PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS.

RECUENTO DE COLONIAS CON ASA CALIBRADA.

Maycol Andrade (218095012); Karen Jaramillo(218095141);
Johan Mejía (218095177); Camilo Obando (218095226); Laura Valdés (218095337)
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Nariño,
Sede Torobajo.

RESUMEN

El objetivo de este laboratorio fue conocer e identificar los géneros y especies de la familia de
enterobacterias y hacer un recuento de colonias con asa calibrada. En el laboratorio se llevaron
a cabo, la primera en la que los microorganismos cultivados en EMB como Salmonella, Kebsiella,
E. Coli y Proteus se aplicó pruebas bioquímicas como: TSI, LYS, UREASA, MIO Y CITRATO, también
se llevó el cultivo al medio CLED para el recuento de colonias. Los resultados obtenidos para
estos microorganismos se presentan en las tablas y el recuento de colonias. Por consiguiente,
se realizó la interpretación de cada prueba que permitió conocer cualitativamente las
propiedades bioquímicas del microorganismo estudiado, y cuantitativamente el recuento de
colonias.

PALABRAS CLAVE: Enterobacteriaceae, Salmonella, Escherichia Coli, Proteus, Kebsiella,

pruebas bioquímicas.

INTRODUCCION

Enterobacterias:

Esta familia comprende un número muy
variado de géneros y especies bacterianos
cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del
hombre y los animales. No todos los bacilos
Gram negativos que tienen este hábitat
forman parte de la familia
Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el
suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas
y en los animales desde los insectos al
hombre. La familia está definida por un
conjunto de características fenotípicas
(bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas) a
las que se han agregado posteriormente
otros elementos establecidos por técnicas
de hibridización de ácidos nucleicos que
miden distancias evolutivas y han definido
mejor la interrelación de todos los
microorganismos integrantes de la familia.
Son bacilos Gram negativos rectos, con un
diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son móviles,
presentan flagelos perítricos. No forman
esporos. Desarrollan en presencia o en
ausencia de Oxígeno (aerobios-anaerobios
facultativos). Desarrollan rápidamente en
medios simples, no siendo exigentes desde
el punto de vista nutricional. Algunos
desarrollan en glucosa como única fuente
de carbono, mientras otros requieren el
agregado de vitaminas y/o minerales en el
medio de cultivo. Son quimioorganotrofos,
poseen metabolismo fermentativo y
respiratorio. Son catalasa positivos y
oxidasa negativos; reducen los nitratos a
nitritos. El contenido de Guanina + Citosina
del DNA total es de 38 a 60 moles %. En los
medios de cultivo forman colonias lisas,
convexas y circulares de bordes definidos.
Algunas especies desarrollan colonias más
mucoides que otra (por ejemplo la - La investigación de la utilización de un
Klepsiella). substrato como única fuente de C.

Caracteres bioquímicos Factores determinantes de patogenicidad

Los bacilos Gram negativos que integran -La cápsula tiene propiedades de adhesina y
esta Familia pueden identificarse por medio es antifagocitaria.
de la expresión fenotípica de algunos
- Las fimbrias permiten la adherencia a la
caracteres genéticos. Los métodos
célula huésped e impiden el barrido por las
utilizados tienen como principio:
barreras mecánicas de defensa del
- La investigación de la fermentación de organismo..
azucares o alcoholes en un medio
-Exotoxinas: no todas las especies las
peptonado con el agregado de un indicador
producen. Sólo son producidas por las
de pH para detectar la producción de
patógenas obligadas y poseen efectos
metabolitos ácidos.
específicos. [1]

METODOLOGIA

De estos mismos caldos tomar una

Siembra bacilos Gram Negativos asada con el asa calibrada para
en EMB, incubar por 24 horas a 37°C. recuento de colonias e inocular cuatro
estrías por agotamiento en agar CLED.
Incubar por 24 horas a 37°C.

De las colonias lactosa positivas, aisladas de manera axénica,

sembrar en las siguientes pruebas bioquímicas:

TSI-GAS- PRODUCCION DE H2S

LISINA DESCARBOXILASA.

UREA DE CHRISTENSEN.

MIO: MOVILIDAD, INDOL,

ORNITINA.

CITRATO DE SIMMONS.
Imagen 1: Resultados para proteus y salmonella en medio CLED

Imagen 2: Recuento de colonias para Proteus (lactosa negativa).

Raya N⁰1: 6cm completa

Raya N⁰2: 8,5 cm completa

Raya N⁰3: 8,5 cm completa

Raya N⁰4:8.0 cm completa

Determinación de No de UFC a partir de un asa calibrada (10 microlitros)

Estría No 1: 6 cm (completa), teniendo en cuenta que una estría completamente formada

equivale a 25000 UFC o 25x103 se tomara como base para realizar los respectivos cálculos
siendo la estría más larga de 8,5 cm será tomada como referencia, la cual poseen 25000 UFC.
 25𝑥103 𝑥6 18𝑥103
NoUFC = 8,5
=18x103UFC/0.01 ml 1𝑥10−2
= 18𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 2: 8,5 cm (completa) de la misma manera, está al ser la estría más grande y completa
equivale a 25x103 UFC en 0,01 ml lo que será la referencia para las demás.
25𝑥103
1𝑥10−2
= 25𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 3: 8,5cm (completa), de igual forma que la anterior, al ser de las mismas
proporciones y tamaño que la anterior esta también equivale a 25x103UFCen 0,01ml que será
usado como referencia para las demás
25𝑥103
= 25𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙
1𝑥10−2

Estría No 4: 8,0 cm (completa),usando la misma relación, que fue usada en el estriado 1 se

realizara el mismo procedimiento
25𝑥103 𝑥8 23,5𝑥103
NoUFC = 8,5
=23,5x103UFC/0.01 ml 1𝑥10−2
= 23,5𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Imagen 3: Recuento de colonias para Salmonella.

Raya N⁰1: 5,6cm total – 0.5(fragmento pequeño de la línea)cm incompleta

Raya N⁰2: 7,5 cm completa

Raya N⁰3: 8,5 – 0.1 cm incompleta

Raya N⁰4:7,0cm completa

Estría No 1: 5,6 cm (incompleta un fragmento pequeño), teniendo en cuenta que una estría
completamente formada equivale a 25000 UFC o 25x103 se tomara como base para realizar los
respectivos cálculos siendo la estría más larga de 7,5 cm será tomada como referencia, la cual
poseen 25000 UFC.
25𝑥103 𝑥5,6 19𝑥103
NoUFC = 7,5
=19x103UFC/0.01 ml 1𝑥10−2
= 19𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 2: 7,5 cm (completa) de la misma manera, está al ser la estría completa equivale a
25x103 UFC en 0,01 ml lo que será la referencia para las demás.
25𝑥103
1𝑥10−2
= 25𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 3: 8,5cm (incompleta), de igual forma, a pesar de ser la más larga no es la más
completa por ende se realizará el mismo procedimiento que el anterior lo cual debería ofrecer
resultados más grandes que la estría referencia.
25𝑥103 𝑥8,5 28,3𝑥103
NoUFC = 7,5
=28,3x103UFC/0.01 ml 1𝑥10−2
= 28,3𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙

Estría No 4: 7,0 cm (completa),usando la misma relación, que fue usada en el estriado 1 se

realizara el mismo procedimiento
25𝑥103 𝑥7 23,3𝑥103
NoUFC = =23,3x103UFC/0.01 ml = 23,3𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙
7,5 1𝑥10−2

PRUEBAS BIOQUIMICAS

El análisis cualitativo para las pruebas bioquímicas se empezó haciendo una clasificación de las
pruebas aplicadas de TSI, CITRATO, UREASA, LISINA, MIO. para cuatro especies de
Enterobacteriaceae (E. Coli, Salmonella, Kebsiella, Proteus), se profundizó en que consiste en
cada prueba con el fin de realizar un análisis para cada especie de enterobacterias.

Tabla 1: Propiedades bioquímicas de Enterobacteriaceae.

REACCION E. Coli Salmonella Kebsiella Proteus

TSI A/K K/A A/A K/A
TSI(H2S) N N N P
GAS P P P N
C. SIMONS N P-N P P-N
LIS K/A K/A A/A K/A
UREASA N N P P
MOVILIDAD P P P P
INDOL N N N N
ORNITINA P N P P
K: reacción alcalina- A: reacción acida- P: Resultado Positivo – N: Resultado negativo.
 Tabla 2. Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Escherichia Coli.

TSI CITRATO UREA LIS MIO

Escherichia Coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo con un metabolismo tanto
fermentativo como respiratorio. Puede ser inmóvil o móvil por flagelos peritricos. Es miembro
de la familia Enterobacteriaceae, y aunque la mayoría de las cepas de E. coli no son patógenas,
pueden ser patógenos oportunistas que causan infecciones en el hospedador
inmunocomprometido. Fisiológicamente, E. coli es versátil, está adaptado a las características
del hábitat y puede crecer en un medio con glucosa como única fuente orgánica. Puede crecer
en presencia o ausencia de O2 y bajo condiciones anaeróbicas puede proliferar por
fermentación, produciendo una mezcla de ácidos y gas como productos finales. Puede también
crecer por medio de una respiración anaeróbica ya que es capaz de utilizar NO3, NO2 o fumarato
como aceptores finales de electrones mediante procesos respiratorios de transporte de
electrones. [7]

Una vez teniendo el fundamento de la E. Coli se realizó un análisis detallado las diferentes
pruebas, con TSI donde el fondo fue rojo (K: reacción alcanina) y el pico amarillo (A: reacción
acida, lo que significa que fermentó la glucosa, produjo gas que se reflejó en la producción de
burbujas, y no produjo H2S . 2

Con la prueba de citrato se obtuvo color verde (negativo) concluyendo que la E.coli no reacciona
teniendo un compuesto químico como el citrato de sodio como única fuente de carbono y el
fosfato monoámoniaco como fuente de nitrógeno.3

Para la prueba Urea no presentó un cambio de color amarillo a rojo lo que significa que la E. Coli
carece de la enzima ureasa por lo que no le permite liberar amoniaco y CO2..En la prueba lisina
se obtuvo una superficie violeta (K: reacción alcalina) fondo amarillo (A: reacción acida) lo que
concluye que la e. Coli no descarboxila la lisina.5

La prueba para E. Coli donde se puede observar una turbidez en el medio lo que significa que
hay movilidad, para la producción indol no se logró apreciar el anillo rojizo, en la ornitina si se
aprecia un color amarillo fuerte.4
 Tabla 2: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Salmonella

TSI CITRATO UREA LIS MIO

Los miembros del genero salmonella son bacilos Gram-negativos fermentadores de lactosa ,
anaerobios facultativos, no esporulados, generalemnte móviles por flagelos peritricos con la
expecion de salmonella gallinarum salmonella pollorum, responsables de la tifoidea aviar y
pullorosis respectivamente. Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo, fermentan glucosa
con producción de acido y gas.[8]

Ahora bien, en este análisis se hará hincapié en aquellas pruebas que presentaron algún tipo de
confusión en el momento de interpretar sus resultaos, ya que anteriormente se presentó la
clasificación de las pruebas y el análisis respectivo para cada prueba que siguen el mismo
parámetro para todas. En la prueba citrato se pudo observar un azul verdoso, lo que impedía
dar una clasificación si fue negativa o positiva; sin embargo, remitiéndose a literatura se
encontró que la salmonella si puede tener el citrato de sodio como fuente de carbono, sabiendo
esto se esperaría un color azul fuerte, una limitación que se pudo analizar fue el tiempo de
incubación o un error del analista en la técnica de siembra.
Tabla 3: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Proteus.

TSI CITRATO UREA E. MIO LIS

El género Proteus forma parte de la familia Enterobacteriaceae. El Bergey’s Manual of

Deteminative Bacteriology define este género como bacilos gramn egativos, móviles, con
flagelos perítricos, aerobios y facultativos anaerobios. Tradicionalmente a este género se le ha
encuadrado en la tribu Proteae que incluye también a los géneros Providencia y Morganella.
Todos ellos se caracterizan por su capacidad para desaminar la fenilalanina trasformándola en
ácido fenilpirúvico debido a la producción de fenilalanina desaminasa, hidrolizar la tirosina,
desdoblar en casi todos los casos la urea y ser resistentes a la colistina. [9]

En esta especie se presentó al igual que en la Salmonella un verde al fondo y un azul en la

superficie lo que significaría que necesitaba más tiempo para que reaccione completamente.

En la prueba TSI se puede observar el fondo negro lo que significa la producción de H2S.

Tabla 4: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Klebsiella.

TSI CITRATO UREA LIS MIO

 La principal especie de este género es Klebsiella pneumoniae, muy expandida en la naturaleza.
Se la aísla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero también de
aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmóviles, a menudo capsulados. La
cápsula es de naturaleza polisacarídica.. Desde el punto de vista antigénico, es útil en
epidemiología la determinación de los antígenos capsulares. Existen más de 70 tipos capsulares
diferentes. Pueden existir reacciones cruzadas con antígenos capsulares de otras especies
bacterianas. El poseer cápsula otorga a estas bacterias un aspecto colonial mucoide. Se trata de
patógenos oportunistas, pueden provocar diversos cuadros clínicos en el hombre: infecciones
urinarias, bacteriemias, neumonías, infecciones hepato-biliares, etc. Un porcentaje elevado de
aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales, contienen
plásmidos de resistencia a los antibióticos.

En las pruebas bioquímicas para Kebsiella en la prueba lisina no se pudo apreciar el violeta con
mayor concentración, sin embargo, se observó una mínima coloración, lo que puso ocasionar
esto fue que se inoculo de una manera inadecuada.

CONCLUSIONES

 Las pruebas bioquímicas para microorganismos son de vital importancia para

reconocer los géneros y especies de microorganismos, que causan infecciones
en el hombre o animales.
 En la practica realizada existieron confusiones que nos limitaban de una óptima
interpretación de resultados, lo que nos permite concluir que es de vital
importancia conocer el fundamento previamente antes del laboratorio.
 Se pudo comprobar la importancia del recuento de las placas para estimar el número
de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en
condiciones específicas de medio, temperatura y tiempo nutriente. Teóricamente, una
célula viable puede dar lugar a una colonia a través de la replicación.

CUESTIONARIO

1. Cual es papel de las enterobacterias en el tracto intestinal humano

 Los miembros de este grupo forman parte de la microbiota del intestino también
llamados coliformes, Tienen un papel relevante en el desarrollo del sistema inmunitario
del huésped. Sus principales funciones incluyen actividades metabólicas como la
producción de ácidos grasos de cadena corta y la absorción de nutrientes, efectos
tróficos en el epitelio intestinal y en la estructura y la función del sistema inmunitario, y
protegen al huésped frente a la invasión de microorganismos patógenos11;12.

Además de ser la principales bacterias de ser productoras de lactato en diferentes rutas

metabólicas del organismo siendo varias de ellas bacterias lácticas o etanolicas.

2. Por qué se afirma que algunas enterobacterias son oportunistas.

Se las denomina así principalmente porque tiene exigencias nutricionales escasas, son
capaces de sobrevivir en medios mínimos además de poseer un acción patogénica
escasa, son los principales causantes de enfermedades asociadas a enterobacterias al
ser muy fáciles de cultivar estas pueden permanecer en un estado de sueño hasta que
el medio donde este sea óptimo para su desarrollo, y así poder proliferar en el
organismo13.

3. Cuáles son los bacilos Gram negativos no fermentadores y porque no se incluyen en la

familia Enterobacteriaceae.

e Pseudomonas no-aeruginosa (P. putida, P. stutzeri. . .), Stenotrophomonas

maltophilia (probablemente el agente de mayor interés en esta amplio grupo),
Burkholderia cepacia complex, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter
xylosoxidans, Ochrobactrum anthropi, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas
paucimobilis,

No se incluyen porque una enterobacteria debe poseer una características

fermentadoras de carbohidratos y estas al no poder fermentar no se consideran de la
familia del Enterobacteriaceae14.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Algorta, G; BACILOS GRAM NEGATIVOS NO EXIGENTES (ENTEROBACTERIACEAE,

VIBRIONACEAE, PSEUDOMONAS) Disponible
en:(http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf). Fecha de consulta
(15/06/2019)
2. Prueba bioquímica TSI Disponible en :
(http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf).
Fecha de consulta(15/06/2019)
3. Prueba bioquímica citrato Disponible en:
(https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a29779bd2be8.pd
f) Fecha de consulta(15/06/2019)
4. Prueba bioquímica Lisina hierro agar Disponible en:
(https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a282fb7b6204.pdf
) Fecha de consulta(15/06/2019).
5. Prueba bioquímica ureasa disponible en: (
https://.www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5af086c156e97.pdf
) Fecha de cocnsulta (15/06/2019).
6. Prueba bioquímica MIO disponible en :
(https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2832fb81126.pdf
) fecha de consulta (15/06/2019).
7. Escherichia coli diponible en : (http://www.aam.org.ar/descarga-
archivos/Parte21Enterobacterias.pdf) fecha de consulta (16/06/2019)
8. Aislamiento de enterobacterias disponible en :
(file:///C:/Users/ACER/Documents/MICROBIOLOGIA/tesis198.pdf) fecha de consulta
(16/06/2019)
9. Proteus disponible en : (Rafael Cantón; Paz Sánchez
Morenohttps://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/bacteriologia/Ppe
nneri.pdf) fecha de consulta (16/06/2019)
10. Klepsiella disponible en :( http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf) fecha
de consulta (16/06/2019)
11. https://www.analesdepediatria.org/es-flora-bacteriana-intestinal-articulo-13092362
12. https://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae

13. www.sld.cu/galerias/doc/sitios/.../enterobacterias_y_antibioticoterapia._dra_zuleica.
do... Por zcg navarro
14. https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/eimc/seimc_eimc_v31n06
p402a409.pdf