FAGOCITOSIS IN VIVO, INOCULACIÓN EN ANIMALES

DEEXPERIMENTACIÓN (PRUEBA OPSONOCITOFÁGICA EN EL CUY)

I.- INTRODUCCION:
La fagocitosis es una “herramienta” de suma importancia en la respuesta inmune, ya
que a través de este mecanismo se eliminan principalmente las bacterias patógenas
que logran ingresar al organismo, así también se eliminan los complejos antígeno-
anticuerpo formados y las células que han cumplido su ciclo vital, por citar algunos
casos. Este mecanismo es realizado por células conocidas como “fagocitos”, dentro de
esta denominación se encuentran las células mononucleadas como los macrófagos o
también los polimorfonucleares como los neutrófilos, principalmente; ambos tipos
de células realizan una fagocitosis como respuestaa reconocimiento de patrones
moleculares que les permiten diferenciar entre sustancias y/o estructuras propias del
organismos y las que no lo son, en este caso la fagocitosis realizada no es muy eficaz
(desde el punto de vista de la eliminación total del “cuerpo extraño”) pero permite
el procesamiento del antígeno de manera que se pueda generar una respuesta inmune
específica, que en algunos casos termine induciendo una “fagocitosis mejorada”, la cual
sea mucho más eficiente que el primer proceso fagocítico.

MACRÓFAGOS
Los macrófagos juegan un papel importante en una amplia variedad defunciones,
incluyendo la fagocitosis de material extraño, destrucción de células bacterianas y
tumorales y la secreción de prostaglandinas y citosinas que regulan la actividad de
linfocitos y otros macrófagos. Una de las principales actividades de los macrófagos es
su participación en la respuesta inmune adquirida, ya que procesan los antígenos y los
presentan a las células T. Igualmente, los macrófagos desempeñan una importante
función en la respuesta inflamatoria, principalmente, mediante la secreción de citocinas.
Aparte de su actividad en la defensa inespecífica, también tienen un papel importante
en la regulación de la respuesta inmune específica. Por último debe mencionarse que
los centros germinales y los folículos de linfocitos B contienen una población típica de
macrófagos, que eliminan a las células en proceso de
autodestrucción(apoptosis). Al cabo de unas 8 horas de su salida de la médula, los m
onocitos migran atejidos y se diferencian a macrófagos. Los macrófagos son células de
vida más larga (meses e incluso años). Poseen un núcleo en herradura, en su
citoplasma se ve un abundante retículo endoplásmico rugoso y gran número de
mitocondrias. Están especialmente adaptados a luchar contra virus, bacterias y
protozoos intracelulares, pueden ser residentes (fijos en tejidos) o libres.
Residentes: cumplen misiones concretas en cada uno de los tejidos, pudiendo recibir,
en su caso, denominaciones peculiares. Por ejemplo:
▪ Células de Kupffer, en las paredes vasculares de las sinusoides hepáticas.
▪Células mesangiales de los glomérulos renales macrófagosalveolares de los
pulmones.
▪Macrófagos de las serosas (p. ej., de la cavidad peritoneal)
▪Células de la microglía del cerebro.
▪Osteoclastos de los huesos.
▪Histiocitos del tejido conjuntivo.
Libres : están estratégicamente situados para atrapar material extraño enórganos
linfoides secundarios:
▪ Macrófagos de las sinusoides esplénicos (en el bazo)
▪Macrófagos de los senos medulares (en los ganglios linfáticos)
NEUTRÓFILOS
Son los más abundantes, su producción y diferenciación en la médula ósea es entre 6-
10 días. Una vez liberados permanecen en circulación por 6-12 horas antes de migrar a
tejidos donde desarrollan su actividad fagocítica. Esto explica la necesidad de una
producción tan alta. La mayoría de los neutrófilos circulantes entran en los tejidos
filtrándose a través de las paredes capilares por
Diapédesis pero también muchos abandonan el organismo vía
sistema digestivo.Cuando migran a los tejidos permanecen 2-4 días antes de su
destrucción,debido a la muerte en acción (por su acción fagocítica) o al proceso
fisiológicodeenvejecimiento.

2.-OBJETIVOS:
 Determinar la respuesta del sistema inmune del organismo del animal inoculado
frente a la cepa bacteriana empleada.
 Realizar la prueba opsonocitofágica.
 Diferenciar la eficiencia de una fagocitosis inicial y una opsonización.
3.-MATERIALES:
De laboratorio:
Tubos de ensayo.
Mechero y ansa bacteriológica, en anillo.
Centrífuga
Solución salina fisiológica estéril.
Tubo Nº 3 de Mc. Farland.Estufa y Baño María.
Agujas hipodérmicas.
Citrato de Sodio. 2%Tabla de disección.
Láminas porta-objetos.
Soporte de coloración.
Colorante de Wright.
Agua destilada.
Microscopio.
Aceite de cedro.
Biológico: Cepa de E. coli.
Cobayo, para la obtención de sangre
4.- PROCEDIMIENTO:
1. Obtención de la cepa bacteriana: Sembrar la cepa de E. coli en caldo nutritivo e
incubar a 37 ºC.
 2. Lavado e inactivación de la cepa bacteriana: Centrifugar a 1500r.p.m. durante 15
minutos, eliminar el sobrenadante y agregar solución salina fisiológica (repetir esta
acción tres veces). Comparar la turbidez del tubo lavado con la del tubo Nº 03 del
Nefelómetro de McFarland. Llevar el tubo obtenido a baño maría a 85 ºC durante 60 min
3 . Inoculación:
Inoculamos al cobayo vía peritoneal. En este caso nuestra primera inoculación fue de
0.5 ml. Luego damos al cobayo un descanso de 4 días. Pasado el tiempo volvemos a
inocular vía peritoneal 1 ml de la suspensión preparada y dejamos de nuevo 4 días de
descanso al cobayo. Luego realizamos la tercera inoculación, esta vez de 2 ml de la
suspensión preparada y dejamos descansar al cobayo por 4
días.Pasado el tiempo, volvemos a inocular, esta vez de 4 ml de lasuspensión
preparada y dejamos descansar al cobayo por 4 días. Una vez pasado ese tiempo
inoculamos 1ml de la bacteria viva.
Quinta inoculación de 1 ml de la bacteria viva después de 4 días de la cuarta inoculación
.Obtención del líquido intraperitoneal:
Primero sacrificamos al animal de experimentación. Haciendo uso del Kit de disección
realizamos un corte longitudinal, y abrimos la región abdominal del animal, luego
mediante el uso de una jeringa realizamos la extracción del líquido peritoneal

Una vez que se ha sacrificado al animal realizamos un corte longitudinal en la región

abdominal.
Una vez realizado el corte pasamos a la extracción del líquido intraperitoneal.
Coloración de Wright: Tomar una gota de la mezcla y realizar un frotis, tiñéndola con
colorante Wright previamente filtrado y dejar secar.
Una vez extraído el líquido intraperitoneal, agregamos una gota a cada lámina,
extendemos y dejamos secar. Una vez seca las lamina agregamos el reactivo de Wright,
y lo dejamos por dos 2 minutos. Una vez transcurrido el tiempo le agregamos solución
salina fisiológica, hasta q se forme el espejo de agua, luego de eso lavamos y
dejamossecar5. Observación Microscópica:
Observar con objetivo de inmersión las láminas teñidas y realizar el recuento de 100
células polimorfonucleares (PMNs) y 100 macrófagos. Luego sacar el promedio
correspondiente y comparar con los valores de referencia.

RESULTADOS

N° de celula PMN MACROFAGOS

(bacterias fagocitadas) (bacterias fagocitadas)

EJEMPLO

Total de bacterias fagocitadas por macrófagos: 1217

Total de bacterias fagocitadas por PMN: 1088
Promedio obtenido por macrófago: 12.17 bacterias por macrófago.
Promedio obtenido por PMN: 10.88 bacterias por macrófago.
Promedio total: 11.53 bacterias por fagocito.

Tabla de resultados:
0 a1 bacterias por fagocitos Fagocitosis nula
2 a 20 bacterias por fagocito Fagocitosis insipiente
21 a 40 bacterias por fagocito Fagocitosis franca (normal)
41 a + bacterias por fagocito Fagocitosis excelente