CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ SU COLONNA SEPHAROSO CN-Br + SpecAg

Reagenti

Washing buffer: Tampone Sodio fosfato 20 mM pH 7.4

(è possibile preparare uno stock 10x e diluire di volta in volta)

Elution buffer: Glicina 100 mM pH 2.8

Campione: il preparato da cui eluire antibodies verso SpecAg.

Procedura

Lavare la colonna con 10 vol di Washing buffer.

Controllare il pH dell’ultimo lavaggio: deve essere intorno a 7.5

Filtrare il campione con filtro 0,45 µm.

Leggere OD280 del campione filtrato azzerando la lettura con PBS.
Applicare il campione sulla colonna, recuperare il flow through (FT) e ripassarlo 4-5 volte.
Raccogliere il FT e tenerlo da parte.

Lavaggi

Lavare la colonna con 10 vol di washing buffer.

Tenere da parte i primi 2 ml di lavaggio, eliminare il resto.
Al termine dei lavaggi, leggere OD280 dell’ultimo ml di lavaggio colonna.
Se OD280<0,02 procedere con l’eluizione, altrimenti continuare i lavaggi.

Eluizione

Preparare 10 provette numerate con 25-50 µl di Tris 1 M pH 11.

Eluire dalla colonna con 0,5-1 ml e raccogliere nelle 10 provette precedentemente preparate.
Leggere allo spettrofotometro la OD280 azzerando con 0,5 ml Elution buffer + 25 µl Tris 1 M
pH 11.
Tenere gli eluati con OD280>0,080 e unire gli eluati con OD simile

Dialisi

Bollire tubi da dialisi in H2O deionizzata per circa 20 min.

Lavare bene il tubo fuori e dentro
Inserire il campione e dializzare contro PBS o.n +4°C, in agitazione lenta.