBJETIVOS
Conocer la técnica de inmovilización de la levadura (Saccharomyces cerevisiae) de agar - agar.
Evaluar y comparar la producción de alcohol de las células inmovilizadas y de las células libres.
Los usos de nuevos métodos biotecnológicos están centrados en la optimización de un proceso, que
nos permitan obtener productos metabolizados por microorganismos y que a la vez sea útil para el
hombre. Tal es el caso de inmovilización de células, método que está basado en la limitación del
movimiento de células vivas a cualquier parte de su entorno, promoviendo así la efectividad de tomar
el sustrato y transformarlo en el producto deseado, y cuyas ventajas nos ofrecen que la célula se
encuentre protegida a sustancias tóxicas y estrés ambiental, que aumente su optimización y reduzca los
costos de su manejo.
Existen diferentes técnicas para lograr una inmovilización celular, que están basadas en el micro
encapsulamiento (rodear completamente a las células), comúnmente son polímeros no tóxicos y
biocompatibles para la protección de la célula. Por ejemplo, la inmovilización en alginato y la
inmovilización en agar, ambas técnicas permiten que las células no pierdan su actividad metabólica a
pesar de encontrarse encapsuladas en una consistencia más sólida en caso del alginato o a comparación
del agar que como matriz tiene menor rigidez.
Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculación depende de factores
como el pH, la concentración de Ca2+, temperatura y la agitación, Además, cada cepa de levadura
presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999).
Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el reactor,
lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. El mayor problema que presenta
esta técnica es el bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partículas o a
las mismas levaduras (Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la inmovilización de células por adsorción
sobre la superficie de materiales es fácil de conseguir, pero al ser la adsorción un fenómeno
fundamentalmente electrostático, durante los procesos en continuo, especialmente por efecto de la
agitación, las células se liberan del soporte. Además, por este método es difícil inmovilizar grandes
cantidades de biomasa (Verbelen et al., 2006).
Si bien, existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas, hoy en día se han
enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el desarrollo de sistemas
inmovilizados mediante el uso de materiales porosos diferentes a los polímeros de origen natural que
se han usado hasta ahora. Muchos de estos sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante en
los procesos de producción de vinos y fermentaciones alcohólicas en general.
Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos procesos
catalíticos, prueba de ello es su extensa aplicación (Corma, 1995). Debido a su tamaño de poro pequeño,
no sería posible inmovilizar levaduras dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas
zeolíticas sí podría ser de gran utilidad en procesos de fermentación en los que se requiere eliminar el
etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al., 2003). Para tal aplicación se podrían emplear
materiales zeolíticos hidrofóbicos convencionales como la zeolita beta o materiales híbridos orgánicos-
inorgánicos como los metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatos–beta (Maeda et 1997).
Cabe mencionar que la producción de membranas zeolíticas compactas y con propiedades mecánicas
adecuadas no es sencilla y hoy en día sigue siendo un reto para muchos grupos de investigación.
Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares, aunque siguen sin
presentar el tamaño de poro adecuado para la inmovilización de levaduras, sí permiten la inmovilización
de enzimas .Esto hace que estos sólidos tengan un interés especial en la industria vinícola ya que
mediante el uso de enzimas podrían modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de
aromas y sabores característicos del vino consiguiéndose productos con propiedades organolépticas
diferentes. Los materiales mesoporosos más adecuados para la inmovilización de enzimas serían los
sólidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamaño de poro La inmovilización de las enzimas se
conseguiría por difusión de las mismas en los poros del sólido previamente funcionalizado con
moléculas que “anclarían” la enzima a la pared del material. Sólidos como los que se proponen aquí
podrían usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados. (Hartmann, 2005)
En la actualidad, la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de obtener productos con
mejores características y menor costo. Por ello, la implementación de procedimientos que aumenten la
estabilidad de las enzimas y permitan su reutilización ha sido por muchos años el objetivo de diversos
laboratorios alrededor del mundo. La preparación y estabilización de enzimas ha sido un tema de estudio
desde hace casi 50 años y es de interés tanto científico como económico.
La inmovilización combina la actividad elevada y específica de las biomoléculas activas, como las
enzimas o anticuerpos, con la estabilidad química y mecánica del soporte. Consiste en mantener la
biomolécula unida o atrapada en un soporte físico, conservando su actividad catalítica y permitiendo el
flujo de sustratos y productos. Las enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o
sintéticos por medios químicos (uniéndolas al sustrato mediante enlaces covalentes) o físicos (fuerzas
electrostáticas o membranas), y pueden además ser encapsuladas mecánicamente la adición de agentes
que formen una película protectora alrededor de la enzima inmovilizada, permitiendo el paso de
reactivos y productos de pequeño tamaño, pero no de proteínas (Heering et al., 2004; Wang y Caruso,
2005).
Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solución. Permiten un
uso continuo, reutilización y control de las concentraciones de proteína empleada. Asimismo, es viable
mejorar la estabilidad y actividad de la enzima en función del pH y la temperatura, además, al ser
inmovilizadas quedan protegidas ante enzimas proteolíticas, aumentando así la eficiencia del sistema.
Sin embargo, la inmovilización también puede presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad
de la enzima puede verse afectada por el proceso de inmovilización, además, la velocidad de reacción
puede estar limitada por la velocidad de difusión de sustratos y productos hacia dentro y fuera del
sistema.
En este método se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble natural o sintético. El
enlace se da entre algún grupo funcional reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o His-
imidazol) y el soporte previamente activado, generalmente recubierto con grupos funcionales orgánicos
en la superficie (Monocapas tiol autoensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.).
El seguimiento de la inmovilización se realiza cuantificando la concentración de proteína libre
(generalmente por el método de Bradford), y de la proteína unida covalentemente al soporte (ej. ácido
bicinconínico). Las desventajas de este método radican en el sitio del enlace, ya que puede modificarse
el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estéricos que reduzcan la actividad. Sin embargo, esto es
poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios específicos y/o con una orientación
molecular definida. Además, la unión por enlace covalente confiere a la enzima una inmovilización más
estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et al., 1997).
Con esta técnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilización se da por un enlace directo
entre enzimas, que puede ser mediado o no por un agente de unión. Generalmente se añade el agente de
bajo peso molecular (ej. glutaraldehído) a la enzima en solución, uniendo covalentemente los grupos
funcionales de las enzimas para formar agregados. Este método tiene como ventaja su sencillez, sin
embargo, es susceptible a cambios pequeños de pH y temperatura en las condiciones de operación
(Gódia-Casablancas, 2005).
c) Atrapamiento
El método de atrapamiento está basado en la oclusión de las enzimas dentro de una red polimérica
que permite al sustrato y a los productos pasar a través de ellos y retener las enzimas. Este método
difiere de los métodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no están
enlazadas a la matriz o soporte. Existen diversos métodos de atrapamiento de enzimas como el de gel o
atrapamiento por fibras, microencapsulado y por inclusión. El uso práctico de estos métodos es limitado
debido a la baja transferencia de masa a través de las membranas o geles. Atrapamiento por inclusión.
Con este método la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fácil difusión
de productos. La matriz puede ser de origen natural o sintético y de diversos materiales (Sílica gel,
poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden clasificarse como geles húmedos, geles
secos (xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles). En este método las enzimas son colocadas en una
solución que posteriormente es gelificada (por temperatura o adición de polimerizantes), quedando
atrapadas dentro de la matriz. En algunos casos el gel es sometido a un proceso de secado y molido,
obteniendo así mayor área de contacto entre la enzima y la solución que contiene el sustrato (Figura
3B), dando como resultado esferas de 2 Sm con un tamaño de poro de 35 ± 7 Å También es posible
incrementar la capacidad de inmovilización de los geles al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol,
polietilenglicol, diferentes mono- o disacáridos) y surfactantes (lecitina, lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina,
bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o al añadir agentes policatiónicos o polianiónicos con carga
contraria a la enzima o a regiones de la superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la
poli(etilamina) (PEI) antes de la polimerización .
La inclusión tiene la ventaja de prevenir el acceso de proteasas y mantener intacta la estructura de la
proteína, por lo que su actividad no se ve afectada. Sin embargo, el tamaño de los poros no puede ser
controlado, es difícil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o
tras poco tiempo de uso, y un aumento en la cantidad de enzima cargada más allá de cierto punto no
implica necesariamente un aumento de la actividad, debido a las limitantes de difusión que se podrían
presentar.
En el método de inmovilización reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del
soporte bajo condiciones no extremas. El uso de métodos reversibles para la inmovilización de enzimas
es altamente atractivo, principalmente por razones económicas debido a que el soporte puede
regenerarse y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimática decae. Existen distintos
métodos de inmovilización reversible, que a continuación se describen:
a) Por adsorción
El método de adsorción emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un adsorbente activo
(monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atraídas y retenidas
por medio de interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals,
interacciones hidrofóbicas). Este método consiste en poner en contacto la enzima en solución acuosa
con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para después lavar el soporte y eliminar
la enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima,
ya que la unión es débil y no afecta su conformación, sin embargo, esta característica hace que al mismo
tiempo la unión sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura. (Woodward, 1985).
b) Adsorción no específica
Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas, donde la adsorción hidrofóbica ha sido utilizada
como un principio cromatográfico por más de 3 décadas. Consiste en variables experimentales
conocidas como el pH, concentración de sales, y la temperatura. La resistencia de las interacciones
radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la proteína. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser
regulada por el grado de sustitución del soporte y por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica. El
éxito de la inmovilización reversible de la β-amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha
sido reportada. Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofóbicos han sido
también. ( Woodward, 1985).
INSUMOS
- Agua helada
- Aceite refrigerado
- Levadura 0.5 gr
- Agar
INSTRUMENTOS
- Jeringa
- Refractómetro
- Matraz de Erlenmeyer
- MEDIO DE CULTIVO
- Glucosa o sacarosa 10 gr
- Ku2PO4
4.2 PROCEDIMIENTO:
Se coloca con la ayuda de una jeringa (gota a gota) la solución de agar .15gr de agar por 1
litro de agua helada (soporte) y la levadura, produciendo una mezcla.
Se retira el aceite y luego se extraen las esferas pequeñas formadas en el fondo del matraz.
Se lleva a una solución con extracto de levadura 0.5 gr, sulfato de potasio 0.5 gr, glucosa o
sacarosa 10 gr y agua destilada 100 ml. Para la determinación de alcohol se puede utilizar
la tabla específica ºBrix,
VI. CONCLUSIONES
La producción de alcohol es mayor cuando en el proceso de fermentación se usan células
inmovilizadas.
Al optimizar el proceso de fermentación normal es posible recuperar mayor cantidad de
producto en un corto tiempo.
El aceite común utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido a su propiedad
hidrofóbica.
El Agar-Agar al resultó ser un eficaz inmovilizador celular.
La separación del producto es fácil cuando las células están inmovilizadas.
VII. BIBLIOGRAFÍA