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Biochemical analyses of the marine diatom Cylotella cryptica grown under

different nutritional condition for biotechnological applications
Conference Paper · June 2015
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Antonio Silvestro
University of Naples Federico II
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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI “FEDERICO II”
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA
CORSO DI LAUREA DI SCIENZE BIOLOGICHE
SCUOLA POLITECNICA E DELLE SCIENZE DI BASE
Analisi biochimiche della diatomea marina Cyclotella cryptica coltivata in differenti

condizioni nutrizionali per finalità biotecnologiche
Biochemical analyses of marine diatom Cyclotella Cryptica grown under different

nutritional conditions for biotechnological applications
Correlatrice
Cutignano Adele Laureando
Relatore Silvestro Antonio
Esposito Sergio Matr. N88/3042
Anno accademico 2014/2015
Antonio Silvestro Copyright (C) 2015 1

Al team dell’ICB-CNR per la ricerca
ed alla mia famiglia per lo sviluppo

INDICE
ABSTRACT pag. x
1. INTRODUZIONE pag. xx
1.1 Il fabbisogno energetico globale e le fonti rinnovabili
1.2 Il Biodiesel
1.3 Il potenziale delle microalghe
1.3.1 Le Diatomee
2. SCOPO DELLA TESI pag
3. MATERIALI E METODI pag
3.1 Allestimento delle colture della diatomea marina Cyclotella cryptica
3.1.1 Mezzo di coltura: composizione, preparazione e somministrazione
3.1.2. Fattori ambientali: luce, temperatura ed aereazione
3.2 Parametri controllati quotidianamente: concentrazione e morfologia
cellulare
3.3 Raccolta e preparazione campioni per le analisi biochimiche
3.4 Analisi biochimiche
3.4.1 Determinazione del contenuto dei lipidi
3.4.1.1 Estrazione con il metodo di Folch modificato
3.4.1.2 Estrazione con MTBE
3.4.1.3 Analisi qualitativa e quantitativa della composizione lipidica
3.4.2 Determinazione del contenuto dei carboidrati (Metodo di Dubois)
3.4.3 Determinazione del contenuto delle proteine (Metodo di Lowry)
4. RISULTATI E DISCUSSIONE pag
4.1 Curve di crescita e biomasse
4.2.1 Determinazione del contenuto dei lipidi, dei carboidrati e delle proteine
4.2.2 Analisi qualitativa e quantitativa della composizione lipidica
5 CONCLUSIONI pag
6 BIBLIOGRAFIA pag

ABSTRACT
Research stimulated by curiosity brings out new pieces that make up the puzzle of
life and invention provides the tools to assemble and interpret it. The Industrial
Revolution of past centuries has brought innovations not accompanied by a far-
sighted vision of the consequences that are manifesting in this globalized twenty-first
century, particularly with an increase in energy demand and global warming. The
emerging biotechnology revolution, which applies technology to biological systems,
could solve these problems without further deleterious effects if driven by
sustainable development. Research and development institutes, subsidized by
governments, are looking for renewable and sustainable energy resources that would
replace polluting fossil fuels nearly depleted.
Recently the investigation of the marine microalgae's potential in biotechnological

applications is increasing by the realization that the ocean is a relatively untapped
source of energy biomass and novel biomolecules. Microalgae mainly represent the
last generation suitable feedstock for the transport sector, but due to their
biochemical versatility are useful also for many others industrial fields such as
medical, pharmaceutical, food and cosmetic. Nowadays, biofuel production from
microalgae biomass is still in progress; the efficiency of each step during the whole
process, from culturing to refining, needs to be improved to get yield economically
reasonable. Coupling each other different industrial applications could lead to
overcome the substantial investments with proper earnings making, hopefully in the
next future, this living energy source lucrative, therefore commercially feasible.
In the last decades, researchers are focusing their attention on Diatoms, a taxon of
microalgae characterized by silica walls derived from secondary symbiotic event.
Diatoms are affected by seasonal exponential growth called blooms that place them
at the base of the oceans food chain, permit about 40% of atmospheric CO2 fixation
and significant influence the biogeochemical cycle of the macronutrients: silicon
(Si), nitrogen (N), phosphorus (P). This microalgae's group is a promising candidate
for biodiesel production because of their great lipid accumulation like reserve storage
compound mainly in the form of triacylglycerols (TAG), converted into biodiesel
through a reaction of trans-esterification.

The aim of this thesis were the evaluation of the growth curves and biochemical
composition (lipids, carbohydrates and proteins) of the marine diatom Cyclotella
Cryptica grown in batch system by administering the average of the standard medium
f/2 daily or only the day of the inoculation. The growth curve were obtained by
monitoring daily the cellular density (cells/mL) with an optical microscope combined
with a Bürker chamber. The biological macromolecules quantification, lipids,
carbohydrates, and proteins were realized by Folch modified – MTBE, Dubois and
Lowry methods, respectively. Furthermore, the lipids composition were
characterized both by Thin Layer Chromatography (TLC) and Nuclear Magnetic
Resonance (NMR)-Eretic method.
The results shows that the daily supply of the medium f/2 induce high cell density
(2250000±77567 cells/mL) and biomass dry weight (1441.79±148.35 mg/L) that
mainly consist of proteins (88%) and lipid fraction is predominantly composed by
phospholipids (PL). Conversely, administering the medium f/2 only the first day let
the diatoms in a starvation condition defined by a little cell density (192222 ± 26851)
and biomass dry weight (205.90±22.24 mg/L) with a significant increase in the
relative amount of storage compounds: carbohydrates (19%) and lipid (33%)
predominantly in form of triacylglycerols (TAG).
Typically, microalgae are growth at first in laboratories under strict controlled

condition in closed photobioreactors and then transferred to open-pounds for large-
scale production. The main traits to assess the microalgae productivity for biodiesel
production is based on the selection of the strain that accomplish the trade-off
between elevated growth rate and neutral lipids accumulation. Hence, the two
experimental culture conditions evaluated in this work could be useful to establish a
sequential protocol of growth for large volume system. Furthermore, the cells
enriched in protein could be a suitable feedstock in agriculture, aquaculture or for a
breeding farm.

INTRODUZIONE
1. Il fabbisogno energetico globale e le fonti rinnovabili
L’incremento della domanda energetica ed il riscaldamento globale sono tra le

principali sfide che deve affrontare la società odierna [1]. L’energia è il motore
dell’economia moderna e sempre più condizione essenziale per sviluppo e benessere
soprattutto in un mondo oramai globalizzato. I combustibili fossili costituiscono
ancora la fonte principale garantendo oltre l’80% del fabbisogno energetico
complessivo: 34% il petrolio, 26% il carbone e 22% il gas metano [2].
La combustione delle fonti fossili è tra le principali cause antropiche del cambio
climatico. Dalla seconda rivoluzione industriale è stato registrato un forte incremento
nel’emissione dei gas serra, tra cui l’anidride carbonica (CO2), che si stima essere
aumentata all’incirca del 43% negli ultimi 150 anni [3]. Il primo accordo
internazionale stipulato con l’obiettivo di tenere sotto controllo gli stravolgimenti
climatici e mitigare il riscaldamento globale del pianeta è stato il Protocollo di
Kyoto, sottoscritto nel 1997 ed entrato in vigore il 16 febbraio 2005, che penalizzava
le emissioni, in particolare di CO2, ma anche di altri greenhouse gas (GHG) - CH4,
NOx, CFC, incentivandone la mancata generazione. Per far fronte all’ imminente
esaurimento del petrolio il sistema di produzione dei carburanti dovrà basarsi su fonti
rinnovabili ovvero che si rigenerano o non sono esauribili nella scala cronologica
dell’uomo. Inoltre, tali fonti energetiche dovranno rispettare la sostenibilità
ambientale, concetto introdotto nel 1972 durante la conferenza di Stoccolma e

definito nel rapporto Brundtland del 1987, per cui una risorsa si ritiene sostenibile se
soddisfa le esigenze della a popolazione mondiale odierna senza depauperare le
risorse naturali per le generazioni future. Le risorse rinnovabili appartengono alle
fonti inesauribili (p.es. energia solare e geotermica), ad un importante ciclo fisico
(p.es. idrologico ed eolico), oppure ad un sistema biologico (organismi viventi - che
si riproducono). Gli Stati membri della Comunità Europea con il “pacchetto clima-
energia 20-20-20”, contenuto nella Direttiva 2009/29/CE, successivo alla scadenza
del Protocollo di Kyoto (2012), si sono impegnati a ridurre le emissioni di gas serra
del 20%, alzare al 20% la quota di energia prodotta da fonti rinnovabili e portare al
20% il risparmio energetico entro il 2020. Mentre, con la direttiva 2009/28/CE la
UE ha fissato un obiettivo minimo del 10% per l'energia prodotta a partire dai
biocarburanti e dai bioliquidi entro il 2020. Secondo tale direttiva si intende per
biocarburante, un carburante liquido o gassoso per i trasporti ricavato dalla biomassa,
dove la biomassa rappresenta la frazione biodegradabile dei prodotti, rifiuti e residui
di origine biologica provenienti dall’agricoltura, dalla silvicoltura e dalle industrie
connesse, comprese la pesca e l’acquacoltura, nonché la parte biodegradabile dei
rifiuti industriali e urbani.
Un’ ampia varietà di biomassa può essere convertita in biocarburanti sostenibili [1].
Tabella 1.1 I principali biocombustibili
olio prodotto da piante oleaginose mediante pressione, estrazione o processi

analoghi, greggio o raffinato ma chimicamente non modificato, qualora
Bioolio
compatibile con il tipo di motore usato e con i corrispondenti requisiti in
materia di emissioni
alcol ottenuto per fermentazione di prodotti agricoli ricchi di carboidrati
Bioetanolo (amido, cellulosa e glicogeno) quali i cereali (mais, sorgo, frumento, orzo) o
le colture zuccherine (bietola e canna da zucchero)
miscela di esteri metilici di acidi grassi a catena lunga ricavata da oli vegetali
Biodiesel
o grassi animali, destinato ad essere usato come biocarburanti
Biogas gas combustibile usato come biocarburante o gas di legna
Biometanolo metanolo destinato ad essere usato come biocarburante

vettore energetico, cioè deve essere prodotto da altre fonti come l’acqua
(mediante elettrolisi e fotolisi), combustibili tradizionali e non (mediante lo
“steam-reforming”), biomasse (mediante fermentazione, gassificazione,
Bioidrogeno
pirolisi, ecc.). L’idrogeno, viste le sue caratteristiche, può essere considerato
come il biocombustibile del futuro per le grandi prestazioni e i bassi tassi di
inquinamento derivanti dal suo utilizzo
2. Il Biodiesel
La transesterificazione è la reazione su cui si basa la conversione degli oli e dei

grassi, estratti da fonti naturali, in biodiesel; una sostituzione, catalizzata in ambiente
acido o basico, tra un estere ed un alcol che porta ad un estere ed un alcol differenti
(RCOOR +R OH⇄RCOOR +R OH). Nella fattispecie un glicerolipide (lipide
apolare, neutro - NL) è posto a reagire con metanolo (in eccesso per far tendere
l’equilibrio verso i prodotti), catalizzando con acido solforico (H2SO4) [4], per
formare esteri metilici di acidi grassi a lunga catena alchilica (FAME - biodiesel) e
glicerolo (sottoprodotto). Nonostante sia chimicamente possibile produrre biodiesel
anche a partire da lipidi polari (fosfolipidi (PL) e glicolipidi (GL)), i NL e tra questi i
triacilgliceroli (TAG), sono preferiti per il maggior contenuto di acidi grassi
esterificabili.

Figura 1 La transesterificazione avviene in tre stadi reversibili: i TAG sono convertiti
in DG, poi i DG in MG ed infine i MG in FAME (biodiesel)
Inoltre, si può ottenere biodiesel anche mediante derivatizzazione degli acidi grassi
liberi (FFA), eventualmente presenti, con agenti metilanti come il diazometano.
Per produrre biodiesel, dalle prestazioni almeno equivalenti a quelle del diesel, è
necessario valutare attentamente la composizione degli acidi grassi; la lunghezza
della catena alchilica ed il livello di saturazione influenzano il numero di cetano
(fattore che incide sul ritardo di accensione ovvero il tempo che intercorre tra l'inizio
dell'iniezione del combustibile e l'inizio della combustione), il livello di emissioni, lo
scorrimento a freddo, la stabilità ossidativa, la viscosità e lubrificazione [3].
Problemi associati alla sostituzione del diesel con il biodiesel sono: l’alta viscosità, la
bassa volatilità ed il carattere polinsaturo di quest’ultimo [5]. Gli acidi grassi saturi
(SFA) e monoinsaturi (MUFA) liberano più energia quando ossidati rispetto a quelli
polinsaturi (PUFA) con catene carboniose di equivalente lunghezza. Inoltre, i PUFA
nonostante conferiscano migliori prestazioni a basse temperature, si ossidano
rapidamente riducendo i tempi di conservazione; inoltre, inducono un incremento
delle emissioni degli ossidi di azoto (NOx). Un buon compromesso potrebbe essere
un alto contenuto di MUFA ed uno basso di SFA e PUFA [3].

3. Il potenziale delle microalghe
Le microalghe sono organismi eucariotici unicellulari, classificati nel regno dei

Protisti ove albergano ancora molte specie di incerta sede tassonomica (“incerta
sedis”) [12], prevalentemente fotoautotrofe cioè che utilizzano la luce per ottenere
energia e la CO2 come fonte di carbonio per le biosintesi.
La produzione della CO2 durante la combustione dei carburanti è inevitabile, essendo

essa un suo sottoprodotto. Tuttavia, è possibile ridurne sensibilmente il bilancio
netto; ad esempio, sostituendo il diesel derivato dal petrolio con il biodiesel, si stima
che l’emissione di CO2 per litro di combustibile si ridurrebbe da 3,2 a 2,2 kg [6],
poiché la CO2 liberata nell’atmosfera è parzialmente compensata da quella captata
nel processo fotosintetico.
La ricerca scientifica ed industriale nel settore dei biocarburanti è partita dall’

utilizzo di colture cerealicole e zuccherine (prima generazione) e da biomasse residue
lignocellulosiche (seconda generazione). Attualmente, le microalghe stanno
acquisendo un’enorme importanza come materia prima per la produzione di energia
rinnovabile, tra cui i biocarburanti [7] (terza generazione), poiché diversamente dalle
piante, presentano caratteristiche tali che le rendono competitive con i combustibili
fossili. Il tasso di crescita delle piante terrestri è più lento rispetto al tasso di consumo
del biodiesel imposto dal settore dei trasporti. Mentre per le microalghe
fotosintetiche è stato dimostrato che hanno una crescita rapida dovuta ad un’ alta
efficienza di bioconversione dell’ energia solare incidente in biomassa [5], che può
arrivare potenzialmente al 10%, un valore 10 volte superiore a quello delle piante
terrestri [7]. Le piante terrestri coltivate per scopi bioenergetici richiedono notevoli
superfici agricole entrando in competizione con quelle da destinare a colture
agroalimentari (“food for fuel”), mentre le microalghe sono coltivabili tutto l’anno in
zone industriali o in zone aride inadatte alle piante terrestri. Inoltre, a causa del loro
maggiore contenuto in olio le microalghe consentono, a parità di superfici occupate,
produttività fino a 10 volte più elevata rispetto alle piante [8].
La produzione di biofuel dalle microalghe diventerebbe sostenibile se riuscisse a

garantire processi “eco-friendly” [5] e se fosse accoppiata ad altri usi quali la
10

biorimediazione, l’acquacoltura e l’isolamento di composti ad alto valore aggiunto,
utili nei settori industriali farmaceutico, nutraceutico, alimentare, biomedico,
cosmetico e tessile.
Le piante richiedono ingenti quantità d’ acqua per l’irrigazione, sottratta al consumo
umano, e di fertilizzanti azotati e fosforati che percolando nelle falde acquifere posso
rendere eutrofici i bacini idrici circostanti. Invece, le alghe possono essere coltivate
anche in sorgenti di emissione puntuali come i reflui urbani adeguatamente trattati
riducendo al contempo i potenziali danni ecosistemici ed i costi di produzione
relativi alla somministrazione di nutrienti. L’integrazione della fito-rimediazione con
le tecnologie per i biocarburanti – “Zero-waste concept” – sembrerebbe essere una
possibilità sostenibile, ma purtroppo in data odierna i benefici ottenibili dalle acque
di depurazione non sono ancora sufficienti a compensare le elevate spese di prelievo
e canalizzazione [7].
Un ulteriore vantaggio biotecnologico delle microalghe risiede nel residuo della
biomassa comunemente denominato “torta residua”, che può contenere composti ad
elevato valore aggiunto quali: vitamine (A, B, C, D, E, K e B12), coloranti (p.es. il
carotenoide astaxantina, della famiglia delle xantofille), antiossidanti (p.es.
butilidrossianisolo (BHA) e butilidrossitoluene (BHT) riscontrati in Chlorella
vulgaris e Phaeodactylum tricornutum [9]), antimicrobici (p.es. Skeletonema
costatum inibisce la crescita dei batteri Vibrio spp. [10]) e antitumorali (isoprenoidi
polieni altamente ramificati C-25 in S.costatum e Haslea ostrearia agiscono contro
in cancro ai polmoni ed hanno effetti anti HIV [11]).
Una caratteristica peculiare delle alghe è che sono gli unici organismi acquatici
capaci di sintetizzare PUFA ω-3 (p.es. DHA 22:6, EPA 20:5) essenziali per la
crescita di molti organismi eucariotici, incluso l’uomo a cui forniscono benefici
significativi sulla salute come la riduzione del rischio di malattie cardiache,
depressione, artrite remautoide ed asma [5].
4. Le Diatomee
Le diatomee tradizionalmente ascritte alla classe Bacillariophyceae, risalenti a 250

milioni di anni fa [13], dominarono nei tempi geologici con elevate turbolenze
11

oceaniche [11] e caratterizzati da glaciazioni globali (Oligocene [3] e Eocene [11])
probabilmente correlate all’enorme captazione della CO2 atmosferica a cui è
conseguita una rigida diminuzione della temperatura [11]. Finora se conoscono 250
generi e 100000 specie viventi [13], dalle dimensioni tra i 10 e i 200 µm.
Rappresentano il taxon eucariotico del fitoplancton (dal greco phytón = pianta e
planktòs = vagante [13]) più esteso, responsabile oltre il 40% della produzione
primaria degli oceani [14], con un ruolo cruciale nei cicli biogeochimici dei
macronutrienti come l’azoto (N) il fosforo (P) ed il silicio (Si) [15].
Le diatomee colonizzano tutti gli habitat acquatici (acqua dolce, marina, salmastra ed
incluso le acque reflue [7] ed anche quello subaereo e terrestre [16]. Sono state
ritrovate in ambienti con estremi di temperatura (deserti e ghiacciai polari), salinità e
pH. Alcune vivono come epifite di altre alghe o piante [13].
Le diatomee planctoniche sono abbondanti durante l’inizio della primavera e in

autunno lungo le coste, quando l’azione combinata della circolazione termoalina, del
vento e della forza di Coriolì, rimescolando l’acqua degli oceani, fa risalire nutrienti
minerali dai fondali (upwelling) che insieme alle condizioni luminose ottimali per la
fotosintesi tipiche di queste stagioni inducono la crescita esponenziale delle alghe
che colorano l’acqua dei loro pigmenti – fioritura (bloom).
Le diatomee si distinguono in: centriche tutte planctoniche (a simmetria raggiata) e

pennate prevalentemente bentoniche (a simmetria bilaterale). Le Centrales a loro
volta sono suddivise in radiali, bipolari e multi radiali; mentre, le Pennales con
(Bacillariophyceae) o senza rafe (Fragilariophyceae); una fessura ad S dal quale
viene secreta mucillagine polisaccaridica che permette la locomozione per
strisciamento.
Altri rivestimenti viscosi polisaccaridici (eteroglicani complessi) fungono per l’

aggregazione cellulare, lo scambio ionico e la protezione dai predatori. I principali
predatori delle diatomee oceaniche sono i copepodi, dei microcrostacei contro i quali
le alghe hanno sviluppato difese fisiche e chimiche (derivati degli aldeidi che
impediscono la riproduzione, apofucoxantine deterrenti 2-20 ppm [11]). Alcune
diatomee producono neurotossine come l’acido domoico [13].
12

La peculiare parete cellulare delle diatomee, detta frustulo, è costituita da silice opale
amorfa polimerizzata (SiO2 x nH2O) racchiusa in un rivestimento organico proteico
e polisaccaridico (eteroglicani strutturali con proporzioni variabili di galattosio,
glucosio, mannosio, fucosio e xilosio con giunzioni di callosio). Consiste di due metà
porose sovrapposte, un epivalva (dorsale, più ampia) ed un ipovalva (ventrale, più
stretta), che stanno insieme come le due parti di una capsula Petri. Alcune diatomee
prive di frustolo vivono in simbiosi con protozoi marini dell’ordine Foraminifera
[13] e spugne [16].
La riproduzione delle diatomee si realizza principalmente per via asessuale, mediante

scissione binaria, da 1 a 8 volte al giorno. Ciascuna cellula figlia eredita una teca
materna ricostituendo ex-novo quella mancante che tuttavia è sempre la più piccola;
ne consegue che la cellula figlia che eredita l’ipoteca, che diventa la sua epiteca, è
più piccola della cellula madre [16]. Quando le dimensioni sono diminuite fino a
raggiungere il livello critico (30% del diametro originario) scatta, in alcune diatomee,
la riproduzione sessuale [13]. Con la gametogenesi avviene la meiosi (gametica), per
cui i gameti sono le uniche cellule aploidi ed il ciclo è caratterizzato da una sola
generazione diploide (ciclo monogenetico diploide) [16]. Dopo la fecondazione
l’auxospora (zigote) che si è formata si accresce fino a recuperare le dimensioni
originarie tipiche della specie. La riproduzione delle centriche è oogama, i gameti
maschili possono avere un flagello (rappresentano le sole cellule flagellate nelle
diatomee); mentre nelle pennate è isogama con i gameti, morfologicamente identici,
privi di flagelli [13].
Concluso il ciclo cellulare, rapido rispetto a quello di altre microalghe, i protoplasmi

delle diatomee degenerano ed i frustoli precipitano nei fondali oceanici; sedimentati
per milioni di anni, formano spessi depositi di polvere fina detta farina fossile o
diatomite impiegata come abrasivo per pulire l’argento, come isolante [13] o filtrante
nelle piscine e per filtrare birra e vino. Per le sue proprietà igroscopiche, è utilizzata
come insetticida (disidrata la cuticola) ed antielmintico nei mammiferi [11]. E’
impiegata, inoltre, nel settore delle nanotecnologie come stampo [11] per celle
fotovoltaiche analoghe a quelle di biossido di titanio (TiO2).
13

Le diatomee sono alghe eteroconte che derivano da un’ endosimbiosi secondaria tra
eucarioti: un protozoo eterotrofo che ha fagocitato un’ alga rossa che è divenuta il
suo plastidio. Quindi, il cloroplasto risulta essere avvolto da quattro membrane e non
due membrane come quello degli organismi derivanti da endosimbiosi primaria
(piante, alghe verdi e rosse): due membrane esterne del reticolo endoplasmatico (ER
cloroplastico) e due interne residue dell’evento simbiotico primario, separate dal
compartimento periplastidiale (PPC). I tilacoidi sono raggruppati in gruppi di tre
membrane non impilati in grana influendo sul potenziale redox. L’apparato
fotosintetico basato sulle ficobiline si è trasformato in quello basato sulle clorofilla c
[11,16]. Generalmente, le pennate hanno due grandi plastidi, mentre le centriche
hanno numerosi plastidi discoidali [13]. I cloroplasti giallo-dorati[12] contengono
clorofille (a, c1 e c2) e pigmenti accessori carotenoidi in forma di β-carotene e
xantofille (fucoxantina, neofucoxantina, diadinoxantina, diatoxantina) [11]. L’
eccezionale capacità nel dissipare l’ eccesso di energia luminosa (fotoinibizione), che
avviene principalmente nel complesso antenna (LHCII) del fotosistema II (PSII), è
uno dei motivi che ne permette la dominanza ecologia negli oceani [17]. Le diatomee
grazie alla famiglia delle xantofille, canalizzano gli elettroni direttamente verso la
fissazione della CO2, mantenendo alta l’efficienza fotosintetica [11]. Il pirenoide,
appare più scuro del cloroplasto in cui è contenuto ed avvolto solo da due membrane
tilacoidali. Questo corpo proteico contiene l’enzima RuBisCO (ribulosio-1.5-
difosfato carbossi-ossidasi) che catalizza la prima reazione di riduzione della CO2
nella fotosintesi ed è coinvolto nella polimerizzazione degli zuccheri di riserva [16],
di cui il principale è il crisolaminarano, un polimero idrosolubile di glucosio,
conservato in uno specifico vacuolo, che contiene legami β1->3 e β1->6 in rapporto
11:1 [11] che può presentare ramificazioni al C-2 ed al C-3.
Uno dei fattori che favorisce la dominanza ecologia delle diatomee anche in ambienti
oligotrofici è la presenza di un efficiente sistema di assimilazione ed accumulo dei
nutrienti. In risposta a particolari fattori (alternanza stagionale, carenza di nutrienti,
temperatura, intensità luminosa, pH) alcune diatomee possono produrre delle spore
di resistenza quiescenti, con valve inspessite e citoplasma ricco di sostanze di riserva,
che possono germinare al ripresentarsi delle condizioni favorevoli per la crescita
[12].
14

SCOPO DELLA TESI
Tale tesi sperimentale è stata condotta

presso l’ Istituto di Chimica
Biomolecolare (ICB) appartenente al
Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) nei laboratori di “Isolamento e
Caratterizzazione di prodotti naturali” presidiati dal dott. Angelo Fontana. Il team di
chimici e biologi è coinvolto nel progetto di ricerca “Sfruttamento integrato di
biomasse algali in filiera energetica di qualità (SIBAFEQ - Cod. PON01_02740)
nato dall'esigenza di formare ricercatori e tecnici in grado di operare nel campo delle
biotecnologie per la produzione di energia da biomasse non convenzionali.
Il presente studio verte sulla comparazione tra l’andamento della crescita ed il

contenuto di macromolecole biologiche (lipidi, carboidrati e proteine) di microalghe
diatomee (Cyclotella cryptica) coltivate con due sistemi di coltura differenti: un
sistema chiuso convenzionale (batch) in cui vengono somministrati i nutrienti solo il
giorno dell’inoculo ed uno semicontinuo (semicontinuous batch) con un’ immissione
giornaliera di nutrienti.
Ha come obbiettivo la dimostrazione del fatto che un surplus di nutrienti induce un

incremento della densità cellulare, ma non una significativa accumulazione dei lipidi
neutri convertibili in biodiesel, i triacilgliceroli (TAG), che contrariamente avviene
in condizioni limitanti di nutrienti.
MATERIALI E METODI
1. Allestimento delle colture della diatomea marina Cyclotella criptica

Le microalghe utilizzate, Cyclotella criptica (ceppo CCMP 331- Center for Culture
of Marine Phytoplankton), sono state acquistate dal Provasoli-Guillard National
Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) - Norton Center for Blue
Biotechnology (NCBB) on Bigelow Laboratory’s new Ocean Science and Education
Campus (East Boothbay, Maine – USA).
15

Dominio: Eukaryota
Regno: Chromista
Divisione: Ochrophyta
Classe: Bacillariophyceae
Ordine: Thalassiosirales
Famiglia: Stephanodiscaceae
Genere: Cyclotella
Specie: Cyclotella cryptica Reimann, Lewin &
Guillard [18]
Figura 2 (A) Cyclotella cryptica, diatomea
centrica planctonica a vita libera, tende a
formare brevi colonie filamentose. Evidenti i
numerosi cloroplasti rotondi sparsi nel
citoplasma in scissione binaria, (B) discoidale
in vista valvare, (C) rettangolare in vista
commessurale, (D) diametro valvare variabile
da 3,5 μm a circa 70 μm
Cyclotella cryptica rappresenta uno degli organismi modello per la produzione biotecnologica di
biodiesel. E’ stata selezionata in base al tasso di crescita, il contenuto di lipidi, la tolleranza
ambientale e le prestazioni in impianti su larga scala dall’“Acquatic Species Program (ASP)”
promosso dal Dipartimento Statunitense dell’ Energia (DOC) tenutosi dal 1978 al 1996, uno dei più
rilevanti progetti per la valutazione del potenziale delle alghe per la produzione di biocombustibili
[3].
Una coltura stock axenica (priva di batteri), conservata in una camera cellule termostatata a 18±1°C
in flask da 40 mL contenente 25 mL di medium f/2, è stata inoculata in un volume maggiore: un
carboy da 2 L (etichettato CcT, Cyclotella cryptica “Training”), utilizzato per acquisire praticità
nelle analisi per dieci giorni, al termine dei quali la coltura è stata inoculata nei sei carboy degli
esperimenti oggetto di studio di questa tesi.
16

Figura 3 Camera cellule termostatata
I carboy (Thermo Scientific Nalgene © - USA) utilizzati sono taniche compatibili con
vari agenti chimici idrolitici, pressoché uniformi e privi di impurezze derivanti dalla
fabbricazione condotta in assenza di plastificanti e riempitivi; inoltre, hanno una stabile
base quadrata dagli spigoli smussati e dall’impugnatura maneggevole. Sono realizzati in
policarbonato PO, una resina termoplastica traslucida, resistente, dura, spessa,
relativamente infrangibile rispetto al vetro, con una discreta tenuta e riciclabile.
La caratteristica di spicco, però, è la capacità di resistere ad elevate temperature; non
deforma fino alla temperatura di 135° C, ciò che ne permette la sterilizzazione in
autoclave, quindi, l’eliminazione sia delle cellule vegetative che delle spore batteriche
eventualmente presenti. I carboy riempiti con l’acqua di mare, tappi e filtri
d’insufflazione annessi (Midisart R 2000 PTFE IN sartorius steolium, ø pori = 0,22 µm)
sono stati sterilizzati in autoclave (Fedegari Group - serie FGV3) alla temperatura di
121°C ed alla pressione di 1 atm per 20’ (ciclo completo 70’: 20’ riscaldamento, 20’
trattamento, 30’ raffreddamento).
CcT è stato riempito con acqua di mare sintetica preparata con buste di sale alimentare
bianco cristallino (buste da 25 Kg - Lisal s.r.l. - umidità a 105°C 0,1, NaCl 99,5 %, Ca
0,072%, Mg 0,059%, Cd <1 mg/kg, Hg <0,2 mg/kg, NO2- <2 mg/kg, residuo insolubile
in acqua <0,02 %, privo di batteri) ed acqua di rete. Nel carboy (2 L) sono stati
solubilizzati 76 g di sale Lisal in H2O distillata (salinità = 38 g/L=ppm). Il contenuto di
sale in acqua, espresso come cloruro di sodio (NaCl) è stato verificato con un
17

rifrattometro ottico con doppia scala e con compensazione automatica della temperatura
(Giorgio Bormac s.r.l. - Mod. 106 ATC). Purtroppo, tale acqua di mare artificiale si è
rivelata non idonea per diatomee come Thalassiosira weissflogii (cresciute per altri
studi); probabilmente a causa della carenza di elementi in tracce che, seppur in
concentrazioni minime (<0.1 M), sono essenziali per la crescita delle diatomee [4] o
viceversa per la presenza di metalli non essenziali che possono inibire diversi processi
metabolici, anche in piccole quantità (Cd assimilazione del fosforo[15], Hg). Quindi,
per le colture oggetto di questo studio è stato preferito eliminare il problema alla radice
utilizzando l’acqua di mare naturale.
L’ acquamarina naturale è stata prelevata dal Golfo di Napoli dalla Stazione Zoologica
“Anton Dohrn” (SZAD) tramite un sistema di circolazione ideato da un ingegnere
inglese W. Alford Lloyd, nel XIX secolo, e successivamente depurata con trattamenti
primari e secondari (p. es. grigliatura, dissabbiatura, disoleazione, sedimentazione,
ossidazione). L’acqua di mare giunta al ICB-CNR è stata stoccata in due serbatoi
modulari di polietilene lineare atossico ad alta densità cilindrici, orizzontali, blu da 100
L (Cordivari®), a temperatura e pressione ambientali standard (T=298,15 K=25 °C e
p=100 kPa=1 bar). Questi sono stati collegati ad una pompa peristaltica che veicola
l’acqua verso un sistema di filtrazione continuo poiché l’ acquamarina naturale
prelevata durante l’inizio della primavera è condizionata dalla presenza di fioriture
microalgali native che comprometterebbero la monospecificità delle colture. Tale
apparecchiatura, tenuta in posizione da un supporto trepiedi, è costituita da un doppio
filtro di forma circolare (diametro ø 142 mm): prefiltro di profondità in fibra di vetro
per rimuovere le particelle più grandi (ø pori = 0,7 um, Whatman) e da una membrana
filtrante di nitrocellulosa che permette l’eliminazione delle cellule microbiche
vegetative, ma non i virus (ø pori = 0,22 µm, Mecherey-Nagel). Nel fluire attraverso
l’unità filtrante l’acqua si sterilizza, dopo di che si raccoglie in un contenitore sterile
[19]: un carboy da 20 L.
Dal carboy CcT sono state prelevate le cellule in fase esponenziale (581166 cellule/mL)
ed inoculate nei carboy dei due esperimenti, condotti in triplicato al fine di ridurre
errori intrinseci alla sperimentazione (etichettati Cc1a,b,c e Cc2a,b,c). Per avere una
18

concentrazione cellulare di partenza pari a 10.000 cell/mL è stata utilizzata la seguente
formula:
Ci x Vi = Cf x Vf -> Vi= ( Cf x Vf)/ Ci= (104 cell/mL x 2L) / 581166 cell/mL = 34 mL
dove:
Ci = concentrazione cellulare della coltura madre (CcT)
Vi = volume di inoculo da prelevare dalla coltura madre (CcT)
Cf = concentrazione cellulare imposta
Vf = volume del nuovo preparato
N.B. Poiché il volume totale della coltura (2L) comprende anche quello dell’inoculo è
stato prima tolto il suo equivalente d’acqua di mare.
Figura 4 Sistema di coltura: sei carboy (due esperimenti in triplicato)
1.1. Mezzo di coltura: composizione, preparazione e somministrazione
Alle colture è stato aggiunto un medio di arricchimento atto a massimizzare la crescita

delle diatomee: medium f/2 (Guillard e Ryther 1962, Guillard 1975).
Tabella 2 Composizione del medium f/2
Componenti medium f/2 Concentrazione Quantità Molarità Finale

Soluzione Madre /acqua marina L
19

Macronutrienti
NaNO3 75 g/L dH2O 1 mL 8.82 x 10-4 M
NaH2PO4 ·H2O 5 g/L dH2O 1 mL 3.62 x 10-5 M
Na2SiO3 · 9H2O 30 g/L dH2O 1 mL 1.06 x 10-4 M
Micronutrienti 1 mL ------
FeCl3 · 6H2O ------ 3.15 g 1.17 x 10-5 M
Na2EDTA · 2H2O ------ 4.36 g 1.17 x 10-5 M
CuSO4 · 5H2O 9.8 g/L dH2O 1 mL 3.93 x 10-8 M
Na2MoO4 · 2H2O 6.3 g/L dH2O 1 mL 2.60 x 10-8 M
ZnSO4 · 7H2O 22.0 g/L dH2O 1 mL 7.65 x 10-8 M
CoCl2 · 6H2O 10.0 g/L dH2O 1 mL 4.20 x 10-8 M
MnCl2 · 4H2O 180.0 g/L dH2O 1 mL 9.10 x 10-7 M
Vitamine 0.5 mL ------
Tiamina HCl (vit. B1) ------ 200 mg 2.96 x 10-7 M
Biotina (vit. H) 0.1 g/L dH2O 10 mL 2.05 x 10-9 M
Cianobalammina (vit. B12) 1.0 g/L dH2O 1 mL 3.69 x 10-10 M
Elemento
Localizzazioni biochimiche e funzioni principali
nutritivo
Componente di amminoacidi, proteine, nucleotidi, acidi nucleici,
Azoto (N)
clorofilla e coenzimi
Componente di composti che immagazzinano energia chimica
Fosforo (P)
(ATP e ADP), acidi nucleici, coenzimi, fosfolipidi
Silicio (Si) Componente peculiare della parete cellulare
Richiesto per la sintesi della clorofilla, cofattore enzimatico,
Ferro (Fe) componente delle nitrogenasi, dei citocromi e di proteine trasportatrici
di elettroni (Fe-S proteine)
Cloro (Cl) Implicato nell’osmosi e nel bilancio ionico
Rame (Cu) Attivatore o componente di enzimi coinvolti in reazioni redox
Componente di alcuni amminoacidi (p.es. metionina e cisteina),
Zolfo (S) proteine, coenzima A e di proteine trasportatrici di elettroni
(Fe-S proteine)
Molibdeno
Richiesto per la riduzione del nitrato
(Mo)
Zinco (Zn) Attivatore o componente di molti enzimi come l’anidrasi carbonica
Cobalto (Co) Componente della vitamina B12
Manganese Attivatore di enzimi che catalizzano il trasferimento del gruppo
(Mn) fosfato, richiesto per l’integrità dei tilacoidi e nella fotolisi dell’acqua
20

Vitamine Alcune funzioni coenzimatiche
Fosforilata a TPP dalla tiammina pirofosfato, interviene nelle
reazioni di:
Tiamina - decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA,
(B1) catalizzata dalla piruvato deidrogenasi
- transchetolazione da α-chetoglutarato a succinil-CoA, catalizzata
dall’α-chetoglutarato deidrogenasi (ciclo di Krebs)
- carbossilazione del piruvato in ossalacetato, catalizzata dalla
Biotina piruvato carbossilasi (gluconeogenesi)
(H, I, B7 o B8) - carbossilazione del acetil-CoA in malonil-CoA, catalizzata
dall’acetil-CoA carbossilasi (biosintesi acidi grassi)
Ciancobalamina - conversione di omocisteina in metionina, amminoacidi solforati
(B12) essenziali, catalizza dalla metionina sintasi
H2O distillata prelevata da un sistema di depurazione MilliQ

Q-GARD ® 1 +
Elix Millipore Progard ® MPGL04GK2 |
TankMPK01
(p=5,3 bar, Ω <1,5 mho cm) Millipak –
40 da 0,22 µm, NPT)
Pretrattamento, rimozione di
Serbatoio in PE da 100 L Purificazione fine con
particelle grossolane e riduzione
connesso ad un filtro di membrana filtrante
della durezza dell'acqua di rete
sfiato di protezione da sterile, libera da
prima della fase di osmosi
particolato aerodisperso particolato e batteri
inversa
Per la preparazione di ogni soluzione stock di macronutrienti sono stati versati 950 mL
di H2O MilliQ in un cilindro da 1 L, in cui vi è stato solubilizzato il nutriente granulare
(in fase solida) sotto agitazione magnetica (Heatin Magnetic Stirrer – Velp Scientifica).
Una volta sciolto, si porta a volume aggiungendo la quantità opportuna d’ H2O MilliQ
ovvero fino a raggiungere il volume finale di 1 L.
Conoscendo la massa molecolare (Mm) del nutriente, la molarità (M) desiderata
solubilizzando in un volume (V) di soluzione pari ad 1L → M = n
21

La massa (m) del nutriente da aggiungere, pesata con una bilancia analitica sensibile fino
a 4 cifre decimali (Gibertini E42S-B), quindi, è stata calcolata con la seguente formula
inversa:
𝑔
= 𝑥𝑀
Ad esempio:
Mm (NaNO3) = 84,9947 g/mol
1mL di soluzione stock diluito in 1L di acqua di mare, implica che la quantità di
sostanza (n) nello stock è di (8,82 x 10-4) x 103 mol= 0,882 mol
m (NaNO3) = 0,882 (mol) x 84,9947 (g/mol) = 75 g
La soluzione di oligoelementi è stata preparata sciogliendo prima 4,36g di Na2EDTA x

2H2O in 900mL di H2O MilliQ, sotto agitazione magnetica. Una volta che si è
solubilizzato, sono stati aggiunti 3,15g di FeCI3 x 6H2O, dopodiché sono stati inseriti
1mL di ciascuna delle soluzioni madre degli elementi in tracce, che complessano in
stabili chelati. Infine, è stato portato il volume ad un 1 L con H2O MilliQ. La soluzione
giallastra, per la presenza di ferro, ha un pH ≈ 2.
La soluzione di vitamina B1 non è stata predisposta come soluzione madre poiché

solubilizza velocemente, invece, le vitamina H e B12 (fucsia) sono state preparate in
soluzioni stock in falcon da 50 mL, conservabili per 2-3 mesi e facoltativamente
aliquotate in 50 eppendorf da 2mL. Per ogni 20mg di vitamina B1 in 90mL di H20
MilliQ, sotto agitazione magnetica, sono stati aggiunti 1 mL di soluzione madre di
vitamina H e l00 µL di soluzione madre di vitamina B12, quindi, è stato portato il volume
a 100 mL con altra H2O MilliQ. Le tre vitamine sono state trasferite per un pronto
utilizzo in falcon da 15 mL (riempiti fino a 10 mL) filtrandole con una siringa
sierologica a cui è stato anteposto un filtro 0,22 µm.
Per evitare oscillazioni del pH - sia l’assimilazione ionica che il metabolismo cellulare
variano significativamente col pH [5] - è stata aggiunta una soluzione tampone Trizma
Base 5% ( 2-ammino-idrossimetil-1,3,-propandiolo) sciogliendo 25g di sale in 400 mL di
22

H2O MilliQ, sotto agitazione magnetica e regolando il pH fino a 7.8 rigorosamente con
H2SO4 . Quindi è stato portato il volume a 500 mL con altra H2O MilliQ.
Tutti i componenti del medium f/2, tranne le vitamine poiché denaturano

(termosensibili), ed il tampone sono stati autoclavati 24 h prima della somministrazione
ed ogni qual volta si è presunto un possibile evento di contaminazione. Le soluzioni
sono state elargite facendo attenzione a preservare l’asepsi, disinfettandosi le mani con
etanolo 70 % (preparato a partire da soluzione madre al 96%) o ponendosi i guanti;
somministrate con micropipetattore elettronico (Wipoped Xp 0,1-100mL – Witeg,
Germany) dotato di filtro 0,22µm e stripette sierologiche di plastica monouso (Costar),
sotto cappa microbiologica a flusso laminare verticale classe II. Questa cabina è resa
sterile dai raggi UV, accesi 15’ min prima della somministrazione, e mantenuta tale
grazie a filtri HEPA (High-Efficiency Particulate Airfilters) che rimuovono il 99,7%
delle particelle con diametro di 0,3 µm [19]. Il tappo e la filettatura degli stock sono
stati sterilizzati con calore secco, flambati con un analogo del becco bunsen (bombola di
gas butano in pressione diretta) e conservati a basse temperature: le soluzioni nutritive
sono state conservate in frigo a 4°C, mentre le vitamine, in congelatore a -20°C.
1.2.Fattori ambientali: luce, temperatura ed aereazione
Le colture in carboy sono state mantenute a temperatura ambiente (T=20 ± 2°C) ed

esposte a luce artificiale (4 neon) con un flusso fotonico complessivo di 200 µE m-2s-1,
valore intorno al quale, generalmente, l’intensità luminosa diviene saturante per le
microalghe.
Il fotoperiodo di 14h luce (8 am /10 pm) - 10h buio (10 pm/8 am) è stato regolato da un
una centralina della M2M Engineering con timer Theben quartz.
Inoltre, è stato montato un sistema di insufflazione d’ aria (bubbling) costante che

permette il rimescolamento delle alghe evitando che crescano adese alla parete del
carboy direttamente esposta ai neon. L’aereazione impedisce la sedimentazione delle
cellule e permette un efficiente omogeneizzazione della CO2 e del O2 [5].
23

2. Parametri controllati quotidianamente: concentrazione e morfologia
cellulare
La crescita cellulare è stata monitorata quotidianamente determinando il numero di

cellule per conteggio diretto utilizzando una camera di Bürker (Marienfield con morsetti
0,0025 mm2 - 0,04 mm2 / Tiefu Depth profunder 0,1 mm), un metodo che fornisce
valide informazioni sulle dimensioni e sulla morfologia dei microrganismi [19] e
osservando la morfologia con un microscopio ottico a contrasto di fase (Carl Zeiss -
Axio) con un ingrandimento complessivo di 200x (obbiettivo LDA-plan 20x e oculari
P1 10x/23) che mette in risalto le cellule su sfondo che va dal grigio al beige.
Le cellule vive, integre, possono essere osservate in due diverse prospettive: vista
valvare (circolari), quando le valve risultano perpendicolari alla linea di osservazione e
vista commessurale (rettangolari), quando le valve risultano parallele alla linea di
osservazione [12].
E’ possibile calcolare il numero dei microrganismi presenti nel campione tenendo conto
del volume della camera e della diluizione del campione stesso. Il numero medio di
cellule contenute nei quadrati viene usato per calcolare la concentrazione delle cellule
nel campione originale.
Il citometro è costituito da due celle identiche (sopra e sotto) 3 x 3 mm (9 mm2), ognuna

con due solchi per il caricamento. In ciascuna è disegnato un reticolo di 9 quadrati (Q)
della dimensione di 1,0 x 1,0 mm (1 mm2) delimitati da tre linee affiancate (3 linee
verticali e 3 orizzontali dello spessore totale di 0,05 mm), ciascuno suddiviso in altri
quadrati e rettangoli delimitati da due linee parallele: 16 quadrati (C) 0,2 x 0,2 mm
(0,04 mm2), 24 rettangoli interposti (B) 0,2 x 0,05mm (0.01 mm²) e 9 quadrati (A) 0,05
x 0,05mm (0,0025 mm²). La camera è profonda 0,1 mm (spessore tra la camera ed il
vetrino coprioggetto) per cui il volume totale di ciascun quadrato grande è di 1,0 x 1,0
x 0,1 = 0,1 mm³. In teoria, per calcolare la concentrazione cellulare ci si potrebbe
limitare a contare le cellule in uno solo dei 9 quadrati (Q), moltiplicare per 10 (per
portare il volume da 0,1 mm3 a 1 mm3) e poi moltiplicare per il fattore di diluizione,
qualora il campione fosse stato diluito. Essendo però le cellule sparse non
omogeneamente è consigliabile contare le cellule in più quadrati grandi e calcolarne la
24

media, riducendo così il margine d’errore. Per convenzione è stato scelto di contare 6
dei 9 quadrati (Q). Inoltre, per evitare sovra stime le cellule all’interno delle tre righe di
confine sono state contate solo su due lati (in alto ed a sinistra). Mantenere rigidi
pattern di conta cellulare fa si che eventuali errori casuali diventino sistematici, quindi,
non inficino nel calcolo complessivo. Dato che, come menzionato ciascun quadrato
grande della camera (Q), con il coprioggetto in posizione, ha un volume di 0,1 mm3 =
10-4 cm3; essendo 1 cm3 equivalente a 1 mL la concentrazione cellulare (cellule/mL) è
stata determinata moltiplicando il conteggio medio per quadrato x 104 . Quando il
carboy mostrava una evidente torbidità le cellule sono state diluite con acqua di mare,
ulteriormente filtrata con siringa (0,22 µm), ad una diluizione 1:3 (100 µL campione +
200 µL H2O); in tal caso, la concentrazione cellulare è stata moltiplicata per il fattore di
diluizione (3).
Il tasso di crescita è stato valutato durante la fase esponenziale (log), in cui la densità
cellulare incrementa proporzionalmente al numero di cellule inizialmente presenti in
ogni intervallo temporale, calcolando il tempo di duplicazione (Td) con la seguente
formula:
𝑇𝑑 = 𝑔2⁄ 𝑔𝑁𝑁0𝑡 𝛥t
dove:
N0 e Nt = densità cellulare (cell/mL) all’inizio e alla fine dell’intervallo temporale 𝛥t

(due giorni successivi che nella curva di crescita mostravano la migliore linearità).
25

4. Raccolta e preparazione campioni
L’analisi del campione, adeguatamente prelevato, permette la generalizzazione per

inferenza alla totalità della popolazione microalgale; da ogni carboy sono stati
campionati 500 mL di coltura, prelevati con un cilindro di plastica, agitando affinché il
campione risulti omogeneo. Il campione è stato aliquotato in 10 falcon da 50 mL
(Corning Centri Star Tm o BD) e centrifugato a 3750 rpm per 10 minuti a 4 °C (Allegra
X12R – Beckman Coulter). La centrifuga basculante fa si che le cellule precipitino sul
fondo, formando il pellet. Il surnatante, medio di coltura ed essudati cellulari, è stato
allontanato in un becher, capovolgendo rapidamente le falcon per evitare di far cadere
anche l’ammasso di cellule. Il pellet è stato risospeso nel surnatante aggiungendone un
paio di pasterate passate di falcon in falcon e recuperando gli eventuali residui con un
ulteriori pasterate; è stato concentrato in un’unica falcon, precedentemente tarata,
portando il volume a 50 mL versando altro surnatante. Il contenuto della falcon è stato
ripartito in tre parti trasferendo con micropipettatori (Gilson P5000: 1000-5000 uL;
P1000: 200-1000 uL) 5 mL per l’analisi dei carboidrati ed 1 mL per quella delle
proteine in due falcon da 15 mL; i restanti 44 mL nella falcon originaria sono stati
utilizzati per le analisi dei lipidi. Le tre falcon (due da 15 mL ed una da 50 mL) sono
state poste in centrifuga a 3750 rpm per 10 minuti a 4 °C. Allontanato il surnatante,
sono state ricentrifugate a 3750 rpm per 1 minuto a 4 °C, eliminando il residuo d’acqua
superficiale con una Pasteur di vetro (“spinnata”). Il pellet umido riservato per l’analisi
lipidica è stato pesato e successivamente conservato in congelatore a – 20°C, insieme a
quelli per i carboidrati e le proteine.
I carboy usati per le colture microalgali sono stati lavati, sciacquandoli energicamente
con acqua MilliQ ed in evidente presenza di calcare e/o depositi silicei sul fondo, sono
stati aggiunti anche pochi mL di acido fosforico (H2PO4) al 4%.
5. Analisi biochimiche
5.1.Determinazione del contenuto dei lipidi
Il campione umido congelato è stato liofilizzato con freeze-dryer (Thermo Fisher -

Micro Modulyo). La liofilizzazione è una tecnica di crioessicamento che consiste nella
disidratazione per sublimazione (passaggio di stato da solido a gas) di prodotti
26

previamente congelati, condotta a basse temperature (<0°C), che inibendo l’azione
enzimatica salvaguardano i composti termolabili, e sottovuoto. Incrementa la porosità
delle membrane, quindi, la capacità di reidratarsi e la permeabilità del campione per
successive estrazioni con solvente. Infatti, cellule con pareti poco resistenti tendono a
lisare. Inoltre, liofilizzare la biomassa evita di sovrastimare il peso del campione, poiché
circa l’80-90% della biomassa umida è dovuta al contenuto d’acqua e di sali in essa
disciolti.
Figura 5 C. cryptica in vista commensurale. Le frecce indicano gocce lipidiche
Per ottenere i lipidi dalla biomassa sono stati utilizzati due differenti metodi di
estrazione con solvente: il metodo di Folch [10] modificato e quello con l’MTBE [20].
5.1.1 Metodo di Folch modificato
Il protocollo di Folch, come quelli di Bligh e Dyer, sono metodi classici di estrazione
lipidica che utilizzano come solventi di cloroformio:metanolo:acqua, in differenti
proporzioni [1]. Al metodo di Folch [20] progettato per tessuti encefalici e plasma
sanguigno animali, sono state apportate alcune modifiche per adattarlo alle microalghe,
come l’omissione della filtrazione con imbuto separatore Büchner e dell’
omogeneizzazione col Potter-Elvehjem, ma soprattutto utilizzando come solvente il
diclorometano al posto di cloroformio (CHCl3), attualmente sospetto di cancerogenicità
e limitato da una bassa selettività cioè estrae oltre ai lipidi saponificabili anche quelli
non saponificabili e pigmenti liposolubili che possono complicare l’estrazione e
successiva purificazione del bioolio, nonché ridurne la qualità [8].
Il pellet liofilo pesato è stato polverizzato con una spatolina d’acciaio per incrementarne
la superficie di contatto col solvente ed è stato aggiunto, con una pipetta di vetro,
metanolo (1 mL CH3OH /50 mg biomassa liofila). Per agevolare la diffusione del
27

solvente nel pellet è stato posto per 1 minuto in sonicatore a bagnetto (UltraSonik NDI –
104 MHz), inserendo la falcon in becher con ghiaccio e acqua, per evitare
denaturazioni. E’ stato aggiunto diclorometano (2 mL CH2Cl2 /50 mg biomassa liofila)
e sonicato per 1 minuto. I due solventi hanno azione sinergica: quello più polare
(CH3OH) rompendo i legami ad idrogeno e le forze elettrostatiche tra i lipidi e le
proteine di membrana le disgrega rendendole sufficientemente porose, mentre il co-
solvente meno polare (CH2Cl2) maggiormente affine ai lipidi neutri ne guida
l’estrazione. Successivamente, si centrifuga a 3750 rpm per 5 minuti a 4 °C e si
trasferisce, con una pipetta Pasteur, la fase organica sovrastante in una falcon di
raccolta. Al pellet residuo è stata aggiunta una miscela di diclorometano-metanolo 2:1
(v/v) (3 mL CH2Cl2-CH3OH/50 mg biomassa liofila) ed si sonica per 1 minuto. Dopo la
centrifuga a 3750 rpm per 5 minuti a 4 °C è stata trasferita la fase organica unendola
nella falcon di raccolta iniziata a riempire precedentemente. A questa punto si aggiunge
H2O MilliQ (¼ del volume della fase organica), si tappa, si agita, si sfiata e si centrifuga
nuovamente a 3750 rpm per 5 minuti a 4 °C. Si ottiene una miscela a tre fasi: superiore
acquosa, interfase detriti residui, inferiore organica con i lipidi d’interesse. Si rimuove
la fase acquosa con Pasteur di vetro corta lasciandone giusto un’unghia sull’interfase e
si preleva la fase organica infilando una Pasteur lunga oltre l’interfase. Se in questa
operazione viene aspirata un po’ di residuo all'interfaccia, la fase organica nella Pasteur
tenderà a rimanere nella parte bassa, quindi, può essere nuovamente pipettata nella
falcon. L’estratto così ottenuto si trasferisce in pallone (Simax-Repubblica Ceca o
Schott Duran-Germania da 50-100 mL, volume almeno doppio di quello dell’estratto) e
si porta a secco per rimuovere i solventi al rotavapor (Buchi – Svizzera),
precedentemente pulito con metanolo o acetone. Il rotovapor è un distillatore dotato di
un sistema a freddo (spirale in cui viene fatta scorrere acqua di rete) che fa condensare il
solvente evaporato sotto pressione ridotta (vuoto – 7 mbar) che ricade nel pallone di
raccolta, mentre l'estratto resta adeso alle pareti del pallone. Si trasferisce l'estratto in
una vial pesata sciogliendolo nell'appropriato (minimo necessario) volume della miscela
CH2Cl2/CH3OH 2:1. Si porta a secco sotto azoto (bombola 400 bar da 409 L – Sol
s.r.l.). Infine, si pone la vial in una campana collegata ad una pompa ad olio da vuoto
con filtro 0,22 µm. La quantità dell’ estratto lipidico è stata determinata
gravimetricamente ovvero mediante pesatura con bilancia analitica, sensibile fino a 5
28

cifre decimali, dotata di cabina di vetro che ne salvaguarda l’accuratezza (Mettler
Toledo).
5.1.2. Metodo MTBE (Metil-tert-ButilEtere)
Il metodo MTBE è relativamente recente e test rigorosi hanno dimostrato che permette
di recuperare l’estratto lipidico in quantità simili o incluso maggiori dei metodi classici
di Folch, Bligh e Dyer [21]. Al pellet liofilo polverizzato sono stati aggiunti 500 µL
(0,5 mg standard/50 mg biomassa liofila) di standard interno DHBP
(DiHydroxyBenzoPhenone in soluzione metanolica madre 50mg/50mL=1mg/mL). In
seguito si solubilizza con 400 µL di CH3OH e si passa al vortex per 30 secondi.
Dopodiché sono stati aggiunti 3 mL di MTBE ed è stato incubato per 1 ora su un
agitatore rotante (Heidolph Unimax 2010). Il campione è stato ripartito con 0,75 mL di
H2O ed incubato per altri 10 minuti sotto agitazione. Successivamente è stato
centrifugato a 1000 g (2037 rpm) per 10 minuti a 4°C (Hermle z326). Con questo
metodo la fase organica si trova in alto, per la bassa densità relativa del MTBE, mentre
quella acquosa in basso, ciò ne facilita il recupero nei palloni (da 25-50 mL).
Figura 6 Distribuzione delle fasi con i metodi di Folch e MTBE: (W) acquosa, (O)
organica, (NR) residuo insolubile-proteine
Al pellet residuo è stata aggiunta la miscela MTBE/CH3OH/H2O (30:10:2,5 v/v/v) ed

incubato per 10 minuti sotto agitazione. Dopo 10 minuti di centrifugazione a 1000g,
4°C il surnatante è stato recuperato ed aggiunto nel pallone iniziato a riempire
precedentemente e portato a secco al rotovapor. L’ estratto lipidico secco è stato
trasferito in vial, riportato a secco sotto azoto e pesato.
29

5.4.Analisi qualitativa e quantitativa della composizione lipidica
Dell’ estratto lipidico totale ottenuto mediante il metodo MTBE ne è stata analizzata
qualitativamente la composizione mediante cromatografia su strato sottile (TLC). I
campioni sciolti in CH3OH/CH2Cl2 (2:1), sono stati puntati con capillare sulla linea di
base tracciata con una matita morbida (es. 2B) su lastrine in gel di silice su vetro tagliate
con carborundum. Oltre agli estratti sono stati puntate soluzioni standard di colesterolo
(Col), triacilglicerolo (TAG), monogalattosildiacilglicerolo (MGDG),
digalattosildiacilglicerolo (DGDG) e fosfatidilcolina (PC). Le lastrine sono state poste
in camere ambientate con eluenti quali: etere di petrolio/etere etilico (EP:EE 4:1) e
CHCl3/CH3OH (3:1). La rivelazione è stata condotta mediante raggi ultravioletti
(254<UV<366 nm) e nebulizzando soluzioni spray di reattivi cromogeni seccate con
bruciatore a 480°C: solfato di cerio Ce(SO4)2 che evidenzia sia i lipidi neutri che polari,
-naftolo per i glicolipidi e Dittmer per i fosfolipidi.
L’ analisi quantitativa dell’estratto lipidico è stata effettuata mediante spettroscopia di

Risonanza Magnetica Nucleare protonica (1H-NMR) col metodo Eretic [22].
5.2.Determinazione del contenuto dei carboidrati (Metodo di Dubois)
Il contenuto di carboidrati nella biomassa umida è stato precisato con il saggio

colorimetrico fenolo-acido solforico di Dubois [23].
Il saggio viene preceduto da una fase di preparazione del surnatante acquoso in cui si
ritroveranno i carboidrati idrosolubili disciolti. La biomassa umida è stata sospesa in
400 µL di H2O prelevati con micropipettatore P1000, trasferita in vial con Pasteur di
vetro e sottoposta ad idrolisi acida aggiungendo con dispensatore 1.6 mL di acido
solforico (H2SO4 96%), mettendo la vial in ghiaccio perché la reazione è esotermica
(dissipa calore). La reazione è stata lasciata accadere per 20 h a temperatura ambiente,
affinché possano essere scissi i legami glicosidici che tengono uniti tra loro i monomeri
degli zuccheri complessi. Trascorso il tempo necessario, è stata preparata una vial con 4
mL di H2O MilliQ (diluizione 1:3), in cui si è trasferito il campione (N.B. acido
nell’acqua e non viceversa). Della soluzione è stato trasferito 1 mL in eppendorf da 1,5-
30

2mL. Successivamente, il campione è stato messo in una centrifuga a rotore fisso, che
lascia il pellet adeso alle pareti, a 10000 rpm per 5’; a tale velocità le cellule lisano
liberando i carboidrati citoplasmatici. Sul surnatante, trasferito in altre eppendorf, è
stato eseguito il saggio di Dubois.
Per ogni campione sono state saggiate in provetta tre concentrazioni in duplicato: 50,
100 e 200 µL di campione in H20 MilliQ (450, 400 e 300 µL), per un volume totale di
500 µL. Successivamente, sotto cappa chimica d’aspirazione (AtsFaar S.p.a - linea Flex
Mod. 1200) e con i guanti, sono stati inseriti 250 µL di reattivo di Dubois (40 g fenolo +
160 mL di H2O, liquido opalescente bianco stabile al massimo un anno, conservato
avvolto in carta argentata; preparato nuovamente qualora avesse assunto un colore
giallo paglierino) ed 1.25 mL di H2SO4. Gli zuccheri semplici, oligosaccaridi,
polisaccaridi ed i loro derivati reagendo col fenolo e l’acido solforico fanno assumere
una colorazione giallastra alla soluzione. Questa, agitata con vortex, è stata incubata per
30 minuti a temperatura ambiente, prima di procedere all’analisi spettrofotometrica.
Due bianchi sono stati preparati allo stesso modo, ma senza campione, di cui uno viene
lasciato durante la lettura come riferimento.
Le letture di assorbanza sono state eseguite a =490 nm (Spectofotometer Jasco V-650
hardware, Spectra Manager software e cuvette di plastica monouso 100 mm - 2 mL)
poiché tale lunghezza d’onda è assorbita dai gruppi ossidrilici (-OH) tipicamente
presenti negli zuccheri semplici aciclici in soluzione acquosa.
L’analisi qualitativa delle assorbanze è stata resa quantitativa comparando con una retta
di taratura calibrata con soluzioni a concentrazione nota di D-glucosio. Le letture con
un’assorbanza media compresa tra 0.1 e 0.8 sono state considerate valide in quanto
comprese nel range di linearità della retta di taratura. Per letture inferiori al range, è
stata utilizzata una quantità maggiore di campione (fino a 500 µL), mentre per quelle
superiori, il campione è stato diluito, tenendo poi conto del fattore di diluizione
utilizzato nel calcolo della concentrazione finale.
5.3.Determinazione del contenuto delle proteine (Metodo di Lowry)
La determinazione del contenuto proteico è stata effettuata mediante saggio

colorimetrico di Lowry [24] (Bio-Rad DC Protein Assay).
31

Il pellet liofilo, sbriciolato con una spatolina, si sospende in 100 µL di tampone fosfato
50 mM pH 7.0 e 20 µL Triton X-100 25% (detergente – tensioattivo) e si sonica per tre
minuti con sonicatore a bagnetto (Ultra Sonic bath XUGA3 – Grant, Hz 60-70),
inserendo la falcon in becher con ghiaccio e acqua, in modo da lisare le cellule senza
denaturare le proteine. Il campione, lasciato per 15 minuti a temperatura ambiente, vira
da marrone a verde brillante. Durante il tempo d’incubazione sono stati aggiunti in
provetta 50 µL di tampone fosfato 50 mM pH 7.0. In seguito sono stati aggiunti al
campione 380 µL di tampone fosfato 50 mM pH 7.0 che arresta la reazione
precedentemente innescata. Si sonica il campione e si trasferisce in eppendorf da 1,5
mL e si centrifuga a 10000 rpm per 5’ a 4°C. Il surnatante trasferito in altre eppendorf è
stato sottoposto al saggio colorimetrico.
Sono stati aggiunti in provetta tre volumi differenti, in duplicato, di campione (5, 10 e
20 µL) e Triton X-100 1% (45, 40 e 30 µL) per un totale di 50 µL. La soluzione
alcanina di tartrato di rame, reattivo A (0.5 % CuSO4 x 5H2O in 1 % C4H4KNaO6 ·
4H2O) + S (2 % Na2CO3 in 0,10 N NaOH) è stata preparata al momento (20 µL reattivo
S + 980 µL reattivo A), scaldando previamente il reattivo S a 37°C, col bagnetto del
rotovapor, se fosse precipitato. Di questa soluzione ne sono stati aggiunti 100 µL per
ogni campione. Infine, sono stati aggiunti 800 µL di reattivo B (reagente di Folin-
Ciocalteu soluzione acquosa fotosensibile di fosfomolibdato e fosfotungstato). Dopo
aver passato le provette al vortex, sono state lasciate in incubazione per 15 minuti al
buio. Le proteine riducono il reattivo di Folin che perde 1, 2 o 3 atomi di ossigeno,
producendo così specie ridotte differenti. Il peculiare colore blu assunto è dovuto
principalmente alla presenza degli amminoacidi tirosina e triptofano, e secondariamente
a cistina, cisteina ed istidina.
Le letture spettrofotometriche sono state eseguite a =740 nm, usando per
l’azzeramento dell’apparecchio due bianchi preparati senza aggiunta di campione. La
lunghezza d’onda impostata è assorbita dai gruppi amminici (-NH) caratteristici degli
amminoacidi che compongono le proteine.
L’analisi qualitativa delle assorbanze è stata resa quantitativa comparando con una retta
di taratura calibrata con soluzioni a concentrazione nota di albumina di siero bovina
(BSA). Le letture con un’assorbanza media compresa tra 0.02 e 0.2 sono state
considerate valide in quanto comprese nel range di linearità della retta di taratura. Per
32

letture inferiori al range, è stata utilizzata una quantità maggiore di campione (fino a 50
µL), mentre per quelle superiori, il campione è stato diluito, tenendo poi conto del
fattore di diluizione utilizzato nel calcolo della concentrazione finale.
RISULTATI E DISCUSSIONE
4.1 Curve di crescita e biomasse
L’ optimum di crescita non è univoco per tutte le diatomee, ma varia in base alla specie
o incluso il ceppo, a fattori ambientali (intensità e spettro della luce, fotoperiodo,
temperatura, CO2, pH, salinità), la disponibilità di nutrienti ed alle interazioni intra- ed
interspecifiche (depredazione, parassitismo, simbiosi, ecc.). Studi relativi alla
comprensione di come tali fattori, biotici ed abiotici, singolarmente o in interazione,
influiscano sul tasso di crescita, sulle dimensioni cellulari, sulla fisiologia e sulla
composizione biochimica sono essenziali per utilizzare queste microalghe per finalità
biotecnologiche come la commercializzazione dei biocarburanti.
Generalmente, le microalghe hanno un andamento di crescita nel tempo suddiviso in

fasi: latenza, esponenziale, stazionaria e senescenza. Nei grafici (fig. 8, 9, 10) che
rappresentano le curve di crescita di C. cryptica ovvero la concentrazione cellulare
media dei triplicati in funzione del tempo di incubazione, la durata della fase iniziale di
latenza (lag), durante la quale le diatomee necessitano di acclimatarsi al nuovo mezzo di
coltura che differisce per la presenza di acqua di mare naturale piuttosto che artificiale,
non è valutabile esattamente poiché nei primi tre giorni di crescita, corrispondenti al
fine settimana, non è stata monitorata la densità cellulare. Ciò che è certo è che
entrambe le colture entrano in fase esponenziale almeno dal terzo giorno di incubazione.
Tabella 3 Dati del conteggio cellulare ed analisi statistica del triplicato (indice di
tendenza centrale e di dispersione - media aritmetica e deviazione standard) di
C.cryptica ottenuti con somministrazione quotidiana del medium f/2
Tempo Concentrazione cellulare (cell/mL)

(giorni) Cc1a Cc1b Cc1c Media aritmetica Deviazione Standard
0 10000 10000 10000 10000 0
3 71667 93333 306667 157222 106043
4 545000 253333 316667 371667 125263
33

5 693333 686667 826667 735556 64483
6 881667 1191667 903333 992222 141306
7 988333 1220000 1528333 1245556 221193
10 1858333 1778333 1871667 1836111 41216
11 2610000 1890000 2075000 2191667 305296
12 1726667 2020000 2505000 2083889 320949
13 2600000 1825000 2730000 2385000 399521
14 2330000 2145000 2275000 2250000 77567
3 010 000
2 510 000
Densità cellulare (cell/mL)
2 010 000
1 510 000
1 010 000
510 000
10 000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tempo (Giorni)
Figura 8 Curva di crescita di C.cryptica ottenuta somministrando il medium f/2

quotidianamente
C.cryptica coltivata somministrando il medium f/2 quotidianamente è stata raccolta

tramite centrifugazione, in fase stazionaria quattordici giorni dopo l’inoculo quando
raggiungeva una concentrazione cellulare di 2250000±77567 cellule/mL ed una
biomassa liofila di 1441.79±148.35 mg/L (tab.5). Dalla curva di crescita (fig. 8) si nota
che la popolazione cellulare si mantiene in crescita esponenziale, caratterizzata da una
velocità di crescita massima e costante in cui le cellule si dividono e raddoppiano a
intervalli di tempo regolari, dal terzo al decimo giorno quando raggiunge la fase
stazionaria. Ciò si verifica probabilmente a causa dell’instaurarsi di fenomeni di
competizione intraspecifica per lo spazio, per la ridotta penetrazione della luce, per il
raggiungimento di concentrazioni tossiche di qualche micronutriente, per valori di pH
che inibiscono l’assimilazione dei nutrienti somministrati o per l’ aumento progressivo
del O2 che incrementando la fotorespirazione, necessaria per rigenerare il fosfoglicolato,
riduce il tasso fotosintetico.
34

Tabella 4 Dati del conteggio cellulare ed analisi statistica del triplicato (indice di tendenza
centrale e di dispersione - media aritmetica e deviazione standard) di C.cryptica ottenuti
con somministrazione del medium f/2 solo il giorno dell’inoculo
Tempo Concentrazione cellulare (cell/mL)

(giorni) Cc2a Cc2b Cc2c Media aritmetica Deviazione Standard
0 10000 10000 10000 10000 0
3 78333 173333 20000 90556 63192
4 166667 283333 205000 218333 48553
5 196667 193333 150000 180000 21257
6 176667 178333 201667 185556 11413
7 185000 161667 171667 172778 9558
10 176667 170000 230000 192222 26851
260 000
210 000
160 000
110 000
60 000
10 000
0 2 4 6 8 10 12
Tempo (Giorni)
Figura 9 Curva di crescita di C.cryptica ottenuta somministrando il medium f/2 solo il

giorno dell’inoculo
C.cryptica coltivata somministrando il medium f/2 solo il giorno dell’inoculo è stata

raccolta, tramite centrifugazione, in fase stazionaria dieci giorni dopo l’inoculo quando
raggiungeva una concentrazione cellulare di 192222 ± 26851 cellule/mL ed una
biomassa liofila di 205.90±22.24 mg/L (tab.5). La curva di crescita (fig.9) mostra una
che dal quarto giorno la popolazione cellulare entra in fase stazionaria ove le cellule
vive pur rimanendo metabolicamente attive cessano di dividersi poiché i nutrienti
disponibili iniziano a scarseggiare.
35

3 000 000
2 500 000
2 000 000
1 500 000
1 000 000
500 000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Giorni
Figura 7 Curve di crescita di C.cryptica a confronto. In rosso con somministrazione del

medium f/2 solo il primo giorno, in blu quotidianamente
Il grafico (fig.10) enfatizza la differenza nel tasso di crescita di C.cryptica nelle due
colture a partire dal quarto giorno.
Tabella 5 Tempo di crescita e di duplicazione. Concentrazione cellulare e biomassa liofila

di C.cryptica, relative al giorno della raccolta, con somministrazione f/2 quotidianamente e
solo il primo giorno. Rendimento giornaliero
Tempo Tempo Concentrazione

Resa biomassa
di di cellulare Biomassa
liofila
crescita duplicazione raccolta liofila (mg/L)
(mg/L/giorno)
(giorni) (h) (cell/mL)
Somministrazione
14 24 2250000±77567 1441.79±148.35 102.98±10.60
f/2 quotidiana
Somministrazione
f/2 solo il primo 10 43 192222±26851 205.90±22.24 20.59±2.24
giorno
36

Figura 8 Principali vie metaboliche che conducono alla biosintesi di macromolecole
biologiche (carboidrati, lipidi e proteine) nelle diatomee
Le diatomee sono costituite approssimativamente da: 30-60% proteine, 10-50% lipidi e

5-20% carboidrati (in peso secco).
La maggioranza delle diatomee fonda il proprio metabolismo sulla fotosintesi

ossigenica ovvero assorbono l’energia luminosa incidente sui pigmenti dei fotosistemi
che eccitandosi inducono un flusso elettronico, accoppiato alla traslocazione dei protoni
liberati dalla fotolisi dell’acqua che guida la sintesi di ATP da ADP e Pi
(fotofosforilazione), che culmina con la riduzione del NADP+ a NADPH; ATP e
NADPH sono poi utilizzati nel Ciclo di Calvin (metabolismo C3) in cui il HCO 3-
convertito in CO2 in una reazione catalizzata dall’ anidrasi carbonica (CAs) [15], si lega
covalentemente al ribulosio 1,5-fosfato (RuBP) a formare un intermedio instabile, il 3-
fosfoglicerato (PGA) e successivamente la gliceraldeide-3-fosfato (PGAL). Sono stati
riscontrati anche enzimi analoghi alla PEP carbossilasi, selettivi per la CO2 cioè non
legano anche l’O2 come la RuBisCO evitando decrementi del tasso fotosintetico per
fotorespirazione (metabolismo C4) [11]. Una delle sei PGAL non utilizzata per
rigenerare la RuBisCO uscirebbe dal cloroplasto per seguire la via glicolitica
convenzionale nel citosol (Embden-Meyerhof-Parnas), o si suppone possa intraprendere
la glicolisi direttamente nel cloroplasto avvalendosi di enzimi procariotici della prima
endosimbiosi. La PGAL mette in relazione la fotosintesi con le due vie antitetiche,
glicolisi e gluconeogenesi, che hanno come estremi metabolici glucosio e piruvato.
Quest’ultimo è prodotto in entrambe le vie per isomerizzazione del
diidrossiacetonfosfato (DHAP), nella via glicolitica per scissione del fruttosio 1,6-
37

bisfosfato, mentre nella via glicogenetica dall’ 1,3-bifosfoglicerato (1,3-BPA). Inoltre,
si ipotizza che la PGAL potrebbe essere deviata verso varianti della via ossidativa dei
pentoso fosfati (OPPP), come la via della fosfochetolase (PKP) o quella di Entner-
Doudoroff [17]. Gli zuccheri monomerici prodotti fotosinteticamente ed il glucosio
sintetizzato ex-novo durante la gluconeogenesi polimerizzano in carboidrati. Il piruvato
prodotto per glicolisi può essere indirizzato verso la formazione di amminoacidi o più
comunemente subisce una decarbossilazione ossidativa formando l’acetil-CoA. La via
che intraprende l’acetil-CoA è strettamente legata alle condizioni ambientali e
nutrizionali.
4.2.1 Determinazione del contenuto dei lipidi, dei carboidrati e delle proteine
Tabella 6 Determinazione del contenuto lipidico: confronto tra Folch modificato e MTBE
Metodo di Folch modificato Metodo MTBE
% %
mg/L mg/L/day biomassa mg/L mg/L/day biomassa
liofila liofila
13.58 0.97 0.94 18.03 1.29 1.23
Somministrazione
± ± ± ± ± ±
f/2 quotidiana
1.37 0.10 0.04 7.23 0.52 0.41
Somministrazione 18.23 1.81 8.93 25.90 2.59 12.66
f/2 solo il primo ± ± ± ± ± ±
giorno 0.81 0.08 1.07 2.88 0.29 1.78
La Tab.6 mostra che somministrando il medium f/2 solo il primo giorno induce le
cellule in una condizione di deprivazione nutrizionale che le porta ad accumulare un
quantitativo di lipidi maggiore rispetto a quello di una elargizione quotidiana. Inoltre, si
evince la maggiore efficacia estrattiva del metodo MTBE rispetto al Folch modificato.
Tabella 7 Determinazione del contenuto dei carboidrati e delle proteine
Carboidrati Proteine
% %
mg/L mg/L/day biomassa mg/L mg/L/day biomassa
liofila liofila
18.25 1.30 1.29 253.42 18.14 17.57
Somministrazione
± ± ± ± ± ±
f/2 quotidiana
3.69 0.26 0.41 151.54 10.82 9.82
Somministrazione 13.46 1.35 6.43 32.93 3.29 15.90
f/2 solo il primo ± ± ± ± ± ±
38

giorno 5.65 0.56 2.09 10.60 1.06 4.67
7%
5%
Lipidi
88% Proteine
Carboidrati
Figura 9 Percentuali relative di lipidi, proteine e carboidrati in C.cryptica coltivata

somministrando il medium f/2 quotidianamente e raccolta in fase esponenziale (Cc1)
19%
33% Lipidi
48% Proteine
Carboidrati
Figura 10 Percentuali relative di lipidi, proteine e carboidrati in C.cryptica coltivata

somministrando il medium f/2 solo il primo giorno e raccolta in fase stazionaria (Cc2)
I grafici a torta delle percentuali relative di lipidi, proteine e carboidrati in C.cryptica

coltivata somministrando il medium f/2 solo il primo giorno (fig.11) e somministrando il
medium f/2 quotidianamente (fig.12), ottenuti dai dati delle Tab. 6 e 7 (N.B. % lipidi
media tra i due metodi estrattivi utilizzati) mostrano chiaramente come la disponibilità
di nutrienti rappresenti una condizione di crescita ottimale per cui la maggior parte del
39

carbonio fissato fotosinteticamente si trova nelle proteine, mentre la limitazione di
nutrienti, che negli ecosistemi naturali coincide con la fine del bloom [4], induce una
situazione di stress che lo veicola verso i lipidi e/o carboidrati [17].
La spiegazione fisiologica del perché un quantitativo in eccesso o in difetto dei nutrienti

faccia variare così drasticamente la composizione delle macromolecole biologiche
potrebbe essere attribuita alla via metabolica intrapresa dall’ Acetil-CoA. Questo, in
condizioni di crescita ottimali, entra nel ciclo di Krebs da cui si generano intermedi
metabolici atti alla biosintesi degli amminoacidi, da cui le proteine; ad esempio l’ α-
chetoglutarato è usato per l’assimilazione dell’ammonio attraverso il ciclo dell’
glutammina sintasi/glutammina ossoglutarato amminotransferasi (GS/GOGAT)
cedendo i due amminoacidi, glutammina e glutammato. Al contrario, in condizioni di
stress, l’acetil-CoA è prevalentemente indirizzato verso la biosintesi degli acidi grassi
(FA), subisce una carbossilazione, catalizzata dall’ acetil-CoA carbossilasi (ACCase), a
formare malonil-CoA. I pathway della biosintesi lipidica nelle diatomee però non sono
del tutto chiari, basti pensare che la sovraespressione dell’ acetil-CoA carbossilasi in
Cyclotella cryptica non induce incrementi significativi nel pool lipidico come dovrebbe
[5].
4.2.2 Analisi qualitativa e quantitativa della composizione lipidica
Il pool dei lipidi complessi microalgali, classificati per polarità, è composto da: [25]
 Neutri (NL):
 monoacilgliceroli (MAG), diacilgliceroli (DAG), triacilgliceroli (TAG)
costituiti da uno scheletro di glicerolo, metabolicamente derivato dal
glicerol-3-fosfato, in cui i gruppi acilici possono essere esterificati in
posizione sn-1, sn-2 o sn-3 da acidi grassi, saturi o insaturi,
rispettivamente. I TAG, sintetizzati alla luce, sono i lipidi neutri
maggiormente accumulati nelle vescicole citoplasmatiche delle alghe
come prodotto di riserva e riutilizzati per la sintesi dei lipidi polari al
buio.
40

 Polari (anfipatici: testa polare + coda apolare): conferiscono l’integrità
strutturale e la selettività nella permeabilità delle membrane cellulari
 fosfolipidi (PL): gruppo fosfato polare in posizione sn-3, che nelle alghe
è prevalentemente legato al glicerolo (PG), alla colina (PC),
all’etanolammina (PE), alla serina (PS), al mio-inositolo (PI)
o fosfatidilgliceroli (PG): tipici delle membrane tilacoidali del
cloroplasto. Nelle alghe rappresentano dal 10-20% dei lipidi totali
 glicolipidi (glicosilgliceridi - GL): la loro struttura di base è data dal 1,2-
diacil-sn-glicerolo a cui si legano in posizione sn-3 mono- o
oligosaccaridi, nelle alghe principalmente galattosio
o monogalattosildiacilgliceroli (MGDG): peculiari dei tilacoidi
o digalattosildiacilgliceroli (DGDG): possono ritrovarsi anche al di
fuori dei plastidi
o sulfolipidi (SQDG): anch’essi presenti nei tilacoidi, sono carichi
negativamente per la presenza del gruppo solfonato legato al C-6
del galattosio
Inoltre, possono riscontrarsi: steroli, idrocarburi, cere, derivati prenilici come il

tocoferolo, i carotenoidi, i terpeni, i quinoni e derivati pirrolici come le clorofille [19].
Nelle diatomee sono presenti acidi grassi saturi (SFA), monoinsaturi (MUFA) e
polinsaturi (PUFA); i maggiormente riscontrati sono: l’acido palmitico (16:0), l’acido
palmitoleico (16:1), l’acido eicosapentaenoico (EPA C20:5, ω-3), l’ acido
docosaesaenoico (DHA C22:6, ω-3).
41

Figura 11 TLC dell’estratto lipidico totale in etere di petrolio/etere etilico (4:1) rivelato
con Ce(SO4)2. Da sinistra a destra: triplicato con somministrazione f/2 solo il primo giorno
(Cc2), triplicato con somministrazione f/2 quotidiana (Cc1), colesterolo (Col) e
triacilglicerolo (TAG)
L’analisi qualitativa dell’estratto lipidico totale mediante TLC in etere di petrolio/etere

etilico (4:1), carbonizzando con Ce(SO4)2 (fig.13) ha rivelato la presenza di steroli in
tutti i campioni come prevedibile, essendo essi costituenti essenziali interposti tra le
membrane cellulari e di TAG negli estratti che provengono dalle colture in cui è stato
somministrato il medium f/2 solo il primo giorno. Invece, negli estratti lipidici ottenuti
dalle colture cresciute con aggiunta quotidiana del medium f/2, appaiono delle tenui
macchie circolari probabilmente ascrivibili a MAG o DAG derivanti da TAG idrolizzati
dalle lipasi; l’assenza però della caratteristica forma ad unghia degli acidi grassi liberi
(FFA) fa supporre una loro successiva organicazione in altri lipidi complessi.
42

Figura 12 TLC dell’ estratto lipidico in CH3Cl/CH3OH (3:1) rivelato con Ce(SO4)2. Da
sinistra a destra: monogalattosildiacilglicerolo (MGDG), digalattosildiacilglicerolo
(DGDG), triplicato con somministrazione f/2 solo il primo giorno (Cc2), triplicato con
somministrazione f/2 quotidiana (Cc1) e colesterolo (Col)
Figura 13 TLC dell’ estratto lipidico in CH3Cl/CH3OH (3:1) rivelato con -naftolo. Da
sinistra a destra: monogalattosildiacilglicerolo (MGDG), triplicato con somministrazione
f/2 solo il primo giorno (Cc2), triplicato con somministrazione f/2 quotidiana (Cc1) e
digalattosildiacilglicerolo (DGDG)
43

Figura 14 TLC dell’ estratto lipidico in CH3Cl/CH3OH (3:1) rivelato con Dittmer. Da
sinistra a destra: fosfatidilcolina (PC), triplicato con somministrazione f/2 solo il primo
giorno (Cc2) e triplicato con somministrazione f/2 quotidiana (Cc1)
Tutte le TLC dell’ estratto lipidico in CH2Cl2/CH3OH (3:1) (fig.14,15,16) mostrano la

presenza di pigmenti polari al fronte, dal basso verso l’altro, giallo-arancione-verde. Ciò
sembra essere congruo con il fattore di ritardo dei pigmenti che conferiscono tali
colorazioni: carotenoidi della famiglia delle xantofille e clorofille. Inoltre, appare uno
spot giallo UV visibile che rappresenta lo standard DHBP.
Nelle lastrine rivelate con Ce(SO4)2 (fig.14) appaiono sia gli steroli, al fronte un po’ più
in basso dei pigmenti, sia MGDG e DGDG. Questi ultimi oltre la macchia che li
identifica specificamente, sia nello standard che nei campioni, hanno impresso tracce
lievi sia leggermente più in alto di quella caratteristica che quasi al fronte. Ciò potrebbe
essere ascrivibile alla loro spiccata tendenza alla degradazione o meglio al loro ruolo
centrale nel rimodellamento dei lipidi polari (remodeling acyl-editing).
Nelle TLC nebulizzate con -naftolo (fig.15) hanno rivelato selettivamente i
galattolipidi. La presenza di due molecole di galattosio nei DGDG conferisce una
maggiore simmetria alla geometria molecolare rispetto ai MGDG, da cui una polarità
maggiore che ne induce una migrazione relativamente minore. Inoltre, sono comparse
anche alcune macchie nella parte centrale-bassa, probabilmente ascrivibili ai più polari
SQDG.
44

Infine, le lastrine cromatografiche rivelate con Dittmer (fig. 16) hanno messo in
evidenza la presenza di fosfolipidi, soprattutto nei campioni del triplicato con
somministrazione del medium f/2 quotidiana (Cc1), che restano quasi sulla linea di base,
per la maggiore affinità alla fase stazionaria polare rispetto alla miscela di eluizione
relativamente più apolare, similmente alla classe utilizzata come standard PC.
Tabella-Istogramma 8 Composizione dell’estratto lipidico totale in C.cryptica coltivata con

somministrazione quotidiana del medium f/2 (Cc1) ottenuta con metodo Eretic H1-NMR
Classi lipidiche % (Folch modificato) % (MTBE)

DGDG 2.45±0.10 2.88±1.05
SQDG 10.46±0.58 15.24±1.24
MGDG 12.22±9.07 16.46±1.67
PL 64.33±8.68 37.49±3.20
TAG 3.11±0.04 0.00±0.00
FFA 7.44±0.83 27.93±5.04
100
90
80
70
60
% 50
40
30
20
10
0
DGDG SQDG MGDG PL TAG FFA
Folch modificato MTBE
Tabella-Istogramma 9 Composizione dell’estratto lipidico totale in C.cryptica coltivata con

somministrazione del medium f/2 solo il primo giorno (Cc2) ottenuta con metodo Eretic
H1-NMR
Classi lipidiche % (Folch modificato) % (MTBE)

DGDG 1.14±0.37 0.64±0.47
SQDG 4.91±1.95 3.30±0.05
MGDG 6.89±0.76 1.14±1.14
PL 9.88±2.10 5.65±5.65
TAG 63.62±8.42 81.74±1.03
FFA 13.56±7.44 7.53±7.39
45

100
90
80
70
60
% 50
40
30
20
10
0
DGDG SQDG MGDG PL TAG FFA
Folch modificato MTBE
Dai dati dell’ analisi quantitativa della composizione lipidica condotta mediante NMR
metodo Eretic (tab.8) si evince che la somministrazione quotidiana del medium f/2 in
C.cryptica induce un incremento significativo dei PL legato trivialmente alla sintesi ex-
novo delle membrane plasmatiche e degli organelli cellulari, un meno scontato aumento
dei galattolipidi probabilmente dovuto al rimodellamento dei tilacoidi ed un accumulo
dei TAG pressoché nullo. Contrariamente la tab.9 mostra che nella coltura a cui è stato
somministrato il medium f/2 solo il primo giorno PL e GL sono relativamente meno
presenti in quantità relativamente minori, poiché queste diatomee rispondono alla
carenza nutrizionale accumulando riserve energetiche in forma di TAG.
CONCLUSIONI
La struttura di un processo industriale su larga scala origina dalla sperimentazione in

laboratorio[1], nonostante talvolta gli esperimenti di laboratorio mascherino
problematiche che emergono solo nei sistemi ad ampia scala [7]. Le crescite microalgali
intensive in sistemi chiusi sono caratterizzate da un alto grado di controllo, qualità dei
prodotti, risparmio d’acqua, energia e nutrienti [5] rispetto alle vasche all’aperto (open
pounds) le quali permettono di ridurre direttamente le emissioni di CO2, ma dipendono
dall’irradianza locale, sono soggette ad invasione di specie e perdita di acqua per
evaporazione[3]. I dati ottenuti con questo studio condotto in mini fotobioreattori chiusi
(carboy) potrebbero essere utilizzati per allestire inoculi in fotobioreattori con volumi
maggiori ed in seguito per le colture all’aperto su larga scala. Le due condizioni di
46

crescita impostate hanno evidenziato come uno stesso ceppo di diatomee (Cyclotella
cryptica CCMP331) possa rispondere ad un differente quantitativo di nutrienti
modificando il proprio tasso di crescita e la propria composizione cellulare. La
somministrazione quotidiana del mezzo di arricchimento f/2 ha indotto le cellule a
proliferare rapidamente ed a sintetizzare prevalentemente proteine fornendo, quindi, una
biomassa potenzialmente sfruttabile in agricoltura come concime azotato o in
acquacoltura ed allevamento per nutrire la fauna ittica ed il bestiame, rispettivamente.
Contrariamente, la somministrazione del mezzo f/2 solo il giorno dell’inoculo ne
comporta l’esaurimento progressivo a cui le diatomee rispondono cessando di dividersi
ed immagazzinando sostanze di riserva, maggiormente lipidi neutri in forma di TAG.
Le due condizioni sperimentali potrebbero essere componenti successive di un
protocollo di crescita sequenziale in due stadi in cui si lascia accrescere la biomassa in
condizioni di replezione somministrando quotidianamente in medium f/2 ed in seguito si
induce l’accumulazione dei lipidi neutri mantenendole in crescita senza aggiungere il
medium f/2 raccogliendo preferenzialmente il primo giorno di senescenza.
Attualmente, il costo di un barile di biofuel microalgale si stima sia ancora tre volte
superiore a quello del petrolio (100 $) [3]. Affinché il biodiesel prodotto a partire dalle
alghe diventi concorrenziale oltre alle condizioni di crescita sarà necessario ottimizzare
la raccolta, la deidratazione e la raffinazione, tra le fasi più care di tutto il processo [11].
BIBLIOGRAFIA
1. Michael Cooney , Greg Young & Nick Nagle (2009) Extraction of Bio‐oils from
Microalgae, Separation & Purification Reviews, 38:4, 291-325,
DOI:10.1080/15422110903327919
2. Monika Psenner, Articolo 1: Fabbisogno energetico mondiale: situazione attuale
e prospettive future – Fiera Bolzano-Issuu, 20 gennaio 2014
3. Orly Levitan, Jorge Dinamarca, Gal Hochman, and Paul G. Falkowski (Marzo
2014) Diatoms: a fossil fuel of the future, Trends in Biotechnology, Vol.32,
No.3
4. Sophie C Leterme (2015) The Oil Production Capacity of Diatoms,
SciMedCentral - Annals of aquaculture and research
47

5. José de Jesús Paniagua-Michel, Jorge Olmos-Soto, Eduardo Morales-Guerrero
(2015) 62. Microalgal Biotechnology: Biofuels and Bioproducts - Industrial
Applications Part J1355
6. Magín Lapuerta,, Octavio Armas, José Rodríguez-Fernández (April 2008) Effect
of biodiesel fuels on diesel engine emissions, Progress in Energy and
Combustion Science Volume 34, Issue 2, Pages 198–223
7. Guanyi Chen, Liu Zhao, Yun Qi (2015) Enhancing the productivity of
microalgae cultivated in wastewater toward biofuel production: A critical
review, Applied Energy 137, 282–291
8. Jessica Jones, Schonna Manning, Morela Montoya, Karin Keller, Martin Poenie
(2012) Extraction of Algal Lipids and Their Analysis by HPLC and Mass
Spectrometry, J Am Oil Chem Soc 89:1371–1381
9. Ignacio Rodriguez-Garcia, Jose Luis Guil-Guerrero (1 Giugno 2008) Evaluation
of the antioxidant activity of three microalgal species for use as dietary
supplements and in the preservation of foods, Food Chemistry Volume 108,
Issue 3, 1023–1026
10. Naviner M, Bergé JP, Durand P, Le Bris H. (1999) Antibacterial activity of the
marine diatom Skeletonema costatum against aquacultural pathogens.
Aquaculture, 174:15-24
11. Mark Hildebrand*, Aubrey K Davis, Sarah R Smith, Jesse C Traller & Rafaela
Abbriano (2012) - The place of diatoms in the biofuels industry, Future Science
Group - Biofuels 3(2), 221–240, ISSN 1759-7269
12. Massimo Avancini, Anna Maria Cicero, Irene Di Girolamo, Mario Innamorati,
Erika Magaletti, Tecla Sertorio Zunini (2006) Guida al riconoscimento del
plancton dei mari italiani - Volume I Fitoplancton - Programma di monitoraggio
per il controllo dell’ambiente marino costiero Ministero dell’Ambiente della
Tutela del Territorio e del Mare – DPN ICRAM - Istituto Centrale per la Ricerca
Scientifica e Tecnologica Applicata al Mare
13. P.H. Raven, R.F. Evert, S.E. Eichhorn (2002) Biologia delle Piante,Zanichelli
ed.
48

14. Toshihiro Obata, Alisdair R. Fernie, Adriano Nunes-Nesi (2013) The Central
Carbon and Energy Metabolism of Marine Diatoms, Metabolites 3, 325-346;
doi:10.3390/metabo3020325
15. Ankita Juneja, Ruben Michael Ceballos and Ganti S. Murthy (2013) Effects of
Environmental Factors and Nutrient Availability on the Biochemical
Composition of Algae for Biofuels Production: A Review, Energies 6, 4607-
4638; doi:10.3390/en6094607
16. J.D. Mauseth (2003) – Botany – An Introduction to Plant Biology, Idelson
Gnocchi ed.
17. http://arks.princeton.edu/ark:/88435/dsp01s4655g66r
18. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=
29204&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=f
19. M. Willey, M.Sherwood, J.Woolvertoon (Luglio 2012) Prescott,Harley,Klein –
Microbiologia generale, McGraw-Hill Companies, ISBN 978-88-386-6590-5
20. J.Folch, M.Lees, G.H. Sloane Stanley (1957) A simple method for the isolation
and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 226:497-509
21. Vitali Matyash, Gerhard Liebisch, Teymuras V. Kurzchalia, Andrej Shevchenko
and Dominik Schwudke (2008) Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for
high-throughput lipidomics, Journal of Lipid Research Volume 49
22. Genoveffa Nuzzo, Carmela Gallo, Giuliana d’Ippolito, Adele Cutignano, Angela
Sardo and Angelo Fontana (2013) Composition and Quantitation of Microalgal
1
Lipids by ERETIC H NMR Method, Mar. Drugs 11, 3742-3753;
doi:10.3390/md11103742
23. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. (1956)
Colorimetric method for determination of sugars and related substances.
Analytical Chemistry 28:350-356
24. O.H. Lowry, R.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall (1951) Protein
measurement with Folin phenol reagent
25. P. Kumari , M. Kumar , C. R. K. Reddy and B. Jha (2013) Algal lipids, fatty
acids and sterols, Woodhead Publishing
49

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SCUOLA POLITECNICA E DELLE SCIENZE DI BASE

Analisi biochimiche della diatomea marina Cyclotella cryptica coltivata in differenti

Biochemical analyses of marine diatom Cyclotella Cryptica grown under different

Cutignano Adele Laureando

Relatore Silvestro Antonio

Esposito Sergio Matr. N88/3042

Anno accademico 2014/2015

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Recently the investigation of the marine microalgae's potential in biotechnological

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1. Il fabbisogno energetico globale e le fonti rinnovabili

L’incremento della domanda energetica ed il riscaldamento globale sono tra le

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La riproduzione delle diatomee si realizza principalmente per via asessuale, mediante

Concluso il ciclo cellulare, rapido rispetto a quello di altre microalghe, i protoplasmi

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Tale tesi sperimentale è stata condotta

Il presente studio verte sulla comparazione tra l’andamento della crescita ed il

Ha come obbiettivo la dimostrazione del fatto che un surplus di nutrienti induce un

1. Allestimento delle colture della diatomea marina Cyclotella criptica

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Figura 4 Sistema di coltura: sei carboy (due esperimenti in triplicato)

1.1. Mezzo di coltura: composizione, preparazione e somministrazione

Alle colture è stato aggiunto un medio di arricchimento atto a massimizzare la crescita

Tabella 2 Composizione del medium f/2

Componenti medium f/2 Concentrazione Quantità Molarità Finale

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H2O distillata prelevata da un sistema di depurazione MilliQ

solubilizzando in un volume (V) di soluzione pari ad 1L → M = n

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La soluzione di oligoelementi è stata preparata sciogliendo prima 4,36g di Na2EDTA x

La soluzione di vitamina B1 non è stata predisposta come soluzione madre poiché