Química Clínica 48: 8
1170-1177 (2002)
Aplicación de microarrays para el análisis del gen
La expresión en el cáncer
Pascale F. Macgregor 1 y Jeremy A. Escudero 2-4 *
El diagnóstico molecular es un campo en rápido avance en la que
conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad están siendo
elucidados por el uso de nuevos biomarcadores basadas en genes.
Hasta hace poco, la evaluación diagnóstica y pronóstica de los tejidos
enfermos y los tumores se basó en gran medida de los indicadores
indirectos que permiten únicamente las clasificaciones generales en
amplias histológicas o morfológicas subtipos y no tomaron en cuenta
las alteraciones en la expresión de genes individuales. análisis de
expresión Global utilizando microarrays permite ahora para la
interrogación simultánea de la expresión de miles de genes en una
forma de alto rendimiento y ofrece oportunidades sin precedentes para
obtener las firmas moleculares del estado de actividad de las células
enfermas y muestras de pacientes. Microarray análisis puede
proporcionar información valiosa sobre patología de la enfermedad,
progresión, resistencia al tratamiento,
© 2002 Asociación Americana de Química Clínica
La tecnología de microarrays
Microarray métodos se desarrollaron inicialmente para estudiar la expresión
génica diferencial utilizando poblaciones complejas de ARN ( 1). Refinamientos
de estos métodos ahora permiten el análisis de los desequilibrios número de
copias y la amplificación del gen de ADN ( 2) y recientemente se han aplicado
al análisis sistemático de la expresión a nivel de proteínas ( 3).
Muchos de los principios guía de análisis global utilizando microarrays son,
en principio, aplicable en el ARN, ADN, o nivel de proteína. En esta revisión
nos centramos nuestra atención en las tecnologías de microarrays aplicadas
a la anal-
1 Microarrays Center, Centro de Genómica Clínica, Universidad Health Network, Toronto,
Ontario, Canadá M5G 1L7.
2 Instituto del Cáncer de Ontario, Princess Margaret Hospital, University Health Network,
Toronto, Ontario, Canadá M5G 2L9.
Departamentos de Medicina 3 Biofísica y 4 Medicina de Laboratorio y Biopatología, Universidad
de Toronto, Toronto, Ontario, Canadá M5G 2L9.
* Autor para la correspondencia. Fax 416-946-2065; e-mail jeremy.squire @ utoronto.ca.
Recibido el 2 de de abril de 2002; aceptado 21 sin de mayo de del 2002.
1170
Diagnóstico del Cáncer:
Revisión
Ysis de ARN, con énfasis en el estudio de los cambios de expresión génica en
tumores. Discusión cubriendo detalles relativos a los métodos descritos a
continuación, y un glosario de términos que se utilizan comúnmente en el
análisis de microarrays están dentro de los materiales complementarios a este
artículo (www.utoronto.ca/cancyto/CLINCHEM). Cualquier estudio de
microarrays normalmente implica seis etapas (véase la Fig. 1), y las secciones
siguientes se resumir algunos de los parámetros críticos en el diseño general y
la optimización de análisis de microarrays de ARN para el estudio de la
expresión génica.
fabricación de microarrays
manchas arrays se fabrican utilizando xyz robots que utilizan pasadores huecos para
depositar cDNA (productos de PCR) o oligonucleótidos cortos en portaobjetos de
microscopio de vidrio con un recubrimiento especial ( 4). tamaños de punto oscilan
entre 80 y 150 m de diámetro, y las matrices que contienen hasta 80 000 puntos
pueden ser obtenidos. Secuencias de genes que se vista se seleccionan de entre
varias bases de datos públicas, que contienen recursos para acceder a genes bien
caracterizados y las etiquetas de secuencias expresadas (EST) 5 representante de
genes de función desconocida. Los clones seleccionados se amplifican a partir de
bibliotecas de ADNc apropiadas por PCR y se purificaron antes de la detección en el
soporte sólido.
Además de su precio más bajo y flexibilidad en el diseño, manchas arrays
ofrecen la ventaja de permitir el análisis de la expresión simultánea de dos
muestras biológicas, tales como muestras de ensayo y de control. Esta
comparación directa de los perfiles de expresión de dos muestras biológicas,
tales como las células no tratadas en comparación con las células tratadas o
tejido sano en comparación con el cáncer, es una enorme ventaja para cualquier
análisis pairwise. Por otra parte, debido a que estas matrices se pueden
observar con miles de genes y las tecnologías ecológicamente racionales de
función desconocida expresadas secuenciados, ofrecen el potencial para el
descubrimiento de nuevos genes y la definición de su papel en la enfermedad.
Una desventaja de manchas arrays es que proporcionan información
5 abreviaturas no estándar: EST, etiqueta de secuencia expresada; EOC, cáncer ovárico
epitelial; CGH, hibridación genómica comparativa; ISH, hibridación in situ; y IHC,
inmunohistoquímica.
 Química Clínica 48, No. 8, 2002 1171

Fig. 1. Los seis pasos en un experimento de microarrays. Siguiendo la nomenclatura estándar para los procedimientos de microarrays ( 44), en esta revisión nos referimos a los ácidos nucleicos unidos a los microarrays
como la “sonda” y el ADNc marcado fluorescentemente o radiomarcada se hibridó a la matriz como el “objetivo”.

sólo en la expresión génica relativa entre células específicas o muestras de
tejido en lugar de cuantificación directa de la expresión del ARN.
Affymetrix GeneChips TM son producidos por la síntesis de decenas de
miles de oligonucleótidos cortos in situ en obleas de vidrio, un nucleótido a la
vez, usando una modificación de la tecnología de fotolitografía
semiconductor ( 1, 5). Generalmente, GeneChips están diseñados con 16-20
oligonucleótidos que representan a cada gen en la matriz. Cada
oligonucleótido en el chip se empareja con una casi idénticas, que sólo
difieren por una, único desajuste base central. Esto permite la determinación
del grado de unión no específica mediante la comparación de la intensidad
de la unión entre los dos oligonucleótidos socio de destino. La principal
ventaja de GeneChips Affymetrix es su capacidad para medir la expresión
absoluta de genes en células o tejidos. Sus desventajas, además de su
mayor
costos, incluyen su incapacidad actual para comparar simultáneamente, en la
misma matriz, el grado de expresión de dos muestras biológicas relacionadas.
Además, microarrays basados ​en oligonucleótidos requieren un conocimiento
a priori de las secuencias génicas y requieren manipulación computacional
complejo para convertir las 40 señales de características en un valor de
expresión real. Más recientemente, las matrices de oligonucleótidos se han
desarrollado que combinan algunas de las flexibilidades y ventajas cualitativas
asociados con el uso de matrices de sondas sintéticas con los beneficios de
análisis simultáneo que ofrece la matriz de vidrio manchado ( 6).
En nuestros laboratorios, se utilizan los microarrays de ADNc manchadas
de 1700 o 19 200 genes y EST fabricados en la Red de Salud de microarrays
Centro Universitario (http://www.microarrays.ca) para estudiar la progresión
tumoral y la respuesta del paciente al tratamiento en varios sólidos humanos
tumores.
1172 Macgregor y Squire: Microarray de perfiles de expresión génica en el cáncer
diseño experimental y la elección de referencia
El diseño cuidadoso al principio es crucial para el éxito de los experimentos de
microarrays. En la investigación del cáncer, de casos y controles, bloqueadas y
diseños de perfiles al azar predominan. En un estudio de casos y controles, dos
muestras de un solo individuo,
por ejemplo, tejido tumoral y tejido sano, se comparan directamente. Debido a la
variabilidad del paciente y la heterogeneidad genética son cuestiones clave en el
análisis de datos de microarrays, el diseño de casos y controles es una solución
excelente cuando sea factible.
diseños bloqueados se usan típicamente para estudiar el efecto de un tratamiento o
condición de crecimiento en una muestra tal como una línea celular. Se han utilizado con
éxito para examinar líneas celulares cultivadas bajo diferentes condiciones (por ejemplo,
cultivadas en presencia o ausencia de un medicamento contra el cáncer) o diferentes líneas
celulares relacionados (por ejemplo, de tipo salvaje vs mutante, las células no transfectadas
vs células transfectadas). diseños de perfiles al azar son ampliamente utilizados en los
experimentos de microarrays cuando las líneas de células o muestras de los pacientes se
seleccionan y perfiladas. La mayoría de los “papeles de perfiles” han utilizado este diseño,
que ofrece la posibilidad de utilizar los datos de muchos individuos diferentes, pero no
ofrece ningún control intrínseco de sesgo en las poblaciones de pacientes o poblaciones
celulares utilizadas.
En tanto los diseños de perfiles bloqueados y aleatorios, la muestra se
compara típicamente con un común o de referencia “universal”, que debe tener
una representación adecuada de la mayoría de los genes en la matriz se traza el
perfil y ser fácilmente disponibles. Disponible comercialmente de ARN de
referencia es a menudo una buena elección debido a la representación gen
amplia (por ejemplo, Stratagene y Clontech). El uso de una referencia común
también ofrece la ventaja de permitir un análisis comparativo longitudinal entre
varios proyectos de microarrays entre los diferentes grupos de investigación
interesados ​en un aspecto común de la investigación del cáncer, tales como la
progresión del tumor o la resistencia a los fármacos contra el cáncer.
Recientemente, hemos utilizado una piscina de 9 líneas celulares para
establecer los perfiles de expresión de una serie de 15 muestras de cáncer de
ovario ( 7).
La importancia de repeticiones no se puede exagerar, porque la
variabilidad puede ser muy alta en los experimentos de microarrays. Muchos
grupos, incluyendo el nuestro, también elegir para llevar a cabo los llamados
“reversiones de tinte”, en los que una matriz de duplicados se hibridaron con
la muestra experimental marcado con un fluoróforo y la muestra de
referencia con el otro colorante. La matriz duplicado correspondiente se
hibrida luego con muestras experimentales y las muestras de referencia
marcado con los fluoróforos opuestas. Esta estrategia genera datos
replicados y equilibrar la posible eficacia diferencial de la incorporación de
tinte entre las muestras de ARN.
orientar la preparación y la hibridación
Tanto el ARN total y el ARNm se pueden utilizar para los experimentos de
microarrays y permiten la consecución de datos de alta calidad con un alto
grado de confianza. ARN de alta calidad es crucial para el éxito experimentos
de microarrays. Diferentes metodologías de extracción de ARN estándar se han
utilizado con éxito, y la elección del protocolo es en gran medida una cues-
ción de la experiencia personal. La evaluación cuantitativa y cualitativa del ARN
obtenido se puede llevar a cabo por técnicas estándar, tales como electroforesis
en gel de agarosa, pero está limitada por las cantidades relativamente grandes
de muestra requerido. Más recientemente, la evaluación de la calidad y la
cantidad de ARN se ha facilitado en gran medida por el uso de dispositivos
basados ​en microcapilares como el Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies),
que puede ser utilizado con tan poco como 5 ng de ARN total.
Una de las limitaciones actuales en la aplicación de rutina de la tecnología
de microarrays para muestras de pacientes es suficiente disponibilidad de ARN.
Por lo tanto, ha habido un considerable interés en el desarrollo de estrategias de
amplificación de ARN que facilitan la extracción de ARN a partir de muestras de
captura láser microdissected (LCM), tales como biopsias con aguja fina. Para los
experimentos de microarrays estándar, el ARN aislado es transcrito de forma
inversa en ADNc diana en presencia de fluorescente (generalmente Cy3-dNTP o
Cy5-dNTP) o desoxinucleótidos marcados radiactivamente ([ 33 P] - o [ 32 PAG]- dCTP).
Después de la purificación y la desnaturalización, las dianas marcadas se
hibridan con las micromatrices a una temperatura determinada por el tampón de
hibridación utilizado. Después de la hibridación, los arrays se lavan en
condiciones restrictivas para eliminar unión a la diana no específica y se secan
al aire.
adquisición de imágenes y cuantificación
procesamiento de imágenes Microarray utiliza diferenciales de excitación y
emisión longitudes de onda de los dos compuestos fluorescentes para obtener
una exploración de la matriz para cada longitud de onda de emisión, típicamente
como dos imágenes TIFF en escala de grises de 16 bits. Estas imágenes se
analizan a continuación para identificar los puntos, calcular sus intensidades de
señal asociadas, y evaluar el ruido de fondo local. La mayoría de los paquetes
de software de adquisición de imágenes también contienen herramientas
básicas de filtrado a manchas tales como manchas bandera extremadamente
baja intensidad, fantasmas puntos (donde el fondo es mayor que la intensidad
de punto), o puntos dañados (por ejemplo, artefactos de polvo). Estos resultados
permiten una relación inicial de la intensidad del canal canal / de referencia
evaluados para ser calculado para cada punto en el chip. Los productos de la
adquisición de imágenes son el emparejamiento de imagen TIFF y un archivo de
datos cuantificados que aún no se ha normalizado.
bases de datos y normalización
La cantidad de datos que se generan en un experimento de microarrays normalmente
requiere un sistema de base de datos dedicada para almacenar y organizar los datos de
microarrays e imágenes. El primer papel de una base de datos de microarrays local es
el almacenamiento y anotación (descripción de los parámetros experimentales) de
experimentos de microarrays por el investigador que diseñó y llevó a cabo los
experimentos de microarrays. Además, en la actualidad existe un creciente interés
mundial en la fabricación de conjuntos de datos de microarrays a disposición del público
en un formato estandarizado. Esto permitiría que otros investigadores puedan reproducir
los experimentos de microarrays publicados, para verificar de forma independiente por
lo tanto ellos, para comparar los conjuntos de datos a través de diferentes
 Química Clínica 48, No. 8, 2002
plataformas de microarrays, y conjuntos de datos de microarrays importante,
para interrogar publicados por el uso de diversas herramientas bioinformáticas
para explorar diferentes problemas biológicos. Para responder a esta necesidad,
la información mínima sobre un experimento de microarrays, o la norma MIAME,
ha sido propuesto por la organización MGED (http://www.mged.org) como una
serie de criterios que deben utilizarse al definir parámetros del experimento de
microarrays. En nuestro grupo, entramos en todos los microarrays de datos en
una base de datos de microarrays local (GeneTraffic; Iobion Informática), que
contiene todos los archivos de datos de microarrays y las imágenes TIFF, así
como una anotación MIAME de apoyo de nuestros experimentos.
Una vez que los datos se han cargado en la base de datos, que se normalizan
y se calculan las estadísticas agregadas. La normalización es un proceso que
escala las intensidades de terreno de tal manera que los coeficientes normalizados
proporcionan una aproximación de la relación de la expresión génica entre las dos
muestras. La discusión de las diferentes estrategias para la normalización de los
datos de microarrays está más allá del alcance de este artículo de revisión, pero la
elección de un método de normalización robusta y adecuada es crucial para la
calidad de los datos obtenidos, según el diseño experimental del propio
experimento de microarrays. Una discusión de los métodos de normalización se
proporciona en materiales complementarios a este artículo (www.utoronto. Ca /
cancyto / CLINCHEM).
análisis estadístico y la minería de datos
El análisis de grandes conjuntos de datos de expresión génica es una nueva
área de análisis de datos con sus propios desafíos. métodos de minería de
datos por lo general caen en una de dos clases: supervisada y no supervisada.
En el análisis no supervisado, los datos se organizan sin el beneficio de la
información de clasificación externa. Agrupación jerárquica ( 8), agrupación
Kmeans ( 9, 10), o mapas autoorganizados ( 11) son ejemplos de enfoques de
agrupamiento no supervisados ​que han sido ampliamente utilizados en el
análisis de microarrays ( 8, 12-15).
análisis supervisado utiliza alguna información externa, tal como el estado de la
enfermedad de las muestras estudiadas. análisis supervisado consiste en elegir de
todo el conjunto de datos un conjunto de entrenamiento y un conjunto de pruebas y
también comprende la construcción de clasificadores, que asignan clases predefinidas
de perfiles de expresión. Una vez que el clasificador ha sido entrenado en el conjunto
de entrenamiento y probado en el conjunto de pruebas, que luego se puede aplicar a
los datos de clasificación desconocida. métodos supervisados ​incluyen k-más cercana
clasificación vecino, máquinas de vectores de soporte, y redes neuronales. Golub et al.
( dieciséis)
utilizado una estrategia vecino k-más cercana para clasificar los perfiles de
expresión de muestras de leucemia en dos clases: leucemia mieloide aguda y
leucemia linfocítica aguda. Recientemente Su et al. ( 17) usado a gran escala
de ARN de perfiles y algoritmos de aprendizaje automático supervisadas para
construir una clasificación molecular de 10 carcinomas (próstata, pulmón,
ovario, colon y recto, riñón, hígado, páncreas, vejiga / uréter y
gastroesophagus). Del mismo modo, el análisis de red neural ha sido utilizado
por Khan et al. ( 18) para delinear patrones consistentes de la expresión génica
en el cáncer.
1173
Tusher et al. ( 19) recientemente propuesto una estrategia llamada SAM
(análisis de la importancia microarrays), que permite la determinación de genes
expresados ​diferencialmente de manera significativa entre los grupos de
muestras analizadas por arrays de expresión. Hemos usado este enfoque para
reducir el análisis a un subconjunto de genes que también fueron muestra que se
expresó diferencialmente cuando se analizaron por la agrupación jerárquica
bidimensional convencional. Como veremos más adelante, hemos identificado
recientemente genes que muestran expresión diferencial entre las primeras
etapas del cáncer epitelial de ovario (EOC), EOC en etapa tardía, y el ovario
sano (Fig. 2).
De perfiles de expresión Aplicada a la Biología del Cáncer
El cáncer es causado por la acumulación de cambios genéticos y epigenéticos
que resultan de la secuencia alterada o expresión de genes relacionados con el
cáncer, tales como oncogenes o genes supresores de tumor, así como genes
implicados en el control del ciclo celular, la apoptosis, la adhesión, la reparación
del ADN, y angiogénesis. Dado que los perfiles de expresión génica
proporcionan una instantánea de las funciones y procesos de las células en el
momento de la preparación de muestras, análisis combinatorio integral de los
patrones de expresión génica de miles de genes en células tumorales y
comparación con el perfil de expresión obtenido con las células sanas deben
proporcionar información relativa a cambios consistentes en la expresión de
genes que están asociados con la disfunción celular del tumor y cualquier vías
de regulación concomitantes. la tecnología de microarrays ha sido ampliamente
utilizado en los últimos 3 años para investigar la clasificación de tumores, la
progresión del cáncer, y la resistencia a la quimioterapia y la sensibilidad. En
esta sección ofrecemos tres ejemplos para demostrar que los arrays de
expresión se pueden utilizar para obtener una mejor comprensión de la biología
básica, diagnóstico y tratamiento del cáncer.
clasificación de tumores molecular
Las mejoras en la clasificación de tumores son fundamentales para el desarrollo
de nuevos e individualizados enfoques terapéuticos. Tumores histológicamente
indistinguibles a menudo muestran diferencias significativas en el comportamiento
clínico y subclasificación de estos tumores en función de sus perfiles moleculares
pueden ayudar a explicar por qué estos tumores responden de manera diferente
al tratamiento. En un estudio de la señal, Golub et al.
Fig. 2. agrupación jerárquica bidimensional de datos de microarrays obtenidos con 22 muestras
de tejido de ovario. Las muestras incluyen 15 temprana o tardía etapa EOC serosa y 7 ovarios
sanos. A-E
representan distintos grupos de genes cuya expresión permite la distinción entre principios de EOC, a finales
EOC, y el ovario sano ( Normal).
1174 Macgregor y Squire: Microarray de perfiles de expresión génica en el cáncer
(dieciséis) la tecnología de microarrays aplicada para desarrollar clasificaciones
innovadoras de leucemias, utilizando el análisis de microarrays basado en el
“análisis de vecindad” y la utilización de los factores predictivos de la clase de
tumor. Esta estrategia fue capaz de distinguir entre la leucemia mieloide aguda
y leucemia linfocítica aguda sin análisis de supervisión. Otros grupos también
han utilizado el análisis de patrón de expresión génica a clasificar, a nivel
molecular, los tumores de mama ( 20, 21),
linfoma de células B ( 14), melanoma cutáneo ( 22), y el adenocarcinoma de
pulmón ( 23, 24). Del mismo modo, en un estudio reciente análisis de los perfiles
moleculares de 50 muestras de próstata no neoplásicas y neoplásicas,
Dhanasekaran et al. ( 25)
establecidos los perfiles de expresión de la firma de salud de la próstata,
neoplasia benigna de próstata, cáncer de próstata localizado, y el cáncer de
próstata metastásico. Estos estudios establecieron la posibilidad de combinar el
análisis molecular a gran escala de perfiles de expresión con morfológica clásico
y métodos clínicos de la estadificación y el cáncer de prueba para un mejor
diagnóstico y la predicción de resultados.
sensibilidad a los fármacos
A pesar de los considerables avances en el tratamiento del cáncer, la resistencia
adquirida a los fármacos quimioterapéuticos sigue siendo un obstáculo importante en el
tratamiento del paciente y el resultado global. resistencia a los medicamentos contra el
cáncer se cree que ocurre a través de numerosos mecanismos, y microarrays de ofrecer
un nuevo enfoque para el estudio de los mecanismos celulares implicados en estos
mecanismos y en la predicción de sensibilidad a los fármacos y los efectos secundarios
inesperados. La mayoría de los estudios de matriz se han llevado a cabo utilizando
líneas celulares de cáncer que se hizo resistente a medicamentos contra el cáncer
comúnmente usados. Por ejemplo, Kudoh et al. ( 26) seguimiento de los perfiles de
expresión de las células inducida por la doxorrubicina y cáncer resistente a en un intento
de obtener la huella dactilar molecular de medicamentos contra el cáncer en células de
cáncer. Scherf et al. ( 27) analizado un subconjunto de 1400 genes a partir de un estudio
reportado por Ross et al.
(28) y estudiado la correlación entre los perfiles de expresión y el mecanismo
farmacológico de acción de un panel de 118 medicamentos contra el cáncer. La
obtención de más conocimientos sobre el mecanismo de acción de los fármacos
contra el cáncer y las diversas rutas implicadas en la resistencia a los fármacos
puede eventualmente ser muy valiosa para el diseño de tratamientos más
estratégicas que son más apropiadas para un tumor individual.
identificación de marcadores moleculares específicos de tumores
Varios grupos de investigación se han centrado en la identificación de
subconjuntos de genes que muestran expresión diferencial entre los tejidos
sanos o líneas celulares y sus homólogos tumorales para identificar
biomarcadores para varios tumores sólidos, incluyendo los carcinomas de ovario
( 7, 29-32), cáncer oral ( 33),
el melanoma ( 34), cáncer colonrectal ( 35), y el cáncer de próstata
(36). En nuestro estudio reciente ( 7) llevado a cabo en una cohorte de 13
pacientes con EOC, hemos identificado un subconjunto de genes que muestran
expresión diferencial entre ovarios sanos y los tumores de ovario (Fig. 2).
Algunos de estos genes, tales como metalotioneína 1G, que fue encontrado ser
regulado up-
en muestras de tumores, están implicados en la resistencia a la cisplatino
medicamento contra el cáncer y podría ser un indicador de la resistencia de
pretratamiento de estos tumores a cisplatino. Otros genes identificados en
nuestro estudio, tales como el gen de la osteopontina, que era fuertemente
regulados hasta en algunas muestras tumores y que ha demostrado ( 37) para
ser secretada en el suero de pacientes con cáncer metastásico, podría ser un
excelente candidato para biomarcadores de la progresión tumoral en EOC.
Uno de los retos más importantes investigadores usando el análisis de
microarrays es determinar cuál de la plétora de nuevos genes expresados
​diferencialmente es biológicamente relevante para siendo estudiado el
sistema de tumor. Incluso cuando se hacen esfuerzos rigurosos para reducir
al mínimo el número de variables en un estudio de microarrays, puede haber
un número inmanejable de los genes expresados ​diferencialmente que
contribuirán valores de fondo excesivas. Por lo tanto, la combinación de
análisis de microarrays de expresión con otros enfoques, en particular
técnicas de citogenética, tales como cariotipo espectral y el cromosoma y
matriz de hibridación genómica comparativa (CGH) ( 2),
ofrece la posibilidad de centrarse en subconjuntos significativamente menor de genes
de importancia directa para la biología tumoral ( 7).
Monni et al. ( 38) y Barlund et al. ( 39) recientemente utilizado una combinación
de arrays de expresión y técnicas de CGH array en líneas celulares de cáncer
de mama y se han identificado un número limitado de genes que se amplifican
y tanto sobreexpresados. [Para una revisión, véase Monni et al. ( 40), como se
ilustra en la Fig. 3].
Finalmente, la validación de la expresión relativa obtenida a partir de
análisis de microarrays de todo el genoma es crítica. Varios enfoques pueden
ser elegidos, a partir de análisis de Northern de base o semicuantitativa de
transcripción inversa-PCR para la hibridación in situ (ISH) usando micromatrices
de tejido. Mousses et al. ( 41) recientemente analizado la expresión de varios
genes candidatos asociados con cáncer de próstata que se habían identificado
previamente por análisis de cDNA microarray. microarrays de tejidos
construidos a partir de 544 biopsias histológicas fueron analizadas por ISH
usando sondas de ARN y / o por inmunohistoquímica (IHC) utilizando
anticuerpos. Hubo una excelente correlación entre los resultados cDNA
microarrays y los resultados obtenidos con ISH y análisis de transferencia
Northern. Además, la expresión de proteínas evaluadas por IHC también fue
consistente con la expresión del ARN. Del mismo modo, Dhanasekaran et al. ( 25)
tecnologías comparables utiliza para confirmar la sobreexpresión de hepsina y
PIM-1 en cáncer de próstata (Fig. 4).
aplicaciones prácticas y futuras de la tecnología de
microarrays
El número de estudios basados ​en microarrays de identificación de nuevos genes
o vías moleculares implicados en la clasificación de tumores, la progresión del
cáncer, o el resultado del paciente están creciendo exponencialmente. Nos
acercamos a lo que se conoce como la “era postgenómica”, durante el cual serán
interrogados los genes, y biomarcadores de pronóstico de respuesta al
tratamiento de diagnóstico identificados por el cribado de microarrays para
proporcionar una gestión personalizada de los pacientes.
 Química Clínica 48, No. 8, 2002 1175

Fig. 3. Detección de genes amplificados y sobreexpresados ​por técnicas de microarrays de ADNc y CGH en la línea celular de cáncer de mama MCF7. ( una), copia del perfil relación de número para el cromosoma 17
obtenido a partir de análisis de CGH convencional indica una gran región de la amplificación de alto nivel en 17q23. ( segundo), microarrays de CGH ( parte superior) y cDNA microarray ( fondo) análisis de la línea celular de cáncer de mama
MCF7. El mismo formato de micromatriz de ADNc que contiene el cromosoma los genes y EST 17 específica se utiliza para ambos análisis. Después de la hibridación con el ADN tumoral marcado con rojo (CGH microarrays; parte superior) o
cDNA (cDNA microarray; fondo) contra una muestra de referencia con la etiqueta verde, los genes que se amplifican y sobreexpresados ​se visualizan como puntos rojos. los inserciones mostrar tres regiones en la micromatriz de ADNc con
un aumento mayor, visualizando la amplificación ( paneles de la izquierda) y la sobreexpresión ( paneles de la derecha) de tres genes, MUL, RPS6KB1, y APPBP2, que están situados en 17q23 por ISH de fluorescencia. Esto corresponde a
la misma región en la que la amplificación fue visto por CGH. ( re), amplificación RPS6KB1 de alto nivel en las células MCF7 como se visualiza por ISH fluorescencia interfase. De Monni et al. ( 40).

Fig. 4. Hepsin se sobreexpresa en el cáncer de próstata. ( UNA), análisis de transferencia Northern de hepsin humana y la normalización con GAPDH. SIESTA, de próstata normal adyacente; PCA, cáncer de próstata localizado. ( SEGUNDO),
microarrays de tejidos utilizados para el análisis hepsina (tiñeron con hematoxilina y eosina). ( DO), elementos representativos de un microarray de tejido teñidas con anticuerpo anti-hepsin. IHC demuestra tinción débil o ausente de la próstata
benigna y fuerte tinción en el cáncer de próstata localizado. ( RE), glándulas benignas de la próstata demuestran una fuerte tinción de células basales ( panel

1) pero la expresión débil en las células luminales secretoras ( panel 2). De Dhanasekaran et al. ( 25).
1176 Macgregor y Squire: Microarray de perfiles de expresión génica en el cáncer
Los médicos serán capaces de utilizar microarrays durante los primeros
ensayos clínicos para confirmar los mecanismos de acción de los fármacos y
para evaluar la sensibilidad al fármaco y toxicidad. Junto con el análisis
bioquímico más convencional, tal como IHC y ELISA, microarrays serán
utilizados para los propósitos de diagnóstico y pronóstico. Un ejemplo reciente
de una posible traducción de este tipo “banco a la cama”, fue publicado por Kim
et al. ( 42). El gen de la osteopontina, que codifica una glycophosphoprotein
calciumbinding, había sido identificado por el análisis de microarrays de ADNc
como siendo hasta reguladas en cáncer de ovario ( 43). En su estudio, Kim et al.
( 42) mostró que el cribado de muestras de plasma de pacientes con cáncer de
ovario reveló que las concentraciones de proteína osteopontina en plasma
fueron significativamente mayores en una mayoría de pacientes con cáncer de
ovario en comparación con los controles sanos. Este estudio demostró el valor
potencial de análisis cDNAmicroarray en la identificación de genes de
biomarcadores en el cáncer y la viabilidad de posteriormente pruebas de estos
genes a nivel de proteínas mediante ensayos bioquímicos convencionales.
Aunque los principales factores limitantes para el uso rutinario en un entorno
clínico en la actualidad son el costo y el acceso a la tecnología de microarrays,
es probable que los costos disminuirán en un futuro próximo y que la tecnología
será cada vez más fácil de usar y automatizada.
Conclusión
La gama de aplicaciones de la tecnología de microarrays es enorme. Estudios
recientes en el cáncer humano han demostrado que microarrays se pueden utilizar
para desarrollar una nueva taxonomía molecular de cáncer, incluyendo el
agrupamiento de los cánceres de acuerdo con grupos de pronóstico sobre la base
de perfiles de expresión génica. La lista de posibles usos de esta técnica no se
limita a la investigación del cáncer. Por ejemplo, el impacto temporal sobre la
expresión génica por las drogas, las toxinas ambientales, o oncogenes puede ser
dilucidado, y las redes de regulación y los patrones de coexpresión entonces
puede ser descifrado. En los 6 años desde su creación, la tecnología de
microarrays se ha convertido en una herramienta importante para la investigación
de la expresión génica global de todos los aspectos de la enfermedad humana y
en la investigación biomédica.
Agradecemos al Dr. Jim Woodgett y Jason Gonçalves para la revisión crítica
de este manuscrito, y Monique Albert para ayudar en la figura diseño y
preparación de manuscritos.
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