UNIVERSIDAD PEDAGOGICA Y TECNOLOGICA DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE MEDICINA

GUIA LABORATORIO BIOLOGIA MOLECULAR

AISLAMIENTO DE ADN HUMANO A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA

Cuando tenemos frente a nosotros un ser vivo, podemos pensar en las barreras que están
entre nosotros y su ADN; es decir, membranas celulares, citoplasma, membrana nuclear y
proteínas histonas y no histonas. Para extraer ADN debemos hacer estrategias para sobrepasar
estas barreras. A lo largo de esta práctica de laboratorio vamos a seguir pasos que resuelven
estos problemas por medio de propiedades físicas de la materia.

Objetivos

Familiarizarse con las técnicas de aislamiento de ADN usadas y biología molecular

Familiarizarse con las proporciones usadas en bilogía molecular

Meditar cada uno de los aspectos del flujograma de la extracción de ADN

Materiales

Tubos de microcentrífuga de 2ml para 300microlitros de sangre

Baño de maría a 37°C

Isopropanol a temperatura ambiente

Etanol 70% a temperatura ambiente

Baño de maría a 65°C

Kit Wizard® Genomic DNA Purification

1. Previa asepsia y antisepsia recolecte la muestra de sangre del donante con un tubo
tapa lila EDTA
2. Deposite en un tubo de 2ml, 900 microlitros de solución estéril de Cell Lysis
3. Agite el tubo de la muestra de sangre gentilmente hasta que el contenido que bien
mezclado
4. Tome 300 microlitros de la muestra de sangre y viértalos en el tubo de 2ml con
solución Cell Lysis, invirtiendo 5 a 6 veces para que se mezcle el contenido
5. Incube la mezcla a temperatura ambiente por 10 minutos (invirtiendo dos o tres veces
la mezcla durante la incubación)
6. Centrifugue entre 13000 a 16000G por 20 segundos a temperatura ambiente
7. Remueva y deseche tanto sobrenadante como sea posible sin dañar el precipitado
visible aproximadamente 50 a 100 microlitros, si la sangre ha sido congelada repita los
pasos 5 a 7 hasta que el precipitado quede blanco; Si el precipitado parece contener
solo células rojas también repita los pasos 5 a 7
8. Con el vortex® por 10 a 20 segundos resuspenda las células
9. A las células resuspendidas agréguele 300 microlitros de Solución Nuclei Lysis, pipetee
por 5 a 6 veces para romperlas células blancas, la solución debe llegar a ser muy
viscosa. Sí son visibles grumos de células incubar la solución a 37°C, si después de una
hora persiste la presencia de grumos celulares agregue otros microlitros de 100 en
100 hasta300 microlitros de Solución Nuclei Lysis y repita la incubación
10. Opcional: adicione solución de ARNasa 1.5 ml para 300 microlitros de sangre para lisar
los núcleos y mezcle la muestra por inversión 2 a 5 veces. Incube la muestra a 37°C por
15 minutos y entonces enfrié a temperatura ambiente
11. Agregue solución de precipitación de proteínas 100 microlitros por cada 300
microlitros de de sangre para lisis nuclear y colocar en Vortex ® vigorosamente por 10
a20 segundos, pequeños grumos de proteínas pueden ser visibles después de hacer
Vortex; si se adicionó solución de lisis de núcleos adicional agregar 130microlitros mas
de solución de precipitación de proteínas.
12. Centrifugue entre 13000G a 16000G por 3 minutos a temperatura ambiente se debe
observar un precipitado oscuro de proteínas
13. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo limpio de 2.5 ml con 300 microlitros de
isopropanol, mezcle gentilmente la solución hasta que las hebras de ADN sean visibles
como una masa
14. Centrifugue entre 13000G a 16000G por 1 minuto a temperatura ambiente.
15. Decante el sobrenadante y adicione un volumen de etanol a 70% proporcional al
precipitado de ADN inviertas vigorosamente y vuelva a centrifugar repitiendo los pasos
14 y 15
16. Con una pipeta pasteur o una punta de secuenciamiento retire el etanol, evitando
dañar el precipitado de ADN invierta el tubo en papel absorbente limpio y seque el
sobre nadante por 10 a 15 minutos
17. Adicione al tubo solució0n de rehidratación de ADN 100microlitros por cada 300
microlitros de muestra original de sangre incubando la muestra a 65°C
18. Incube la muestra de ADN a temperatura ambiente por 8 horas y guárdela entre 2 y
8°C

Bibliografía

Promega Wizard®Genomic DNA Purification Kit Technical manual Instructions for use of
products A1120, A1123, A1125 and A1620 TM050