1 PRÁCTICA DE ECOLOGÍA MICROBIANA ESBI

PRÁCTICA Nº 09

DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN MUESTRAS DE AGUA POR LA TÉCNICA

DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE (NÚMERO MÁS PROBABLE O NMP)

I. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat

primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos
aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado
por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este
grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia
coli.
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando
un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la
fase presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes
en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante
la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante
el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de
tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes
termotolerantes se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas
cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.2°C por un periodo de 24 a 48 h.

II. OBJETIVOS
 Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
termotolerantes
 Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la búsqueda de
microorganismos coliformes totales y termotolerantes.

III. MATERIALES

 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo de caldo bilis verde brillante doble y
simple concentración con campana de Durham.
 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durham.
 Pipetas estériles
 Asa bacteriológica
 Mecheros
 Propipeta
 Gradilla
 Incubadora
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IV. PROCEDIMIENTO
Toma de muestra
Las muestras para el análisis bacteriológico, se deben tomar en frascos muestreadores que
se hayan lavado con extremo cuidado y esterilizado.
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su
recolección. Es por ello que se recomienda que, de no efectuarse así el análisis, se inicie
dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en ningún caso, este lapso
debe de exceder de 24 h para agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua, para que
sea válido el resultado del análisis.
Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a
4°C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o
dudosos.

Muestra.

Antes de efectuar los cultivos, la botella con la muestra y las diluciones, deben ser agitadas
vigorosamente, con movimientos hacia arriba y hacia abajo.

Prueba de microorganismos coliformes totales

 Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los
tubos con caldo de bilis verde brillante (brila) que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.
 Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formación
de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa
producción de gas, incubar 24 h. más.

Cuadro 1

 Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo

anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
 Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe
turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del
cálculo del NMP.

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales

 Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva,

a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con
campana de Durham.
 Agitar los tubos para su homogeneización.
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 Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h.. Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño

de agua durante 24 a 48 h.
 Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción
de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
 Consultar la tabla del NMP para conocer el número más probable de organismos
coliformes termotolerantes/ 100 mL.

 Si se observa turbidez y producción de gas:

La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para

posteriormente hacer el cálculo del NMP.

Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:

 Se reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.

V. RESULTADOS

De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para coliformes Totales y
fecales termotolerantes:

 Determinar un código de tres cifras con la combinación de tubos positivos y negativos

obtenidos en cada dilución, en el ensayo confirmativo para calcular por referencia en la
tabla
 Con el código establecido, entrar a la tabla NMP de Standard Methods y leer
directamente el número más probable de bacterias coliformes por 100 mL, en la
columna correspondiente al número de tubos sembrados en cada dilución.
 En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para
los cálculos la siguiente ecuación:

NMP/100 mL= Nº de tubos positivos x 100

√ (mL de muestra en tubos negativos x mL de muestra en todos los tubos)

VI. CONCLUSIONES
VII. BIBLIOGRAFÍA
VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método del NMP?
2. ¿Qué otra técnica conoce para la determinación de coliformes?
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