GUÍA DE PRÁCTICAS

LABORATORIO TALLER SIMULACIÓN CAMPO

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CARRERA: Ingeniería en Alimentos
ASIGNATURA: Análisis Instrumental
NIVEL: Quinto PARALELO: U
UNIDAD DE ORGANIZACIÓN CURRICULAR: Profesional DOCENTE: Dayana Morales, PhD
CICLO ACADÉMICO: Marzo – Agosto 2019

PRÁCTICA N: 5

I. TEMA:
Separación e identificación de colorantes por cromatografía clásica en columna

II. OBJETIVO:
• Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en columna, sus características y los factores que en
ella intervienen.
• Utilizar la cromatografía en columna para la separación de mezcla de pigmentos en hojas de
espinaca.
• Identificar la presencia de b-caroteno y clorofila en hojas de espinacas, mediante espectroscopia
visible.

III. INSTRUCCIONES:

• En caso de no disponer de éter de petróleo, se trabajará toda la práctica con heptano.

• Para la preparación de la columna cromatográfica, trabajar con sumo cuidado con el fin de obtener capas
rectas de arena y sílica; y asegurar una separación horizontal de los componentes de la mezcla.

Preparación de la muestra
• Tomar aproximadamente 10 gramos de hojas de espinacas y machacarlas en un mortero. A continuación,
preparar un extracto añadiendo 10 mL de una disolución de éter de petróleo y acetona en la proporción
(8:2). Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa (utilizar la campana
extractora). Filtrar en un embudo con papel filtro y recoger el extracto en un tubo de ensayo.

Preparación de la columna cromatográfica

• Disponer en un vaso de precipitados de 150 mL un volumen de aproximadamente 20 mL de éter de petróleo
y situar debajo de la columna, que debe estar sujeta en un soporte con ayuda de una pinza. Tomar un
trocito de lana de vidrio y humedecer en el éter de petróleo, para introducirlo en el interior de la columna,
con la ayuda de una pipeta. Empaquetar, aproximadamente, 1,5-2,0 cm de lana de vidrio en la parte más
estrecha de la columna, para evitar que se salga el soporte sólido del interior de la columna. A continuación,
adicionar la arena a la columna hasta que forma una capa de, aproximadamente, 0,3 cm por encima de la
lana de vidrio. Limpiar con éter de petróleo los residuos de arena que hayan podido quedar adheridos a las
paredes de la columna utilizando una pipeta.
• En un vaso de precipitados de 250 mL mezclar aproximadamente unos 5 g de sílica con un volumen de 30
mL de éter de petróleo, agitando suavemente hasta obtener una suspensión, y transferir a la columna
utilizando una pipeta Pasteur con el extremo cortado, enrasando el disolvente hasta el nivel del soporte.
Para evitar que la sílica se seque mientras se rellena la columna, se aconseja tapar con el dedo el extremo
inferior de la columna hasta que se rellene totalmente. La columna debe tener una longitud de relleno de
aproximadamente unos 3 cm. Finalmente, proteger la sílica añadiendo arena hasta obtener una capa de
otros 0,3 cm aproximadamente (Figura 1).
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 Figura 1. Columna de vidrio empaquetada

Separación cromatográfica del extracto

• Abrir la llave de paso de la columna y dejar que el disolvente comience a gotear. Cuando el nivel del éter
de petróleo alcance la primera capa de arena, se procederá a adicionar la muestra. Para ello, hay que
pipetear parte de extracto de espinacas sobre la columna. Continuar añadiendo todo el extracto y observar
cómo se desplazan los pigmentos a través de la columna. Cuando el β-caroteno alcance la primera capa de
arena, se debe seguir añadiendo éter de petróleo hasta que se vea que se ha separado todo este
componente. Para ir colectando el β-caroteno, se deben disponer tubos de ensayo debajo de la columna,
una vez que el compuesto haya alcanzado la segunda capa de arena (Figura 2). Se debe colectar,
aproximadamente, unos 10 mL de la disolución. Guardarla para posteriormente obtener su espectro de
absorción. Para eluir la clorofila, adicionar como fase móvil acetona y repetir el procedimiento indicado
anteriormente.

Figura 2. Separación cromatográfica

Identificación de los compuestos mediante espectroscopía de absorción UV-Visible

• Determinar el espectro de absorción de los distintos extractos obtenidos. Comparar con la bibliografía e
identificar los diferentes componentes.

IV. LISTADO DE EQUIPOS , MATERIALES Y RECURSOS:

Materiales Compuestos y Reactivos

• Espectrofotómetro de absorción UV-Visible • Sílica
• Balanza analítica • Éter de petróleo
• Columna de cromatografía de vidrio • Acetona
• Dos pinzas • Hojas de espinaca
• Embudo
• Varilla de vidrio
• Lana de vidrio
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 • Arena
• Pipetas Pasteur
• Tubos de ensayo
• Mortero
• Papel de filtro

V. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

• Elaborar una solución de extracto de espinaca y etanol
• Preparar el relleno de la columna de cromatografía
• Desarrollar el cuestionario (Anexo 1)

VI. RESULTADOS OBTENIDOS:

• Obtener los espectros de absorción de los pigmentos y compararlos con los existentes en la
bibliografía.
• Determinar las longitudes de onda correspondientes al máximo o máximos de absorción de cada
uno de los pigmentos.

VII. CONCLUSIONES:
• Concluir en base a los objetivos planteados.

VIII. RECOMENDACIONES:
• Señalar las recomendaciones referentes a la práctica realizada y su procedimiento.

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 ANEXO 1

CUESTIONARIO

1. Explicar por qué los dos pigmentos se pueden separar empleando un procedimiento
cromatográfico. ¿Por qué se necesita realizar el proceso en dos etapas?
2. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una
cromatografía en columna?
3. Un colorante desconocido se piensa que puede ser azul de metileno, ¿cómo se podría comprobar
esta suposición utilizando un procedimiento basado en una técnica cromatográfica?
4. Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografía en columna en orden de polaridad.
5. ¿Qué combinación de las propuestas emplearía para separar una mezcla de compuestos muy
polares?:
a. Un adsorbente muy activo y un eluyente poco polar
b. Un adsorbente muy activo y un eluyente muy polar
c. Un adsorbente poco activo y un eluyente poco polar
d. Un adsorbente poco activo y un eluyente muy polar

6. ¿En qué consiste la cromatografía en fase normal? ¿Qué características presenta y qué tipo de
compuestos se puede analizar con ella?
7. ¿En qué consiste la cromatografía en fase reversa? ¿Qué características presenta y qué tipo de
compuestos se puede analizar con ella?
8. ¿Cuál es el principio fundamental de la electroforesis? ¿Qué aplicaciones presenta?
9. En cromatografía de gases: ¿qué se usa como “fase móvil”?
10. En cromatografía de gases: ¿cuál es el principal factor que permite la separación de los
compuestos?