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ISSN: 0121-4004
vitae@udea.edu.co
Universidad de Antioquia
Colombia
MUÑOZ D., Katalina; LONDOÑO L., Julián A.; ARANGO A., Gabriel J.; SIERRA R., Jelver A.; BRAVO
M., Karent E.
EFECTO DE LA TÉCNICA DE EXTRACCIÓN DE RUTA GRAVEOLENS SOBRE LA ACTIVIDAD
ANTITIROSINASA Y CORRELACIÓN ENTRE LA INHIBICIÓN ENZIMÁTICA, EL CONTENIDO DE
COMPUESTOS FENÓLICOS Y LA CITOTOXICIDAD
Vitae, vol. 14, núm. 2, 2007, pp. 78-83
Universidad de Antioquia
Medellín, Colombia
RESUMEN
La pigmentación de la piel es el resultado de la producción y distribución de melanina, un pigmento que
es formado por la oxidación sucesiva de la L-Tirosina a L-Dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y dopaquinona
por el enzima tirosinasa. Las irregularidades en la pigmentación de la piel son un problema estético para
muchos individuos. Es por ello que actualmente existe un gran interés en investigar productos con
propiedades aclaradoras de la piel. Con el propósito de buscar inhibidores del enzima tirosinasa a partir de
productos naturales, se estudian extractos de Ruta graveolens (R. graveolens) empleando diferentes métodos
de extracción. Se determina la inhibición de la oxidación de la L-Tirosina catalizada por tirosinasa de hongo
y se correlaciona esta actividad con la citotoxicidad y el contenido de compuestos fenólicos, pues se ha
reportado que existe actividad inhibidora de este enzima por algunos de estos compuestos. Se encuentra
que el método de extracción influye sustancialmente en el contenido de compuestos fenólicos y en la
citotoxicidad, mientras ejerce un efecto modesto sobre la actividad inhibidora de tirosinasa.
ABSTRACT
Skin pigmentation is the consequence of melanin production and dispersion, this pigment is formed
by a successive oxidation of L-Tyrosine into L-Dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and dopaquinone
by Tyrosinase enzyme. Skin pigmentation irregularities become an aesthetic problem for many people.
Therefore there is a big interest in research on products with skin lightening properties. In order to find
inhibitors of Tyrosinase enzyme from natural product, extracts of Ruta graveolens (R. graveolens) were
studied by using different extraction methods. The inhibition of the oxidation of L-Tyrosine catalyzed
by mushroom tyrosinase is determined and correlated with cytotoxicity and the content of phenolic
compounds, because inhibitory activity on the enzyme has been reported of these kind of compounds. It
1 Grupo de Investigación en Sustancias Bioactivas (GISB). Facultad de Química Farmacéutica. Corporación de Patologías Tropicales. Uni-
versidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín-Colombia.
2 Grupo de Inmunodeficiencia Primarias. Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín-Colombia.
* Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: kmunos@farmacia.udea.edu.co
EFECTO DE LA TÉCNICA DE EXTRACCIÓN DE RUTA GRAVEOLENS SOBRE LA ACTIVIDAD ANTITIROSINASA... 79
was found that the extraction method affects strongly the content of phenolic compounds of the extract
and the cytotoxicity as well, in contrast with the inhibition of tyrosinase activity which remains almost
unaffected.
se leyó la absorbancia a 760 nm. Los resultados se Tabla 1. Resultados de la inhibición de tirosinasa,
expresan como Mg/ml equivalentes de ácido gálico contenido de compuestos fenólicos y citotoxicidad
(GAE) por cada mg de extracto. de extractos de R. graveolens, obtenidos por diferentes
métodos de extracción
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Compuestos
Método de % Inhibición Citotoxicidad
fenólicos
Extracción de Tirosinasa CC50 (μg/ml)
μg/ml)
g/ml)
Basados en el análisis cualitativo de la compo- GAE/mg extracto
sición de R. graveolens, donde se encuentran flavo-
Soxhlet 41,13 ± 0,41 252,71 ± 11,57 13,49 ± 0,69
noides reportados como inhibidores de la actividad
tirosinasa como rutina, quercetina y otros, se pensó Percolación 44,99 ± 0,25 115,91 ± 12,48 1265,06 ± 33,00
inicialmente que la cantidad de compuestos fenó-
Ultrasonido 32,49 ± 0,68 35,22 ± 7,31 413,66 ± 10,84
licos extraídos afectaría directamente la actividad
tirosinasa (12-15,19). Sin embargo, los datos obte-
nidos muestran que no existe una relación directa Al evaluar la actividad de los extractos de R.
entre el contenido de compuestos fenólicos y la graveolens sobre la inhibición del enzima tirosinasa se
inhibición de este enzima. Esto podría explicarse pueden observar diferencias entre ellos. Se encuen-
dado que los resultados del ensayo de actividad se tra que los extractos hidroalcohólicos de R. graveolens
presentan para una concentración de extracto fija. presentan una inhibición del enzima tirosinasa
Para clarificar este aspecto, es necesario estimar la entre 32 y 45% (Tabla 1). El ensayo de inhibición
Concentración Inhibitoria 50 (IC50) de cada ex- se siguió por un método espectrofotométrico en
tracto y comparar estos datos normalizados con el el cual se midió la absorbancia del producto final
contenido de compuestos fenólicos. Este parámetro de la reacción de oxidación que es, en este caso, L-
está siendo determinado en el laboratorio. dopaquinona (Figura 1).
HO HO O
Tirosinasa Tirosinasa
HO HO O
O HO O
Para determinar la inhibición del enzima tiro- El extracto que produjo una mayor inhibición
sinasa por los diferentes extractos se realizó una del enzima tirosinasa fue el obtenido por percola-
cinética de la reacción oxidación de L-tirosina a ción, y el que causó menor inhibición fue el obte-
L-dopaquinona y se midió la absorbancia a 480 nm nido por ultrasonido (Tabla 1), (Figura 2).
(Figura 2). Al analizar los resultados obtenidos en el Para evaluar el efecto tóxico de los extractos, se
paquete estadístico GraphPad Prism® demo, Versión realizaron ensayos de citotoxicidad basal (MTT).
4,00 para Windows (GraphPad software, Inc, San Estos ensayos son un buen punto de partida para
Diego CA 2003) se encontró que esta cinética sigue evaluar el potencial tóxico in vivo y predecir los
un modelo de hipérbola (Figura 2), que describe efectos agudos de los compuestos in vivo y se utili-
la unión de un ligando a un receptor. La ecuación zan como indicadores de toxicidad sistémica aguda,
matemática que representa este modelo es: puesto que si un compuesto es tóxico durante una
exposición aguda in vitro, se anticipa, en la mayoría
(2) de los casos, que esto refleja una agresión a las
funciones intrínsecas de las células (28). En estu-
donde, dios previos para un amplio número de sustancias
Bmax = Unión máxima de ligando al receptor se demostró una correlación razonable entre la
K d = Concentración de ligando requerida para citotoxicidad basal y toxicidad aguda en animales
alcanzar la mitad de la unión máxima y humanos (9).
Bmax fue el parámetro utilizado para calcular el por-
centaje de inhibición empleando la ecuación (1).
82 VITAE
0.8 1500
B % Inhibición T irosinasa
0.7 GAE/mg Extractro
Citotoxicidad
0.6 1250
U
S
Absorbancia
0.5 P 500
0.4
0.3 250
0.2
0
0.1
Soxhlet Percolación Sonicador
0.0 Método de Extracción
0 50 100 150 200
Tiempo (min) Figura 3. Efecto de extractos de R. graveolens ob-
tenidos por diferentes métodos de extracción sobre
Figura 2. Efecto de extractos de R. graveolens sobre la inhibición de tirosinasa, contenido de compuestos
la formación de L-dopaquinona medida a 480 nm. fenólicos y citotoxicidad.
Blanco (B), extracto obtenido con ultrasonido (U),
extracto obtenido por soxhlet (S), extracto obtenido
por percolación (P). CONCLUSIONES
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