EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN

Carmona Cristian1, Hinestroza Christopher2, Loaiza M. Juliana3 & Muñoz Veronica4

1. Estudiante programa de bacteriología y laboratorio clínico, segundo semestre. Institución Universitaria

Colegio Mayor de Antioquia. Carrera 78 # 65 – 46, capa2499@hotmail.com Medellín - Colombia
2. Estudiante programa de bacteriología y laboratorio clínico, segundo semestre. Institución Universitaria
Colegio Mayor de Antioquia. Carrera 78 # 65 - 46, chinestroza.e@gmail.com Medellín – Colombia
3. Estudiante programa de bacteriología y laboratorio clínico, segundo semestre. Institución Universitaria
Colegio Mayor de Antioquia. Carrera 78 # 65 – 46, julividal021@gmail.com Medellín – Colombia
4. Estudiante programa de bacteriología y laboratorio clínico, segundo semestre. Institución Universitaria
Colegio Mayor de Antioquia. Carrera 78 # 65 - 46, vero16.510@gmail.com Medellín – Colombia

Resumen: Estas prácticas fueron enfocadas en el reconocimiento de la estructura celular y su relación con el
funcionamiento del ADN, por medio de la extracción y purificación de ADN, cuantificación de ADN (fluorimetría)
y reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), cada uno de los métodos empleados nos permitieron desarrollar
habilidades para el manejo de muestras en el laboratorio de biología molecular y posteriormente generar estudios
sobre las mismas. En este informe, están registrados todos los controles cuantitativos de muestras de ADN
mediante la fluorimetría, determinando la concentración de ADN y su grado de pureza.

Palabras clave: ADN, polimerasa, cuantificación, genoma, célula.

INTRODUCCIÓN nuclear (usando soluciones con detergentes,

durante el proceso de lisis las interacciones
En la actualidad, el estudio de la variación
entre las moléculas que conforman la pared,
genética entre individuos, poblaciones y
la membrana celular y nuclear se modifican o
especies para explicar patrones y procesos en
destruyen permitiendo que los ácidos
la genética se aborda mediante marcadores
nucleicos se liberen) precipitación de
moleculares, segmentos de ADN con o sin
proteínas (solución de sales) y precipitación
función conocida que proporcionan
de ácidos (solución alcohólica); La colecta de
información sobre la variación alélica y
la muestra y su manejo adecuados son
permiten distinguir individuos, para la
indispensables para una extracción del ADN
extracción y purificación de ADN se cuentan
exitosa [1].
con métodos caseros con diferentes
protocolos de extracción a partir de diversas el ADN debe ser íntegro y de la mayor pureza
muestras vegetales, animales y posible, el procedimiento para aislar el ADN
microorganismos etc., los protocolos de genómico debe cumplir algunos requisitos
extracción empiezan con lisis celular y importantes. Debe permitirnos obtener una
1
cantidad suficiente de ADN genómico
procurando que el protocolo sea fácil y simple
[2].
La espectrofotometría sirve para medir, en
función de la longitud de onda, la relación
entre valores de una misma magnitud
fotométrica relativos a dos haces de
radiaciones. También es utilizado en los
laboratorios de química para la cuantificación
de sustancias y microorganismos. midiendo
la cantidad de luz que es absorbida por la
muestra, pues la luz absorbida por el medio es
proporcional a la concentración del soluto
presente, también podemos establecer el
grado de pureza del ADN extraído al realizar
una relación entre la concentración de
proteínas con la concentración de ADN luego
de ser medido a longitudes ondas propias
(260nm para ADN, 280nm para proteínas)
[3].
Tabla 1. Pureza del ADN
También existe una técnica complementaria
como lo es la fluorimetría, que analiza la
fluorescencia de una muestra. Se trata de
utilizar un haz de luz, por lo general luz
ultravioleta, que excita los electrones de las
moléculas de ciertos compuestos y provoca
que emitan luz de una menor energía,
generalmente luz visible (aunque no
necesariamente), unen específicamente a la
molécula blanco, ADN, ARN determinando
su concentración siendo esta mezcla
directamente proporcional a la concentración
de la molécula en la solución [4]
2
Además de conocer la cantidad y calidad del
ADN por espectrofotometría, es importante
conocer si el ADN obtenido está integro. La
integridad del ADN se puede observar
mediante electroforesis (separación,
purificación y preparación) por medio de un
gel poroso (consiste en la migración
proporcional de las moléculas según su peso
molecular o tamaño o configuración
tridimensional) , si el ADN está integro, se
debe observar una banda estrecha cercana al
pozo en que se colocó la mezcla de ADN. Si
está fragmentado, se observará una banda de
más de un cm de ancho o un sendero
luminoso en el carril de la muestra, el ADN
fragmentado dificulta la amplificación de
productos de PCR de alto peso molecular y
afecta la reproducibilidad de las técnicas [5]
La velocidad de migración en la
electroforesis, depende de:
1. la configuración y tamaño del ADN (lineal
o circular).
2. la concentración de la agarosa y el voltaje
aplicado.
3. La visualización del ADN, se logra al
emplear colorantes que se intercalan con el
ADN como el bromuro de etidio, los cuales
son visibles bajo la radiación UV. [6]
La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una técnica de
laboratorio común utilizada para hacer
muchas copias (millones o miles de millones)
de una región particular de ADN. Esta región
de ADN puede ser cualquier cosa que le
interese al experimentador, esta técnica
depende depende de un ADN polimerasa
termoestable, la Taq polimerasa, y requiere
de cebadores de ADN diseñados
específicamente para la región de ADN de
interés, la reacción se somete repetidamente a
un ciclo de cambios de temperatura que
permiten la producción de muchas copias de
la región blanco.
Al igual que la replicación de ADN en un
organismo, la PCR requiere de una enzima
ADN polimerasa que produzca nuevas
cadenas de ADN mediante el uso de las
cadenas existentes como molde. La ADN
polimerasa que normalmente se utiliza en la
PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria
tolerante al calor de la que se aisló
(Thermus aquaticus), Habitualmente, los
resultados de una reacción de PCR se
visualizan (se hacen visibles) al
usar electroforesis en gel. La electroforesis en
gel ya antes mencionada es una técnica en la
que una corriente eléctrica impulsa
fragmentos de ADN a través de una matriz de
gel y los fragmentos de ADN se separan
según su tamaño. [7].
METODOLOGÍA
En la primera practica se realizó extracción y
purificación de ADN, para esto debimos
transferir 300 ul de sangre a un vial de 1.5 ml
y adicionar 900 ul de buffer de lisis celular,
luego agitamos por inversión y se incubo por
10 minutos a temperatura ambiente, se
centrifugó a (13000 – 16000 x g) por 3
minutos, se descartó el sobrenadante y se
agito el pellet. Adicionamos 300 ul de buffer
de lisis nuclear y agitamos por inversión, se
Adicionó 100 ul de solución de precipitación
proteica y agitamos mediante vortex por 20
seg, centrifugamos a (13000 – 16000 x g) por
10 minutos, transferimos el sobrenadante a un
vial con 300 ul de isopropanol y agitamos.
Centrifugamos a (13000 – 16000 x g) por 1
minuto, descartamos el sobrenadante y
adicionamos al pellet 300 ul de etanol al 70%
y agitamos, centrifugamos a (13000 – 16000
3
x g) x g por 1 minuto, Descartar el
sobrenadante y dejar secar el exceso de
alcohol del pellet (10 – 15 minutos) Por
ultimo adicionamos 100 ul de solución de
rehidratación y almacenamos la muestra.
En la siguiente práctica realizamos
cuantificación de ADN para esto realizamos
fluorimetría y espectrofotometría. Para la
fluorimetría se seleccionaron dos viales de
1.5 ml y se marcaron como estándar o patrón.
Se preparó 200 µl de solución para el estándar
y la muestra según lo indicado, agitamos en
vortex de 2 a 3 segundos, incubamos los
viales a temperatura ambiente por dos
minutos, por ultimo insertamos los tubos en
el fluorómetro y registramos los valores de
lectura. Para la espectrofotometría, en un vial
de 1.5 ml realizamos una dilución 1:200 de la
muestra de ADN con tampón TE, en un
volumen final de 1 mL (5 µl en 1 mL),
depositamos la dilución en una cubeta de
cuarzo, realizamos la lectura en las longitudes
de ondas para ADN y proteínas (260 y 280
nm respectivamente), y registramos el valor,
por ultimo calculamos la concentración de
ADN aplicando la fórmula.
Para realizar la electroforesis primero
debemos preparar el gel de agarosa siguiendo
los siguientes pasos:
1. Pesar la cantidad de agarosa determinada
para 100 ml de gel al 0.8%. Para esto debe
pesar 0,8 g de agarosa y disolver en 99,8 ml
de buffer TBE 0,5X en un recipiente de
vidrio.
2. Agitar la solución. Para fundir la agarosa se
necesita calentar la mezcla, lo que
generalmente se realiza con unos segundos en
el microondas. Es importante dejar enfriar un
poco la preparación (hasta que podamos
mantener el recipiente en la mano sin
quemarnos y que no se rompa la cubeta al
depositar la solución).
3. Adicionar 10 ul de bromuro de etidio a la
solución de agarosa.
4. Depositar la solución en la cubeta de
electroforesis. Realizarlo suavemente para
evitar la formación de burbujas.
5. Colocar el peine para generar los carriles
de corrido. Dejar enfriar para retirar el peine.
Para preparar la cámara de electroforesis
seguimos los siguientes pasos:
1. Una vez solidificado el gel, montarlo en la
cámara de electroforesis.
2. Agregar el buffer TBE 0,5 X necesario para
cubrir el gel.
3. En un fragmento de 5x2cm de parafilm
colocar gotas de 2 ul de buffer de carga (1
gota por muestra) y posteriormente, mezclar
4 ul de la muestra de ADN con una gota de
buffer de carga, asi sucesivamente con todas
las muestras de ADN y el marcador de peso
molecular.
4. Depositar las muestras y el marcador de
peso molecular en el carril respectivo del gel.
5. Conectar a la fuente y correr a 70 voltios
durante una hora.
6. Finalizada la corrida, observar los
resultados mediante un transiluminador con
luz UV.
La última practica realizada fue: Reacción en
Cadena de la Polimerasa, en esta práctica se
preparó una master mix para todo el grupo,
teniendo en cuenta el número de equipos de
trabajo adicionamos en el siguiente orden:
agua estéril, buffer PCR, dNTPs, MgCl2,
cebadores o primers y taq polimerasa)2
teniendo en cuenta los cálculos realizados
previamente. Seleccionamos tubos de PCR de
4
0,2 ml estériles y marcarlos con los nombres
de cada muestra (R y W) Incluyendo un
control negativo (Master mix sin ADN).
Adicionamos a cada uno de los tubos el
volumen definido anteriormente del master
mix y luego agregamos a cada tubo la
cantidad de ADN definido. Adicionar a cada
uno de los tubos el volumen definido en la
tabla #1 del master mix y luego agregar a cada
tubo la cantidad de ADN definido en la
misma tabla. Ubicamos los tubos en el
termociclador, tapamos y programamos el
equipo de acuerdo con el perfil térmico
sugerido. Almacenamos el producto de PCR
una vez finalizado los ciclos hasta su
visualización. (El producto de PCR debe ser
visualizado en un gel de electroforesis con el
transiluminador, la cual estará a cargo del
docente)
RESULTADOS
La extracción de ADN se realizó para dos
personas diferentes, esto con el fin de tener
más certeza y un margen de error mínimo a la
hora de realizar la técnica, al finalizar ambas
salieron bien.
Cuando se realizaron las medidas en el
espectrofotómetro encontramos que este
estaba presentando errores a la hora de dar los
resultados de cuantificación, sin embargo, se
registraron todos los datos arrojados y se
determinó la cantidad de ADN que tenían las
muestras de la siguiente forma:
Cristian:

A260 = 0,014

A280 = -0,015

𝑛𝑔 𝑛𝑔
𝐴𝐷𝑁 = 0,014 ∗ 0,010 ∗ 50
𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑐𝑜𝑙
𝒏𝒈
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟕
𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍

𝐴260 0,014
= = −0,93
𝐴280 −0,015

Figura 1. Cámara de electroforesis con muestras

Verónica:
A260 = 0,084
A280 = 0,045
𝑛𝑔 𝑛𝑔
𝐴𝐷𝑁 = 0,084 ∗ 0,010 ∗ 50
𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑙
𝒏𝒈
= 𝟎, 𝟎𝟒𝟐
𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒍

𝐴260 0,084
= = 1,87
𝐴280 0,045 Figura 2. Resultado de electroforesis

Seguido de esto, se realizó una práctica de

Ocho días después se realizó una
electroforesis de todas las muestras que
fueron extraídas dentro del grupo.
PCR, en donde se montaron cuatro muestras
dos de tipo R y dos de tipo W, las cuales
fueron llevadas a un termociclador durante 50
minutos, y se dejaron reposar para ser
revisadas pasados ocho días.
En la práctica siguiente encontramos que las
muestras se evaporaron en su mayoría, sin
embargo, realizamos otra electroforesis, con
el objetivo de determinar si las muestras si se

5
evaporaron por completo, y qué primer
permitió la amplificación de los genes
anteriormente nombrados (R y W).
Figura 3. Electroforesis de genes para todo el grupo
Figura 4. Amplificación de nuestras muestras
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Visualmente podemos decir que la extracción
de ADN funcionó, ya que se logró observar
una pequeña hebra como lo expresaba la guía
y los docentes.
A pesar de que el espectrofotómetro arrojara
resultados tan pequeños, por el fallo
presentado a la hora de cuantificar, realizando
la electroforesis observamos que si había
presencia de ADN en las muestras, sin
6
embargo, notamos que aquellas personas que
depositaron las muestras en los posos 3 y 4
(de izquierda a derecha) fueron los que más
cantidad de este lograron extraer (Figura 2).
Para la PCR se presume que se sometieron las
muestras a temperaturas más altas de lo que
la muestra podía soportar, lo que generó que
estas se evaporaran. Pese a esto, hecha la
electroforesis se logró concretar cuál gen y
primer eran para especie, y cuáles estaban
contagiados o enfermos. Siendo así, que el
Gen R solo amplificó con el primer Rps, para
especie. Mientras el Gen W amplificó para
ambos, siendo el principal el primer Tm pues
este amplificaba solo para el gen enfermo.
Debido a la alta cantidad de primers que se le
agregaron a la muestra, todas las
amplificaciones arrojaron una segunda banda
correspondiente a un exceso de estos (Figura
3). Sin embargo, no se logran observar muy
bien estas amplificaciones en nuestras
muestras en el primer poso ni en el tercero
(Figura 4).
DISCUSIÓN
La extracción de ADN es un procedimiento
fundamental que tiene aplicaciones en
diversos campos de la biología, tales como la
medicina, la microbiología, la biología
molecular, entre otras, ya que interviene en
variados procesos en los cuales se puede
asegurar, por ejemplo, un diagnóstico certero
en cuanto al área de la salud o investigaciones
de gran impacto en otras áreas.
Específicamente en este trabajo, la extracción
y purificación del ADN realizadas en el
laboratorio permitió brindarle a los
estudiantes nuevas técnicas y herramientas
para llevar a cabo diferentes procesos o
pruebas, con el objetivo de fortalecer los
conocimientos adquiridos e ir trabajando en
el manejo de muestras biológicas para su
estudio posterior. Así mismo el desarrollo de
la practica evidenció la necesitada de trabajar
con equipos eficientes y tener métodos
alternos para verificar y realizar un control
por medio de otras técnicas como lo fue la
electroforesis, ésta fue utilizada
concretamente en este caso para evidenciar la
presencia del ADN debido al inconveniente
antes mencionado con la cuantificación en la
técnica de espectrofotometría.
La PCR o reacción en cadena de la polimerasa
representa gran utilidad en los procesos
bioquímicos desarrollados en el laboratorio,
pues permite la amplificación de muchísimas
copias de un gen, permitiendo identificar las
características de dicho gen, en estas prácticas
de laboratorio el objetivo era reconocer cual
de los dos genes estudiados amplificaban para
la especie y cual para la enfermedad.
CONCLUSIONES
Se aplicó la extracción y purificación de ADN
de manera exitosa, permitiendo así el
desarrollo de nuevas técnicas para diversos
estudios moleculares, entendiendo de manera
objetiva el fundamento de cada
procedimiento para determinar así los valores
cuantitativos de la muestra de ADN (0,007
ng/microl y 0,042 ng/microl de ADN para las
muestras 1 y 2 respectivamente).
7
Se reconoció la importancia del manejo
adecuado de los equipos, pues de este
depende el desarrollo correcto de los
objetivos planteados para cada práctica de
laboratorio.
La determinación del grado de pureza del
ADN extraído se logró mediante
cuantificación por fluorimetría, llevando a
cabo un control de calidad del procedimiento
realizado, y se obtuvo el reconocimiento
visual de la presencia de ADN en las muestras
por medio de las bandas de color fluorescente
emitidas por el equipo.
Se implementó la PCR, como procedimiento
fundamental en la biología molecular, por
medio de la cual se amplificaron secuencias
de ADN, permitiendo así reconocer que el
gen Tm era el que estaba implicado en
procesos de enfermedad. Se interpretaron los
datos obtenidos por medio del gel de la
electroforesis realizada posterior a la PCR.
REFERENCIAS
[1] (2018). Publicaciones.inecc.gob.mx.
Retrieved 21 May 2018, from
http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/lib
[2] Aislamiento de adn genómico de
myrciaria dubia (hbk) “camu camu”
apropiado para análisis moleculares Juan C.
Castro Gómez, 1* Marianela Cobos Ruiz, 1,2
Roberson Ramírez Saavedra, 1 Sixto Imán
Correa, from:
file:///C:/Users/LENOVO/Downloads/Dialnet-
aislamientodeadngenomicodemyrciariadubiahbk
camucam-5072959.pdf

[3 El Espectrofotómetro Usos» El
Espectrofotómetro. (2016). El
Espectrofotómetro. Retrieved 21 May 2018, from
https://elespectrofotometro.com/usos/

[4] Espectrometría de fluorescencia.

(2018). Espectrometria.com. Retrieved 21 May
2018, from
https://www.espectrometria.com/espectrometra_
de_fluorescencia

[5] (2018). Bancoadn.org. Retrieved 21 May

2018, from
http://www.bancoadn.org/docs/programa-
control-calidad-muestras.pdf

[6] Guía de laboratorios de prácticas de Genética,

Colegio Mayor de Antioquia, Diego Guerra,
Retrieved 21 May 2018 from:
https://docs.google.com/document/d/11-
4g5bIaU20gMQeIY2fXYRNJ6NKBh9F4sJqgQ
ASo6bI/edit

[7] Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

(2018). Khan Academy. Retrieved 21 May 2018,
from
https://es.khanacademy.org/science/biology/biot
ech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr