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Come abbiamo già detto le caratteristiche che rendono allettante l’uso degli enzimi in sintesi

organica sono rappresentate dalla loro alta efficienza catalitica (aceller. v da 105 a 108) in ambienti
acquosi neutri, a temperatura ambiente e senza la necessità di utilizzare gruppi protettivi per le
funzioni non oggetto della modifica chimica desiderata. Infatti la loro natura chirale li rende
regiospecifici oltre che stereospecifici.
Più di 3000 enzimi sono stati attualmente identificati, la loro applicazione in sintesi organica è
comunque legata al possesso di alcune caratteristiche come la stabilità, l’efficienza catalitica, la
specificità e l’assenza di significative inibizioni da substrato e da prodotto. Questi dati sono legati
ad una serie di parametri cinetici facilmente deducibili dall’analisi dell’andamento della velocità
della reazione in diverse condizioni (concentrazioni di substrato o di prodotto, temperatura, pH,
ecc..).

Andremo a rivedere alcuni concetti sicuramente studiati nei corsi di biochimica sforzandoci di
dargli un significato più “pratico” alla luce di una possibile applicazione sintetica dell’enzima in
esame, senza dimenticare che molto spesso quello che chiediamo al catalizzatore non è
precisamente quello per cui l’evoluzione lo ha selezionato (substrati non naturali).

Cinetica enzimatica.
In generale si definisce “stato stazionario” la situazione in cui il valore di una determinata
grandezza rimane costante. In cinetica enzimatica il concetto si applica alle concentrazioni di
intermedi legati all’enzima (ES).
Quando un enzima (E) è mescolato con un eccesso di substrato (S), c’è un periodo iniziale detto
stato pre-stazionario durante il quale questi intermedi si accumulano fino alle concentrazioni
caratteristiche delle stato stazionario.
Una volta raggiunte queste concentrazioni, la velocità di reazione v varia di poco nel tempo ed è in
questo periodo che normalmente vengono misurate le velocità delle reazioni enzimatiche.

Il modello di Michaelis e Menten si basa sull’assunzione che la concentrazione dell’enzima sia


trascurabile rispetto a quella del substrato (vista l’elevata efficienza catalitica degli enzimi questo è
generalmente vero). Inoltre la velocità v che andiamo a misurare (misurando un ∆[S]/t oppure
∆[P]/t) è la velocità iniziale, cioè quella relativa ad un periodo iniziale durante il quale la [S] non è
ancora variata significativamente e di conseguenza anche i prodotti non si sono ancora accumulati
(in pratica è la v che si misura durante il primo o i primi minuti di reazione). In queste condizioni la
v è costante nel tempo.

Il modello proposto da Michaelis e Menten prevede un processo a due stadi per una reazione
enzimatica: durante il primo stadio l’enzima E ed il substrato S (spesso è meglio parlare di
substrati) si combinano in modo rapido e reversibile per dare un complesso enzima-substrato ES
non covalente definito complesso di Michaelis che garantisce il corretto allineamento dei reagenti e
dei gruppi catalitici dell’enzima nel sito attivo. KS rappresenta la costante di dissociazione del
complesso ES. I processi chimici hanno luogo in un secondo passaggio governato da una costante
di velocità Kcat che porta al prodotto P e all’E libero.
In realtà il complesso ES si trasforma in un complesso EP che però possiamo ignorare assumendo
che la sua dissociazione sia molto rapida. Il fatto inoltre che stiamo parlando di una fase iniziale
della reazione caratterizzata dalla v iniziale ci permette di ignorare l’eventuale reazione inversa
viste le basse concentrazioni di P che caratterizzano questa fase.
KS Kcat
[E] + [S] [ES] [EP] [E] + [P]
K2
KS Kcat
[E] + [S] [ES] [E] + [P]

Come abbiamo già detto KS rappresenta la costante di dissociazione del complesso ES:

[E] + [S]
KS =
[ES]
In base a quanto detto la velocità della reazione v sarà data dall’espressione:

v = Kcat [ES]

Dal momento che la concentrazione [ES] rappresenta l’enzima libero cioè la parte di enzima totale
[E0] che non si combina con il S per dare ES, possiamo scrivere:

[E] = [E0] - [ES]

Andando a sostituire questa espressione alla concentrazione di [E] nell’equazione della KS


otteniamo:

([E0] - [ES])[S]
KS =
[ES]

Che risolvendo per [ES] ci permette di ottenere un’espressione di [ES] che non contenga il termine
[E]:

[ES] KS = [E0][S] – [ES][S]

[ES] KS + [ES][S] = [E0][S]

[ES] = [E0][S] / KS + [S]

Andando a sostituire questo modo di esprimere [ES] nell’equazione che descrive la v otterremo:

Kcat [E0][S]
v =
KS + [S]

Se andiamo a misurare la v (velocità iniziale) della reazione a diverse concentrazioni (iniziali) di S,


osserveremo che questa aumenta linearmente in un primo intervallo di concentrazioni di S per poi
tendere ad un valore limite definito velocità massima Vmax , questo tipo di comportamento descrive
una cinetica detta di saturazione o cinetica di Michaelis-Menten ed è riscontrabile in molti enzimi.
Il fenomeno della saturazione è comprensibile se si pensa che la viene raggiunta quando tutti i siti
catalitici sono saturati.
v

[S]
Quindi ad alte [S], il termine KS al denominatore diventa trascurabile e l’espressione di v diventa quella che
definisce la Vmax :

v = Vmax = Kcat [E0]

Quindi l’equazione che descrive v in funzione di [S] può essere ulteriormente semplificata
sostituendo Vmax al termine (Kcat [E0]):

Vmax [S]
v =
KS + [S]

Se ci mettiamo nella condizione in cui v = ½ Vmax , possiamo capire meglio il significato del
termine KS:

Vmax Vmax [S]


=
2 KS + [S]

Dividendo entrambi i membri per Vmax e moltiplicando per (KS + [S]) otteniamo:

KS / 2 + [S] / 2 = [S]

che dividendo e ntrambi i membri per 2 diventa:

KS + [S] = 2[S]

Quindi

KS = [S]

cioè KS , oltre a rappresentare la costante di dissociazione del complesso ES, coincide con la
concentrazione di S che permette di avere una v = ½ Vmax.
Questa costante cinetica è nota come KM o costante di Michelis.
Quindi la forma finale dell’equazione di Michaelis e Menten sarà la seguente:
Vmax [S]
v =
KM + [S]

v
v = Vmax = Kcat [E0]
Vmax

1/2 Vmax

KM [S]
A questo punto abbiamo chiaro da quali concetti nasce questa razionalizzazione del comportamento
cinetico di molte reazioni enzimatiche (concetto di stato stazionario, [E0] trascurabile rispetto a [S],
v è una velocità iniziale, KS rappresenta la costante di dissociazione del complesso ES, la velocità
della reazione v data da Kcat [ES]) e quali sono i significati delle costanti cinetiche KM e Vmax
e abbiamo in mano uno strumento matematico che si basa su quantità facilmente misurabili come la
[S] e v.
Basta fare l’esempio della KM (o KS): se la consideriamo solo come la costante di dissociazione di
ES, per determinarle bisogna conoscere [E], [ES] e [S] all’equilibrio; sapendo però che coincide
con la [S] che garantisce una v = ½ Vmax basterà determinare sperimentalmente come varia v al
variare di [S] .

In precedenza abbiamo detto che quando la v è uguale a Vmax la sua equazione può essere scritta:

v = Vmax = Kcat [E0]

La costante Kcat è detta spesso numero di turnover dell’enzima perché rappresenta il numero
massimo di molecole di substrato convertite in prodotti per sito attivo per unità di tempo, o il
numero di volte che l’enzima “re-inizia” (“turnover”) il ciclo catalitico per unità di tempo.

Rappresentazione grafica dei dati

E’ molto utile trasformare l’equazione di Michelis-Menten in una forma lineare invertendo entrambi
i membri dell’equazione:
Eq. di Michaelis-Menten

Vmax [S] inversione 1 KM + [S]


v = =
KM + [S] v Vmax [S]

1 KM [S] 1 1 KM
= + = +
v Vmax [S] Vmax [S] v Vmax Vmax [S]

eq. che descrive il diagramma


di Lineweaver-Burk

Per 1/[S] uguale a 0 1/v diventa uguale a 1/Vmax e corrisponde con l’intercetta sull’asse delle y. Se
invece consideriamo 1/v uguale a 0 , 1/[S] assume un valore uguale a -1/KM (intercetta con l’asse
delle x). Il coefficiente angolare della retta è KM / Vmax.

1 KM 1 KM 1 1
0 = + - = - =
Vmax Vmax [S] Vmax Vmax [S] KM [S]

Questa linearizzazione è molto utile per la determinazione dei valori di KM e Vmax.

1/v

1/Vmax
-1/KM

0 1/[S]

Inibizione

a) Inibizione competitiva.

Se un inibitore I si lega reversibilmente con il sito attivo dell’enzima impedendo il legame di S


e viceversa, I e S competono per il sito attivo e I viene detto inibitore competitivo.
Quindi, nel modello di Michelis-Menten, in presenza di un inibitore competitivo, bisogna
inserire un ulteriore equilibrio:
KM
E ES
S
KI I

EI
Andando a ricavare [E] e [EI] dalle equazioni di equilibrio e sostituendo i valori così ottenuti
nell’espressione [E0] = [ES]+[EI]+[E] che definisce [E0] in presenza di un inibitore otteniamo
un’espressione che definisce [E0] in funzione di [ES] e [S].

KM = [E][S] / [ES] [E] = KM [ES] / [S]

KI = [E][I] / [EI] [EI] = [E][I] / KI

[EI] = KM [ES][I] / [S]KI

[E0] = [EI] + [ES] + [E]

KM [ES][I] KM [ES]
[E0] = + [ES] +
[S]KI [S]

A questo punto conviene risolvere l’espressione per [ES] (perché è l’unica grandezza variabile
non misurabile sperimentalmente).
KM [I] KM
[E0] = [ES] + 1 +
[S]KI [S]

KM [I]
[E0] = [ES] + 1 + 1
[S] KI

KM [I]
[ES] = [E0] + 1 + 1
[S] KI

[I]
KM + 1 + [S]
[ES] = [E0]
KI

[S]

[E0] [S]
[ES] =
[I]
KM + 1 + [S]
KI
Sostituendo l’espressione di [ES] così ottenuta nella equazione v = Kcat [ES] che descrive la
velocità, otteniamo un’equazione molto simile a quella originaria di Michaelis-Menten, con l’unica
differenza che la KM è aumentata di un fattore pari a (1+[I]/KI) che possiamo per comodità definire
α.

Kcat [E0][S]
v =
[I]
KM + 1 + [S]
KI

L’inibizione competitiva influisce solo su KM (è intuitivo che in presenza di un inibitore


competitivo sia necessaria una [S] maggiore per ottenere una v = ½ Vmax) e non su Vmax , dal
momento che concentrazioni infinitamente alte di S spostano I dall’enzima.
Questo è evidente sia dal grafico di v in funzione di [S] che da quello di Lineweaver-Burk (1/v =
f(1/[S]). In quest’ultimo infatti si osserva che l’intersezione con l’asse delle y non cambia (1/ Vmax),
mentre aumentano (essendo α un valore >0) sia l’intercetta con l’asse delle x che diventa uguale a -
1/ α KM e la pendenza della retta che diventa KM α / Vmax.
KMα/Vmax
1/v

KM /Vmax

1/Vmax
-1/KM

0 1/[S]

b) Inibizione incompetitiva e mista

Nell’inibizione incompetitiva l’inibitore I si lega al complesso ES ma non ad E

KM Kcat
E ES E + P
S
KI I

ESI

In presenza di un inibitore di questo tipo, il grafico di Lineweaver-Burk costruito con


concentrazioni crescenti di I si presenta con una serie di rette parallele per le quali i valori di
intersezione con l’asse delle ordinate corrisponde ad α/Vmax e quello con l’asse delle ascisse a –
α/KM dove α=(1+[I]/KI).

[I]=2

1/v [I]=1

[I]=0

1/[S]

Nell’inibizione mista sia E che S possono legare l’inibitore I.


1/v
1/[S]
[I]=1
[I]=0
[I]=2

KM Kcat
E ES E + P
S
KI I KI I I

EI ESI
Quando KI assume un valore diverso da KII
il grafico di Lineweaver-Burk costruito con
concentrazioni crescenti di I si presenta con una serie di rette che si intersecano a sinistra dell’asse
1/v.

[I]=2

1/v [I]=1

[I]=0

1/[S]

Se invece KI e KII assumono lo stesso valore siamo di fronte ad un particolare tipo di inibizione
mista detta inibizione non competitiva caratterizzata da una serie di rette che al variare di [I]
mantengono lo stesso punto di dintersezione con l’asse 1/[S] pari a -1/KM e variano per la pendenza
che sarà data da αKM/Vmax.
[I]=2

1/ [I]=1
v
[I]=0

1/[S]