Espectrofotometria: metodo instrumental analitico que nos permite cuantificar y caracterizar un

compuesto en solucion. Usando las propiedades de los atomos y moleculas para absorber o emitir la
energia en una de las muchas areas del espectro electromagnetico total de la luz

Luz ultravioleta

Luz visible

Luz infrarroja

Las radiaciones que componen el espectro de luz visible contiene la Energia capaz de excitar la retina
y producir el fenomeno de la vision luz en colores humanos

La energia se propaga en el espacio en forma de onda, como longitud de onda, distancia que existe
entre una cresta y otra cresta de la onda, donde mas proxima este la cresta mayor sera la energia

Usando el nanometro como unidad de medida

Las tecnicas fotometricas utilizan aquellas longitudes de onda del espectro de luz ultravioleta y luz
visible de una longitud de onda de 380 a 750

Las moleculas interactuan con la radiacion electromagnetica a traves de fenomenos de reflexion,

refraccion, absorcion, ionizacion, interferencia, difraccion, polarizacion

Los metodos fotometricos se basan en el fenomeno de absorcion, como la cantidad que es abosrbida
en forma caracteristica por cada compuesto en particular

La cantidad abosrbida contienen valores energeticos especificos para mantener la estructura

molecular del compuesto

Las longitudes que no son absorbidas seran transmitidas, reflejadas, difractadas. Estas llegan al ojo
humano y son traducidas en un color por el cerebro

El espectrofotometro se usara para usar estas tecnicas

Espectro de absorcion = curva graficada en absorbancia del compuesto ( eje Y) versus longitud de
onda ( eje x) presentando uno o mas maximos de absorcion identifcando la longitud de onda del
compuesto en el rango de luz visible de 400 a 700 nm Habitualmente, la longitud de onda (color) de la
luz que una sustancia absorbe, corresponde al color

complementario al que la sustancia tiene. Si una solución tiene color rojo, el color que absorbe con
mayor intensidad

es el verde (figura 5). Estas relaciones tienen igual valor en sentido inverso.
Procedimiento.

1. Una vez encendido y calentado el fotómetro, coloque la escala en cero con la perilla de la izquierda.

2. Seleccione la primera longitud de onda elegida.

3. Usando el tubo que contiene el blanco colorimétrico, lleve a cero de absorbancia con la perilla
apropiada (ubicada a

la derecha).

4. Una vez puesto el instrumento en cero de absorbancia, coloque el tubo de lectura que contiene la
muestra y registre

la absorbancia.

5. Repita los pasos 2 a 4, hasta que tenga las absorbancias de todas las longitudes de onda elegidas y
complete la

tabla.

Cuando obtenga todas las absorbancias, confeccione una gráfica en la cual el eje Y será la Absorbancia y
el eje X las

longitudes de onda. Recuerde que su primera longitud de onda es 400 nm, por lo que el eje X empieza en
400 nm.

Leyes de fotometria:

ley de bourguer: a igual grosor de material absorbente, se absorbera una fraccion constante de energia
que incide sobre el

Absorbera una fraccion constante: de la energia disponible solo una fraacion sera absorbida y la demas
transmitida

De la energia que incide sobre ella: se mide la energia que se transmite por medio de un material
absorbente

Mientras mas grueso sea el material absorbente mayor sera la absorcion, y mientras mayor sea la
concentracion de moleculas absorbentes mayor sera la absorcion

Así, la absorbancia es directamente proporcional al espesor (l) y a la concentración (c) de una solución y,

además, depende de una constante ε(coeficiente de extinción ) que es característica de cada

sustancia, a una longitud
de onda y solvente determinados. Por lo tanto, si mantenemos constante el espesor o largo ( 1) de una
solución, la

densidad óptica de dicha solución dependerá exclusivamente de su concentración (c) y esto nos permite
medir la

concentración de las sustancias en solución.

Curva de calibracion:

Determinacion experimental: la sustancia debe poseer una longitud de onda maxima de absorbancia, si
no es coloreada se aplica un procedimiento o reaccion que genere un compuesto con un maximo de
absorbancia, mantener constante el espesor del paso de luz usando tubos especiales denominados cubetas
o tubos de fotometro

Pudiendo dar la ecuacion de lambert-beer de la siguiente forma --> A= K x c, la concentracion esta dada
por c= A/K

Calculo empirico: realizar una curva de calibracion, midiendo la aborbancia de una serie de soluciones en
concentraciones crecientes ( soluciones patrones) de una determinada sustancia, hacer una grafica en A
vs , para obtener K se realiza una calculo de la pendiente de la recta o alternativamente realizando K= A/c
y obtener el promedio de K

Curvas de calibracion aspectos basicos:

Se diseña haciendo una serie de soluciones patrones de concentracion creciente, destribuidas

uniformemente entre los limites de concentracion en que el metodo en estudio cumple la ley de
lambert-Beer

Solucion patron: es aquella que tiene una concentracion exactamente conocida de la sustancia o
compuesto en estudio

Solucion blanco: es aquella que contiene todos los reactivos necesarios para que proceda la reaccion,
excepto el compuesto en estudio

Hay metodos para darle color a las solucion ya que los compuestos son incoloros como los siguientes:

-biuret

-folin Lowry

- somogyi Nelson
-Fiske_ Subbarow

Procedimiento:

Aspectos importantes: cumlimiento de la ley de lambert-Beer, el mismo tubo de lectura para el ancho del
paso de la luz sea constante, absorbancia de la longitud de onda solamente del compuesto en estudio

Los pasos a seguir para llevar a cabo este laboratorio se pueden resumir como sigue:

1. Marcar 6 tubos de ensayo como indica el protocolo

2. Agregar los diferentes componentes siguiendo el orden que se estipula en el protocolo

3. Una vez agregado todos los reactivos mezclar muy bien para así obtener una solución de color
homogéneo

4. Recuerde que el fotómetro debe encenderse 15 minutos antes de leer. Pasado este tiempo poner la
escala en cero y

luego calibrar ó llevar la absorbancia a cero usando el tubo blanco colorimétrico.

5. Una vez calibrado el fotómetro, leer de menor a mayor concentración el resto de los tubos y registre los
valores de

absorbancia que se obtienen.

6. Finalmente realice una gráfica en papel milimetrado colocando en el eje Y la absorbancia y en eje X
las

concentraciones.

Metodo de biuret:

El biuret reacciona con el sulfato de cobre dando el compuesto de color violeta particularmente hacia las
proteinas

Reactivos :

Reactivo biuret

Solucion estandar de proteinas al 1%

Protocolo:
Se prepara una bateria de tubos , del blanco colorimetrico y los tubos patrones que contienen alicuotas de
solucion patron