AGRADECIMIENTO

Quiero dedicar el presente primeramente a dios y entre varias a una persona que me apoya
y respalda siempre con todo cariño: Mi madre.

1
 ÍNDICE
Agradecimiento 01
Introducción 03
Capítulo I 04
Tioflavina 04
Tipos de tioflavina 04
Mecanismo molecular de la unión de tioflaniva – t a las fibrillas de amiloide. 04

Características espectroscópicas del ThT unido a las fibrillas. 08

Modelo de canal de enlace ThT 10

Modelo autoasociación de unión a ThT 11

Estudios a nivel atómico de las interacciones ThT- fibrillas 11

Simulaciones de dinámica molecular demuestre enlaces ThT en canales de cadena

lateral 12

Los imitadores de autoensamblaje de péptidos (PSAM) definen experimentalmente un

sitio de unión ThT minimalista. 15

Requisitos de tamaño para los sitios de unión ThT. 16

Preferencias de secuencia en sitios de unión ThT. 18

Unión ThT a estructuras no fibrilares. 19

Implicaciones de los modelos anatómicos de la unión a ThT en el uso de colorantes

amiloideos 20

Conclusiones y perspectivas de futuro. 21

Linkografía. 22

2
 INTRODUCCIÓN
Los intensos esfuerzos para detectar, diagnosticar y analizar las propiedades cinéticas y
estructurales de las fibrillas de amiloide han generado un potente conjunto de
herramientas de sondas moleculares específicas de amiloide. Desde su primera
descripción en 1959, el tinte fluorescente Thioflavin-T (ThT) se ha convertido en uno de
los "patrones de oro" más utilizados para la tinción selectiva y la identificación de fibrillas
de amiloide tanto in vivo como in vitro. La gran mejora de su emisión de fluorescencia al
unirse a las fibrillas hace de ThT una herramienta particularmente poderosa y
conveniente. A pesar de su uso generalizado en aplicaciones clínicas y de ciencia básica,
el mecanismo molecular para la capacidad de ThT de reconocer diversos tipos de fibrillas
amiloides y para la fluorescencia característica del tinte apenas ha comenzado a
dilucidarse. Aquí, revisamos el progreso reciente en la comprensión de las interacciones
ThT-fibril en una resolución atómica. Estos estudios han brindado información
importante sobre las estructuras amiloides y los procesos de formación de fibrillas, y
también ofrecen una guía para el diseño de la próxima generación de diagnósticos,
inhibidores y terapéuticos de ensamblaje de amiloides.

3
 CAPÍTULO I
TIOFLAVINA
Las tioflavinas son tintes utilizados para la tinción histológica y estudios biofísicos de
agregación de proteínas. También se utilizan en estudios biofísicos de la electrofisiología
de las bacterias.
1. Tipos de tioflavina
Existen dos variedades de tioflavinas T y S.
1.1. Tioflavina T: Es una sal de benzotiazol obtenida por la metilación de
la deshidrotiotoluidina con metanol en presencia de ácido clorhídrico . El tinte se usa
ampliamente para visualizar y cuantificar la presencia de agregados de proteínas mal
plegadas llamadas amiloides , tanto in vitro como in vivo.
1.2. Tioflavina S: Es una mezcla homogénea de compuestos que resulta de la metilación
de la deshidrotiotoluidina con ácido sulfónico . También se utiliza para teñir las
placas amiloides. Al igual que la tioflavina T, se une a las fibrillas amiloides pero no
a los monómeros y proporciona un claro aumento en la emisión de fluorescencia. Sin
embargo, a diferencia de la tioflavina T, no produce un cambio característico en los
espectros de excitación o emisión. Esta última característica de la tioflavina S da
como resultado una alta fluorescencia de fondo, lo que hace que no se pueda usar en
mediciones cuantitativas de soluciones de fibrillas. Otro tinte que se usa para
identificar la estructura amiloide es el rojo Congo .
En esta recolección de información profundizaremos en el estudio de la tioflavina T.
2. Mecanismo molecular de la unión de tioflaniva – T a las fibrillas de amiloide.
Las fibrillas de amiloide son materiales proteínicos insolubles que se encuentran en una
amplia gama de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, como el Alzheimer
y las enfermedades priónicas, así como varios tipos de amiloidosis sistémicas. En 1853,
Virchow describió entre los primeros métodos para la detección de amiloide mediante la
tinción de muestras de órganos enfermos con un tratamiento de yodo-ácido
sulfúrico. Debido a que la naturaleza insoluble de las fibrillas de amiloide ha impedido el
uso de muchas herramientas bioquímicas, los colorantes de amiloide han servido como el
método dominante para la investigación de amiloides.
A lo largo de principios y mediados siglo XX, la detección histológica de amiloide se
realiza comúnmente utilizando Congo rojo, un colorante carmesí profundo adaptado de
la industria de la tela. Desafortunadamente, el proceso de tinción con rojo del Congo es
laborioso y requiere el uso de microscopía de luz polarizada, y la enigmática

4
“birrefringencia verde manzana” del tinte es a menudo difícil de interpretar. Los
denominados tintes directos, representados por el rojo Congo, funcionan en función de
diferentes afinidades con las fibrillas y los materiales no fibrilares. Su uso requiere tinción
seguida de lavado, lo que conduce a un nivel significativo de tinción de fondo y baja
reproducibilidad. En contraste, los compuestos fluorigénicos se vuelven altamente
fluorescentes solo cuando están unidos a una entidad molecular particular, y por lo tanto
ofrecen un conjunto de técnicas convenientes y altamente sensibles para detectar
componentes celulares y estructuras más allá de las que podrían observarse con tintes
directos. En 1959, Vassar y Culling demostraron el potencial de la microscopía de
fluorescencia para el diagnóstico de fibrillas de amiloide en un informe pionero de
tinciones fluorescentes específicas de amiloide. Fueron los primeros en describir el uso
de tioflavina-T (ThT) como un potente marcador fluorescente de amiloide en histología
(Figura 1a). Notaron que ThT se localizaba selectivamente en los depósitos de amiloide,
por lo que exhibía un aumento dramático en el brillo fluorescente (Figura 1b y 1c). En
comparaciones con varios colorantes de amiloide de rutina, recomendaron el uso de ThT
para la "demostración de amiloide, que es muy superior al rojo Congo o al violeta de
metilo".

5
Figura: 1

Técnicas experimentales comunes empleando ThT.

( a ) Estructura de ThT (arriba). Los dos segmentos más planos de ThT cuya rotación
mutua define la quiralidad también se muestran (abajo).
( b ) Histología temprana utilizando tioflavina-T para teñir el amiloide primario del riñón.
( c ) Imagen de microscopía TIRF de fibrillas de glucagón ramificadas teñidas con ThT.
( d ) Aumento característico de ThT al unirse a las fibrillas amiloides.
( e ) Cinética de fibrilación de concentraciones aumentadas de un péptido formador de
fibrillas. También se muestra el inicio rápido de la fibrilación inducida a través de la
siembra.

La investigación realizada a fines de los años 80 y principios de los 90 fue fundamental

para expandir el rango de aplicaciones de ThT desde la histología hasta
la caracterización in vitro. Naiki et al y LeVine estuvieron entre los primeros en
caracterizar a fondo los espectros de fluorescencia y las propiedades de unión de
ThT. Demostraron que, al unirse a las fibrillas, ThT muestra un cambio dramático del
máximo de excitación (de 385 nm a 450 nm) y el máximo de emisión (de 445 nm a 482
nm) y que la fluorescencia de ThT se origina solo del tinte unido al amiloide fibrillas. El
aumento de varios órdenes de magnitud en la intensidad de la fluorescencia ThT tras la
unión de las fibrillas hace que sea un informador inusualmente sensible y eficiente,
eliminando así la necesidad de lavado y permitiendo la observación en tiempo real, en
solución, de la fibrilación (Figura 1d y 1e). Su alta solubilidad en agua y su afinidad
moderada a las fibrillas (K d en el rango sub y bajo de μM) hacen que ThT sea susceptible
para muchos sistemas experimentales. Es importante destacar que estos estudios
demostraron que ThT se une de manera igualmente efectiva a diversas fibrillas preparadas
a partir de fuentes sintéticas y biológicas. Estos resultados brindaron un apoyo crítico a
la creciente opinión de que las fibrillas amiloides compartían una estructura molecular
común y reforzaban el uso de modelos peptídicos para estudiar las fibrillas amiloides.

Las fibrillas de amiloide se caracterizan por una morfología de tipo cinta, generalmente
no ramificada. A nivel molecular, los amiloides comparten una arquitectura común
"cruzada por β", que consiste en láminas β laminadas cuyas hebras son perpendiculares
al eje largo de la fibrilla (Fig. 2a). Esta composición rica en β produce las características
reflexiones de 4.8 Å y 10-11 Å observadas en los experimentos de difracción de rayos X
de las fibrillas de amiloide, que se atribuyen a la separación de las hebras dentro y entre
las capas de lámina β, respectivamente. Ha quedado claro que muchos polipéptidos tienen
una capacidad inherente para autoasociarse en estructuras de fibrillas ricas en β, lo que

6
explica la amplia incidencia de amiloides patógenos. Curiosamente, la arquitectura
cruzada β también es compartida por los "amiloides funcionales" que juegan un papel
clave en las células bacterianas, fúngicas y animales. Los estudios de Naiki et al y LeVine
demostraron que la unión del colorante está vinculada a la presencia de la estructura de
fibrillas cruzadas en β. Esta realización fue un punto de inflexión crítico en el uso de los
colorantes amiloides, no solo como indicadores de la presencia de amiloides maduros,
sino como una herramienta para diseccionar su estructura y el mecanismo de formación
de amiloides. Por ejemplo, una combinación de tinción ThT y microscopía de
fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) ha permitido recientemente la
visualización en tiempo real de los cambios morfológicos de la fibrilla y reveló una
morfología ramificada no caracterizada previamente (Figura 1c). La capacidad de ThT y
sus derivados para reconocer y unirse específicamente con una modesta afinidad al
amiloide le ha permitido servir como un excelente andamio de partida para la
derivatización y elaboración para generar una serie de tintes de amiloide alternativos y
reactivos clínicos, incluso para uso en imágenes médicas de Amiloide en pacientes
vivos. Un gran número de estos derivados de ThT se han desarrollado y revisado en otra
parte.

7
Figura 2:
La estructura común de las fibrillas y una justificación estructural para las interacciones
fibril-ThT.
( a ) Estructura de β-cruz de fibrillas de amiloide, formadas a partir de capas de láminas
β laminadas.
( b ) Modelo de "canal" de unión de ThT a hojas β similares a fibrillas. Se propone que
ThT se una a lo largo de los surcos de la cadena lateral de la superficie que corren
paralelos al eje largo de la lámina β.
El ThT se encuentra entre los colorantes amiloides más utilizados entre los cientos de
informes de amiloides publicados anualmente. El uso intensivo de ThT como marcador in
vitro de formación de amiloide ha generado una investigación sustancial sobre el
mecanismo de unión de ThT, con el objetivo principal de responder las siguientes
preguntas:

1. ¿Qué estructura (es) común (es) reconoce ThT y cómo?

2. ¿Cómo estas interacciones llevan al aumento dramático en la fluorescencia ThT?

En los últimos años, una serie de análisis experimentales críticos de ThT han iluminado
muchas de las interacciones detalladas y de nivel atómico necesarias para la unión de ThT
y la fluorescencia. Debido a que varios informes recientes han analizado la amplia gama
de tintes de tinción amiloide, aquí nos centramos en estudios recientes a nivel atómico
del mecanismo de unión a fibrillas de ThT. A través de una combinación de análisis
biofísico y bioquímico, ingeniería de proteínas, microscopía de fluorescencia y
simulación computacional, ha surgido un mecanismo coherente para las interacciones
ThT-fibrilla

3. Características espectroscópicas del ThT unido a las fibrillas.

La mejora de la fluorescencia al unirse a las fibrillas es la propiedad más definitoria y

estudiada a fondo de la ThT. Se cree ampliamente que el aumento dramático en la
fluorescencia ThT resulta de la inmovilización selectiva de un subconjunto de
conformadores ThT. Una gran cantidad de datos experimentales y predicciones
mecánicas cuánticas sugieren que ThT se comporta como un "rotor molecular". En
solución, una barrera de baja energía permite que los anillos de bencilamina y benzatioleo
de ThT giren libremente alrededor de su enlace carbono-carbono compartido (Figura
1a). Esta rotación apaga rápidamente los estados excitados generados por la excitación
del fotón, lo que provoca una baja emisión de fluorescencia para la ThT libre ( Figura
1d). En contraste, la inmovilización rotacional de ThT conserva el estado excitado, lo que

8
resulta en un alto rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 1d). Por extensión, es
probable que las fibrillas amiloides presenten un sitio de unión a ThT que estéricamente
"bloquea" el colorante unido, lo que conduce a una mejora de la fluorescencia de ThT.

Además de sus propiedades fluorescentes, los espectros de dicroismo circular (CD) de

ThT unidos a fibrillas a menudo muestran un pico sustancial de "Efecto de algodón" a
450 nm que refleja la conformación quiral torcida del tinte (Figura 1a). Sin embargo, no
parece que la inmovilización de ThT en una conformación quiral sea necesaria para una
gran mejora de la fluorescencia. Por ejemplo, un estudio cristalográfico mostró que la
ThT unida a la acetilcolinesterasa se encuentra en una conformación aquiral, planar
(Figura 3), a pesar de que el tinte exhibe un alto nivel de fluorescencia indistinguible de
la ThT unida a las fibrillas. En conjunto, estos resultados sugieren que el giro quiral de
ThT es una consecuencia de la unión de ThT a un ambiente quiral de las fibrillas de
amiloide, pero no es un requisito previo para una gran mejora de la fluorescencia de ThT

9
Figura 3:
Estructura cristalina de ThT unida a acetilcolinesterasa (PDB 2J3Q).
( a ) La acetilcolinesterasa se muestra en representación de dibujos animados, de color
gris. Todos los residuos dentro de 4 Å de ThT se muestran como palos rojos, excepto
Tyr121, que se omite para mayor claridad. Los residuos aromáticos (Tyr y Trp) que
forman superficies de unión a ThT similares a las observadas en el PSAM están
marcados. Los elementos de carbono, nitrógeno y azufre de ThT están en lavanda, azul y
amarillo, respectivamente.
( b ) El bolsillo de unión a ThT de la acetilcolinesterasa mostrado en vistas ortogonales,
con los átomos de la cadena principal de la proteína omitidos

4. Modelo de canal de enlace ThT

El número creciente de modelos estructurales para fibrillas de amiloide ha proporcionado
una base molecular para racionalizar los modos de unión de ThT. ThT se une a diversas
fibrillas, a pesar de sus distintas secuencias de aminoácidos, lo que sugiere que ThT
reconoce una característica estructural común entre las fibrillas. Debido a que las fibrillas
amiloides comparten la arquitectura cruzada β, generalmente se acepta que las superficies
de las estructuras cruzadas β forman los sitios de unión a ThT. La estructura de fibrillas
cruzadas β (Figura 2a) da lugar a una disposición específica de cadenas laterales
denominadas “escalas de hebras cruzadas” presentadas en el marco de la hoja β (Figura
2b). Estas escalas de cadenas transversales consisten en la repetición de interacciones de
cadenas laterales que se ejecutan a través de cadenas β dentro de una capa de hoja β (es
decir, paralelas al eje largo de la fibrilla) y surgen de la naturaleza inherentemente
repetitiva del autoensamblaje. Las estructuras recientes de péptidos formadores de
fibrillas cortas demuestran que estas filas adyacentes de cadenas laterales de cadenas
cruzadas ocurren independientemente de la secuencia peptídica, y forman motivos
parecidos a canales extendidos a lo largo de las superficies de fibrillas expuestas a
solventes a las que se podrían unir los colorantes lineales (Figura 2b). Por lo tanto, la
unión de ThT a la superficie de la lámina β a lo largo de los canales formados por escalas
de cadenas cruzadas racionalizaría la capacidad de ThT para unirse a muchos
autoensamblajes de péptidos.
Utilizando microscopía de fluorescencia polarizada, Krebs et al revelaron que las moléculas ThT
unidas a las fibrillas están alineadas paralelas al eje largo de la fibra. Es importante destacar que
las escalas de hebras transversales también están alineadas en paralelo al eje largo de la fibra, y
por lo tanto estos resultados se presentan entre las pruebas más tempranas de que las
orientaciones regulares de las cadenas laterales en las fibrillas podrían ser el motivo de
reconocimiento común que subyace a la amplia gama de amiloides de ThT. tinción. Sin embargo,

10
la resolución de la microscopía de fluorescencia es insuficiente para dilucidar los detalles
atómicos de las interacciones ThT-fibrilla. Un modelo de canal similar para tintes grandes y
lineales, como el rojo Congo, se sugirió desde 1974.
5. Modelo autoasociación de unión a ThT
Teorías alternativas de unión a ThT han enfatizado la capacidad de ThT para la
autoasociación. Khurana et al señalaron que la mayoría de los experimentos que emplean
ThT se realizan en o por encima de la concentración micelar crítica (CMC) del colorante,
estimada en ~ 4 μM en agua. Por lo tanto, plantearon la hipótesis de que la tinción de
amiloide por ThT es en gran medida el resultado de interacciones hidrófobas entre las
micelas de amiloide y ThT. Sin embargo, los informes posteriores han argumentado que
el CMC en condiciones similares es de ~ 30 μM, y por lo tanto las micelas no deberían
existir bajo las concentraciones de ThT utilizadas comúnmente. Una teoría emergente
más matizada propuesta por Groenning et al sugiere que la ThT puede unirse como
dímeros excitados ("excímeros") a grandes cavidades hidrófobas dentro de las
fibrillas. Sin embargo, ninguno de estos modelos alternativos puede explicar
completamente el sesgo quiral del ThT unido ni su preferencia de unirse en paralelo al
eje largo de las fibrillas. Además, el análisis de la cooperatividad de unión a ThT sugiere
que las moléculas de ThT independientes a menudo se unen en un solo tipo de sitio. Si
bien los modelos de autoasociación pueden explicar algunos aspectos de la tinción
promiscua de ThT, son inconsistentes con numerosos trabajos recientes que detallan las
interacciones moleculares específicas de ThT con la superficie de la fibrilla.
6. Estudios a nivel atómico de las interacciones ThT- fibrillas
Sigue habiendo una escasez de datos experimentales que han determinado directamente
los modos de interacción fibril-dye a nivel atómico. Las fibrillas y otros autoensamblajes
de péptidos son insolubles y, a menudo, heterogéneos en su composición, lo que hace que
sea extremadamente difícil caracterizar sus interacciones con ligandos utilizando técnicas
de alta resolución como la cristalografía de rayos X y la espectroscopia de RMN de
solución. Además, la modesta afinidad de estos colorantes a las fibrillas puede impedir la
recopilación e interpretación de datos biofísicos. Por lo tanto, no ha habido estructuras
experimentales de ThT ni ningún otro colorante unido a fibrillas. Los enfoques para
superar estos obstáculos experimentales han sido dobles: in silicosimulación de la unión
ThT, y la aplicación de sistemas de autoensamblaje más pequeños y más susceptibles a
los experimentos. Ambas metodologías han proporcionado una visión considerable del

11
mecanismo de unión de ThT y han definido los requisitos mínimos para las superficies
competentes de unión de ThT.
7. Simulaciones de dinámica molecular demuestre enlaces ThT en canales de cadena
lateral
Las simulaciones computacionales permiten que las fibrillas de amiloide estructuralmente
complejas se diseccionen en modelos minimalistas manejables que eliminan de manera
efectiva los conjuntos incontrolables que plagan los estudios experimentales. Wu et
al han investigado exhaustivamente las bases mecanísticas de las interacciones amiloide-
colorante utilizando esta estrategia de simulación de dinámica molecular (Figura 4a y
4b). Para sus simulaciones, Wu et al construyeron segmentos de ocho cadenas de
protofibrillas cruzadas de bicapa de la secuencia peptídica KLVFFAE basadas en las
estructuras atómicas de péptidos cortos que forman fibrillas. Debido a que los amiloides
son estructuralmente repetitivos, incluso un pequeño segmento de hoja β puede capturar
efectivamente las propiedades de una superestructura de fibrillas mucho más
grande. Estas simulaciones permitieron así a Wu et al examinar la unión de ThT a tres
motivos comunes en estructuras similares a fibrillas: bordes de lámina β expuestos, una
superficie de lámina β extendida, así como la interfaz laminada de “cremallera estérica”
entre las hojas β. La unión a ThT se realizó colocando los modelos de protofibrillas en
una caja de agua periódica con ~ 9100 moléculas de agua, cuatro moléculas de ThT y
cuatro iones de cloruro neutralizantes. Se realizaron simulaciones de dinámica molecular
a 320 K a lo largo de 20 ns, y las poblaciones unidas resultantes de ThT se agruparon para
revelar sitios preferenciales para las interacciones de colorante.

12
Figura 4:
Investigaciones de resolución atómica de los sitios de unión de ThT y las interacciones
de la hoja ThT-β.
( a ) y ( b ) Unión de ThT a la protofibrilla KLVFFAE sondada usando simulaciones de
dinámica molecular. Solo se muestran las caras de la lámina β de la protofibrilla, ya que
ThT no se unía apreciablemente entre las láminas β laminadas. (a) Unión de ThT a la cara
“LFA” de la lámina β de protofibrillas. La estructura de la estructura inicial se muestra a
la izquierda, con la cadena β inferior marcada para distinguir las cadenas laterales en la
parte delantera (letras grandes) y en la parte posterior (letras pequeñas) de la hoja β. Las
poblaciones agrupadas de moléculas ThT unidas se muestran en el centro. Los
identificadores de aminoácidos de las escaleras de cadena lateral "LFA" en esta cara se
muestran a la derecha. Las cadenas laterales son de color azul para positivo, rojo para
negativo y negro para hidrofóbico. La columna vertebral se muestra en la representación
de dibujos animados. (b) Unión de ThT a la cara de hoja beta “EFVK” de la protofibrilla,
como se muestra en (a).
( c ) Estructura cristalina del andamio pímico de autoensamblaje (PSAM) que muestra la
lámina β central cubierta por los dominios N y C terminales (PDB 3EC5). Se muestran
las identidades de aminoácidos de las escalas de cadenas cruzadas de tipo salvaje, así
como las escalas diseñadas en los mutantes 3-YY / LL, 4-YY / LL y 5-YY / LL. La fuerza

13
relativa de las interacciones de estos PSAMs con ThT (según lo determinado por la
intensidad de fluorescencia y K d ) se indican a continuación.
( d ) Vista ampliada de la hoja β de unión a ThT de la PSAM 5-YY / LL. Las identidades
de aminoácidos de las escalas diseñadas se dan en (c). Las cadenas laterales de los
residuos diseñados del sitio de unión de ThT se muestran como palos. Estos residuos y
sus superficies expuestas al solvente son de color azul para Tyr y verde para Leu, mientras
que las cadenas laterales de tipo salvaje están en gris oscuro. Las dos moléculas de PEG-
400 encontradas cerca del sitio de unión a ThT se muestran como palos rojos.
( e ) Las conformaciones de cadena lateral de las escalas de PSAM implicadas en la unión
a ThT. Las escaleras se muestran mirando hacia abajo el eje largo del PSAM desde el
extremo C al extremo N (arriba) y mirando hacia abajo en la hoja β (parte inferior). La
columna vertebral está representada en forma de caricatura, con giros omitidos para
mayor claridad. A la derecha se muestra una orientación de unión para ThT determinada
por simulación de dinámica molecular. Los elementos de carbono, nitrógeno y azufre de
ThT están en blanco, azul y amarillo, respectivamente.
( f ) El segmento de hoja β del PSAM utilizado para simulaciones de dinámica molecular
de la unión de ThT. Los dominios N y C-terminal se omitieron para reducir el costo
computacional, ya que estos dominios se han demostrado experimentalmente que no se
unen a ThT. Los residuos aromáticos se muestran en verde, los residuos hidrófobos son
grises, los residuos cargados positivamente son azules y los residuos cargados
negativamente son rojos.
( g ) Modos de enlace de ThT dentro de un canal diseñado. Cuatro grupos están ubicados
en: el surco de sombra formado por cadenas laterales continuas de Tyr (Sitio a); en la
parte superior de la cadena β 3-5 (sitio b) y en los dos bordes de la hoja β (sitios c y d). Las
moléculas ThT están representadas por líneas. El sitio a es el más poblado y más
favorecido energéticamente de estos sitios, y corresponde precisamente a las mutaciones
de unión a ThT diseñadas.
( h ) Vista lateral de la simulación de unión de ThT al PSAM, que muestra que ThT se
une principalmente a la cara hidrofóbica aromática diseñada de la lámina β. Casi no se
observa unión en la superficie cargada opuesta de la hoja β (cada punto negro representa
un ligando). El extremo N de la hoja β se muestra como una bola roja.

Los resultados de las simulaciones de ThT han proporcionado un fuerte soporte para el
modelo de canal, demostrando que los tintes lineales se unen en paralelo al eje largo de
la superficie de la fibrilla en los surcos formados por escalas de cadenas laterales (Figura
2a y 2b). Curiosamente, la unión entre las láminas rara vez se observó, probablemente
debido a que la estabilidad de la cremallera estérica hidrófoba presente entre las láminas
β impidió la intercalación del tinte. Las interacciones con los bordes de la lámina también
fueron menos comunes que las observadas a lo largo de la superficie plana de la lámina
β. Además, se encontró que ThT se enlaza y se disocia rápidamente de la superficie de la
fibrilla, de acuerdo con la K d moderada de los colorantes amiloides. Entre los puntos de
vista más sorprendentes se encontraba la observación de que ThT no se unía
uniformemente a la superficie de la hoja β, sino que interactuaba preferentemente con
canales formados por residuos aromáticos (por ejemplo, un motivo de hebra cruzada Val-

14
Phe; (Figuras 3a y 3b ). Estos resultados demuestran que existen sitios puntuados con alta
afinidad de ThT en las fibrillas amiloides. Por lo tanto, los surcos expuestos en la
superficie revestidos con aminoácidos aromáticos pueden ser un elemento común entre
muchas fibrillas que se pueden teñir con ThT.
8. Los imitadores de autoensamblaje de péptidos (PSAM) definen
experimentalmente un sitio de unión ThT minimalista
En una serie paralela de experimentos, Biancalana et al diseñaron un conjunto de nuevas
proteínas de unión a ThT para definir los requisitos mínimos para la unión de ThT. Estas
proteínas se basaron en el sistema modelo pímico de autoensamblaje (PSAM) (Figura
4c), que son proteínas recombinantes altamente estables, monoméricas y solubles en
agua. Los PSAM se derivan de la proteína de superficie externa Borrelia A (OspA), que
contiene una lámina β plana de capa única cubierta en cada extremo con dominios
globulares. Las proteínas de unión a ThT se diseñaron utilizando un andamio PSAM en
el que tres copias de una horquilla β endógena se copiaron y se volvieron a insertar en la
lámina β central, formando así una lámina con cuatro horquillas β homólogas que
comprenden ocho hebras β (es decir, "OspA + 3bh"). Los PSAM capturan las
características fundamentales y repetitivas de una superficie de lámina β similar a una
fibrilla en una proteína soluble en agua que se adapta fácilmente al análisis biofísico,
incluida la cristalografía de rayos X. Es importante destacar que el PSAM permite la
introducción de cambios precisos de aminoácidos sin afectar la alineación global de la
hoja β, porque todas las cadenas β adyacentes están conectadas covalentemente.
Biancalana et al diseñaron un sitio de unión de ThT minimalista en los PSAM utilizando
los principios combinados establecidos mediante el análisis computacional y
macroscópico de las interacciones de ThT (Figura 4c). El PSAM de tipo salvaje contiene
una serie de escalas de aminoácidos altamente cargadas y se encontró que no se unía
apreciablemente a ThT, de acuerdo con la pobre afinidad de ThT con muchas fibrillas
altamente cargadas (Figura 4c). La mutagénesis sistemática permitió la introducción de
una serie de escalas de cadenas cruzadas que contienen aminoácidos hidrófobos y
aromáticos (Figura 4c), que se encuentran comúnmente en los péptidos formadores de
fibrillas y se observaron como un sitio de unión ThT principal en simulaciones. En última
instancia, las escaleras adyacentes (lado a lado) formadas a partir de Tyr y Leu generaron
un sitio de enlace ThT de alta afinidad (K d ~ 2 μM) que recapituló todas las
características del enlace ThT a las fibrillas, incluida la fluorescencia intensa y el efecto
Cotton (Figura 4d y 4e). Además, el análisis estequiométrico demostró que ThT se unía

15
al sitio Tyr-Leu como una molécula única y discreta, a diferencia de una micela o un
dímero.
La estructura cristalina de la PSAM de unión a ThT en ausencia de ThT reveló un surco
poco profundo formado por conformadores alternos de anillos aromáticos Tyr,
estabilizados por interacciones de empaquetamiento con residuos de Leu adyacentes
(Figura 4d y 4e). Desafortunadamente, la competencia directa aparente entre ThT y el
polietilenglicol (PEG) utilizado para la cristalización impidió la visualización de las
interacciones de ThT con la superficie de la lámina β (Figura 4d).
El análisis de dinámica molecular posterior del PSAM en presencia de ThT permitió la
primera aplicación de simulaciones de unión de tinte a un sitio de unión ThT discreto y
bien definido. El enfoque híbrido experimental y computacional empleado para estudiar
los PSAM ha proporcionado un vínculo importante entre las simulaciones de unión de
tinte y las hipótesis probables experimentalmente. Las simulaciones de dinámica
molecular se realizaron de una manera similar a la de las protofibrillas KLVFFAE de
ocho cadenas descritas anteriormente. Para maximizar la eficiencia computacional, se
eliminaron los dominios globulares N y C-terminales de los PSAM, ya que se ha
demostrado experimentalmente que no se unen a ThT. El sistema inicial estaba
compuesto por una caja de agua periódica que contenía ~ 5600 moléculas de agua, la
lámina β plana de PSAM "extirpada", dos moléculas ThT y dos iones de cloruro
neutralizantes. Las simulaciones se realizaron a 310 K durante 100 ns, y las poblaciones
resultantes de moléculas ThT unidas se agruparon en modos de unión
predominantes. Estas simulaciones demostraron que ThT se une principalmente al sitio
diseñado a lo largo del surco poco profundo formado por cadenas laterales de Tyr,
haciendo contactos sutiles con la escalera Leu adyacente ( Figura 4f-4h , Sitio a). La
sorprendente similitud entre el Val-Phe y Tyr-Leu. Los motivos de unión a ThT
observados en las simulaciones ofrecen soporte para la validez y potencia de tales modos
de unión a ThT mediada por aromáticos. Estos resultados sugieren fuertemente que los
canales de exposición a la superficie ricos en aminoácidos aromáticos son los principales
sitios de unión de ThT. Juntos, los hallazgos racionalizan el amplio espectro de unión de
ThT hacia diversas fibrillas.
9. Requisitos de tamaño para los sitios de unión ThT.
El sistema PSAM ha sido excepcionalmente poderoso en la definición de los requisitos
de tamaño mínimo para la unión a ThT debido a la facilidad con la que se pueden producir
sitios de unión a ThT de diferentes tamaños a través de la mutagénesis dirigida al

16
sitio. Aunque un trabajo reciente ha arrojado una visión de resolución atómica de los
autoensamblajes microcristalinos, que en principio podrían usarse como estructura de
partida para experimentos de mutagénesis sistemática para la unión a ThT, las
propiedades de la superficie de las subunidades peptídicas cortas no pueden manipularse
precisamente sin interrumpir, desestabilizar o alterando el modo de montaje. En contraste,
debido a que el andamio PSAM es altamente estable y monomérico, las mutaciones
puntuales se pueden usar con confianza para manipular un sitio de unión a ThT localizado
y bien definido sin alterar la estructura del polipéptido general. Biancalana et al
determinaron el sitio de unión mínimo para ThT mediante la disección sistemática de un
canal largo compuesto de Tyr y Leu en sitios de unión secuencialmente más cortos
(Figura 4c). Los motivos de unión a ThT más cortos se generaron al revertir las escaleras
Tyr y Leu a los residuos de aminoácidos cargados (Lys y Glu) encontrados en el PSAM
de tipo salvaje que no mostraba unión a ThT detectable. Estos experimentos han
demostrado que el sitio de enlace mínimo para ThT que recapitula todos los sellos
distintivos y K d típicola unión de ThT a las fibrillas se compone de un canal a través de
cinco o más cadenas β de una superficie plana de lámina β (Figura 4c-4e).
Las simulaciones de dinámica molecular de la unión de ThT al motivo Tyr / Leu del PSAM
(Figura 4g , Sitio a) demostraron que las moléculas ThT unidas se dispersan mediante una
traducción longitudinal a través de los cinco residuos de Leu y Tyr con una magnitud de
hasta el espaciado entre cadenas β adyacentes. La falta de una única orientación preferida
de ThT dentro de este sitio indica que el surco a través de cinco pares de residuos de hebra
cruzada es ligeramente más largo que el sitio de unión de ThT mínimo. La longitud de
cabeza a cola de ThT (• 15 Å) es de hecho más representativa de la distancia Cα-Cα de
una escalera de cuatro residuos (• 14 Å) en lugar de una escalera de cinco
residuos. Aunque Biancalana et al. Han demostrado que un PSAM que contiene una
escalera Tyr / Leu similar a través de solo cuatro cadenas β se une a ThT débilmente, es
probable que este efecto haya sido causado por los aminoácidos cargados utilizados para
reemplazar los residuos Tyr y Leu. Por lo tanto, los resultados de estas simulaciones
sugieren que, en ausencia de interacciones electrostáticas repulsivas, ThT puede unirse a
un surco mínimo formado a partir de cuatro residuos de cadenas transversales aromáticas-
hidrófobas. Debido a que estos resultados establecen un umbral estructural mínimo para
la unión a ThT de alta afinidad, deberían facilitar la interpretación de los datos de unión
a ThT en términos moleculares. El conocimiento obtenido de los estudios de PSAM

17
puede ser útil para definir mejor la estructura de pequeños autoensamblajes y oligómeros
de proteínas.
Los requisitos de tamaño descritos anteriormente también racionalizan por qué ThT no
se une a la mayoría de las proteínas globulares ricas en hoja β. Las proteínas globulares
típicas contienen láminas β altamente retorcidas que consisten en menos de cuatro
cadenas β, que por lo tanto están demasiado distorsionadas y son demasiado cortas para
formar motivos de unión a ThT adecuados. Sin embargo, el autoensamblaje de proteínas
de tipo nativo puede dar lugar a grandes estructuras fibrilares capaces de unirse a ThT,
como se observa para la β2-microglobulina y la transtiretina. Aunque las superficies de
la hoja β encontradas en las estructuras nativas de estas proteínas de agregación a menudo
tienen solo tres cadenas β de ancho y, por lo tanto, son incapaces de unirse a ThT, cuando
se ensamblan en el contexto de fibrillas, estas proteínas crean superficies de hoja β
extendidas y planas que formar un motivo de unión a ThT.
10. Preferencias de secuencia en sitios de unión ThT.
A pesar de su capacidad para unirse a una variedad extraordinaria de amiloide, ThT posee
algún nivel de especificidad de secuencia de aminoácidos. La identificación de motivos
de aminoácidos capaces de unirse a ThT se ha ayudado inmensamente por la comprensión
atómica de las interacciones ThT-fibrilla, que han demostrado que el comportamiento de
unión a ThT de una fibrilla a menudo se correlaciona con las propiedades químicas de
determinadas escalas de cadenas cruzadas. Muchas interacciones con ThT están mediadas
predominantemente por aromáticos cadenas laterales, particularmente Tyr y Phe. Los
residuos aromáticos presentan grandes superficies hidrófobas a lo largo de las cuales se
puede unir la ThT y, además, su capacidad para apilar π con el colorante puede ser un
componente clave de muchas interacciones de unión del colorante. En el caso de los
PSAM, aunque los conformadores Tyr alternos formaron la mayor parte del sitio de unión
al tinte, la escala Leu (que reemplazó los residuos cargados) también fue fundamental
para generar una fuerte afinidad con ThT. Estos resultados demuestran que las
interacciones de cadena lateral en los sitios de unión de ThT probablemente sean
cooperativas y, en ocasiones, difíciles de predecir.
Por el contrario, también se han propuesto una serie de características generales para las
fibrillas con poca capacidad para unirse a ThT. El hecho de que las fibrillas altamente
cargadas, como las poli-Lys, no se unan apreciablemente a ThT es probable que se deba
a la repulsión electrostática. La mutagénesis puntual precisa en el sistema PSAM ha
demostrado además que los aminoácidos cargados son particularmente eficaces en la

18
ablación de la unión a ThT (Figura 4g). Estos resultados son consistentes con la
dependencia observada de la afinidad de ThT en las condiciones experimentales. Por
ejemplo, la afinidad de ThT es menor a pH ácido que a pH neutro, probablemente debido
a la repulsión electrostática del colorante por un aumento en la carga positiva. En
consecuencia, la reducción de la afinidad a pH ácido se puede superar mediante el blindaje
de cargas similares entre el tinte y la fibrilla aumentando la fuerza iónica. Estas
consideraciones han sido revisadas a fondo en otra parte. La interpretación correcta de los
resultados obtenidos a través de la tinción de ThT requiere una comprensión íntima de la
base mecánica por la cual ThT reconoce las características estructurales del amiloide.
11. Unión ThT a estructuras no fibrilares
A pesar de su utilidad demostrada como mancha de amiloide, las preocupaciones
continuas sobre la reactividad cruzada potencial de ThT han llevado a varios estudios
importantes a probar su especificidad. En particular, la capacidad de ThT para unirse a
las bolsas hidrófobas en proteínas globulares ha sido ampliamente caracterizada. La
estructura cristalina de ThT unida a la acetilcolinesterasa demostró que el colorante se
une en un sitio formado principalmente por hélices α, en un contraste sorprendente con
las fibrillas β cruzadas (Figura 3). Curiosamente, casi todos los contactos con ThT estaban
mediados por residuos aromáticos en el bolsillo de unión, incluido el apilamiento extenso
de π con Tyr y Trp (Figura 3b). Por lo tanto, la estructura tiene una gran semejanza con
el canal rico en Tyr del PSAM de unión a ThT, en particular la hendidura de unión creada
por las orientaciones ortogonales de los anillos aromáticos adyacentes (Figura 4e). Un
modelo de rojo de Congo unido paralelamente a las cadenas β de un dímero de insulina
porcina contenía una gran cantidad de interacciones aromáticas entre la molécula de tinte
y las cadenas laterales de Tyr / Phe, aunque debe observarse que las moléculas de tinte se
podrían modelar solo con una Ocupación extremadamente baja de ~ 3%, lo que arroja
una duda significativa sobre la validez de este modelo estructural. También se ha
demostrado que ThT se une a una bolsa hidrófoba de albúmina de suero humano con
afinidad comparable a muchas moléculas de tipo farmacológico. La capacidad de ThT
para interactuar con las bolsas hidrófobas en proteínas no fibrilares también puede
racionalizar su capacidad para unirse en cavidades entre protómeros de fibrillas de
insulina. Estas observaciones enfatizan que es esencial verificar que la ThT no tiñe los
materiales de partida cuando se usa como informador de fibrilación, especialmente en
casos de fibrillas formadas a partir de asociaciones de proteínas globulares.

19
12. Implicaciones de los modelos anatómicos de la unión a ThT en el uso de
colorantes amiloideos.
En conjunto, las descripciones a nivel atómico del modelo de canal de enlace ThT han
resaltado una serie de consideraciones importantes para el uso de ThT. Está claro que se
debe tener especial cuidado cuando se usa ThT en presencia de otros colorantes amiloides
o inhibidores, ya que estos compuestos a menudo tienen sitios de unión superpuestos a lo
largo de la superficie de la fibrilla, o propiedades espectroscópicas que interfieren con la
capacidad de tinción de ThT. Se puede encontrar un ejemplo especialmente engañoso en
el caso de la rifampicina, un antibiótico rico en aromáticos, que elimina completamente
la unión de ThT a las fibrillas de amiloide de los islotes sin alterar su estructura. Se ha
demostrado que la unión de ThT está inhibida por reactivos comunes como el glicerol, el
PEG y el colorante hidrofóbico bis-ANS, así como por los polifenoles resveratol y
curcumina. Por lo tanto, la disminución dramática en la unión de ThT en presencia de
estos compuestos probablemente se deba a la competencia directa por los sitios de unión
comunes dentro de los canales en la superficie de la fibrilla, en lugar de la disociación de
las propias fibrillas. Como se muestra por la estructura cristalina del PSAM de unión a
ThT, las moléculas de PEG bien ordenadas dentro del canal de la hebra cruzada ocluyeron
el sitio de unión de ThT. Por lo tanto, las pantallas para los nuevos inhibidores de amiloide
deben realizarse con extrema precaución si se emplea la fluorescencia ThT como método
de detección.
ThT ha sido históricamente considerado como un reportero amiloide pasivo que no
muestra una influencia apreciable en el tamaño, la morfología o la tasa de crecimiento de
las fibrillas amiloides. Sin embargo, la pasividad de ThT como colorante amiloide a
menudo parece ser asumida en lugar de demostrada. De hecho, solo se han utilizado
conjuntos de datos dispersos en un número limitado de sistemas de fibrillas para justificar
las perturbaciones mínimas de la estructura amiloide inducida por el tinte. Dado que ThT
tiene una similitud estructural con muchos inhibidores amiloides, ya que contiene
múltiples anillos aromáticos, es muy posible que ThT influya en la formación de
fibrillas. Compuestos similares, como el rojo Congo, han mostrado en diversos grados
una capacidad para mejorar e inhibir la formación de fibrillas, comprometiendo
potencialmente su objetividad como herramientas de diagnóstico. La unión preferencial
de ThT a las superficies de la lámina β también sugiere que la ThT puede interferir con
la laminación de la lámina β necesaria para la formación de fibrillas. Por lo tanto, se

20
requieren estudios más cuidadosos para determinar el grado en que la ThT influye en la
estructura y cinética de las fibrillas.
13. Conclusiones y perspectivas de futuro.
Durante más de 50 años, el éxito de ThT como colorante amiloide ha resultado de su
amplia capacidad de tinción, extraordinaria sensibilidad y facilidad de uso. Estas
consideraciones lo han convertido en uno de los tintes más utilizados para monitorear la
formación de amiloides. Las robustas propiedades de tinción de ThT siguen siendo la
base de métodos innovadores para la detección y análisis de fibrillas tanto in vitrocomo in
vivo.. Se necesitan investigaciones adicionales sobre el mecanismo molecular de las
interacciones ThT para avanzar en nuestra comprensión de la formación de amiloide, la
cinética, la estructura y la patogénesis. Las perspectivas de tales investigaciones ayudarán
a quienes diseñan sondas amiloides y a quienes las aplican en entornos de investigación
y diagnóstico. El reciente estudio intenso del mecanismo molecular de la unión de ThT
sugiere que puede ser posible aplicar un diseño guiado por estructura para modular la
especificidad de ThT a fibrillas de amiloide particulares. Además, como colorante
amiloide representativo, entender las interacciones de la TH en detalle atómico guiará las
terapias para tratar las enfermedades amiloides.

21
 LINKOGRAFÍA

 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2880406/
 https://en.wikipedia.org/wiki/Thioflavin
 https://www.xatakaciencia.com/salud/tioflavina-t-y-dura-y-dura
 https://books.google.com.pe/books?id=v3WYlx7FCHAC&pg=SL26-PA88&lpg=SL26-
PA88&dq=TIOFLAVINA&source=bl&ots=No1dKBEdw-
&sig=4JbErhjBEn7VZYOOiyOQiMxcxPc&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwiZ_dqvtozfAhXp1
FkKHe3JDbIQ6AEwDXoECAoQAQ#v=onepage&q=TIOFLAVINA&f=false

22