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FACULTAD DE PESQUERIA

Microbiología de alimentos

COLORACION GRAM

Dra. María Jiménez Forero.


INTRODUCCIÓN

Coloración Gram:

 Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos


diferentes de células.
 Para revelar la presencia de constituyentes celulares
como: Flagelos esporas, cápsulas, pared celular, etc.

 Una de las características citológicas más importantes


de las bacterias es su reacción ante el procedimiento
de coloración Gram.
 Este procedimiento consiste en colorear las células
con el colorante cristal violeta todas las células
tomarán el color azul.
 Las bacterias son seguidamente tratadas con una
solución de yodo y luego decoloradas con alcohol
las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta.
TINCION DE GRAM

Las bacterias se pueden dividir en dos grupos


según la estructura de la pared celular y se
manifiesta a través de la tinción de Gram:

Coloración Gram: Es la respuesta de las bacterias ante las


diferentes reacciones de Gram.

Conceptos básicos:

 Colorantes

Son compuestos químicos que tienen la capacidad de


comunicar su color a otros cuerpos y quedar fijados.
COLORANTE: Son compuestos orgánicos que tienen
alguna afinidad específica por algún componente. Son
compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste.

Tipos de colorantes:

 Básicos: Tiñen la célula bacteriana uniformemente.


Ej.: azul de metileno, la safranina, la fucsina básica, el
cristal violeta.
 Ácidos: No tiñen la célula bacteriana, se usa como
color de contraste, para teñir estructuras
citoplasmáticas. Ej.: la fucsina ácida y el rojo Congo.
 Colorantes liposolubles: Se combinan con los
componentes lipídicos de la célula, usados para
revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej.:
Negro Sudán.

Mordiente: Son sustancias cuya finalidad es dar una afinidad


química a los cuerpos que se desean colorear y que no
poseen.

 No son colorantes, intensifican la tinción porque


aumentan la afinidad de la célula por el colorante.
 Se pueden utilizar para producir un engrosamiento de
ciertas estructuras celulares externas, como los
flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser
visualizados de otra forma.
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación en fresco
Debido a que la morfología de las bacterias se altera
cuando se tiñen.
Se usan Observación en fresco:
 Cuando las bacterias se observan para determinar su
movilidad.
 Para observar los cambios citológicos que ocurren
durante la división celular.

2. Observación con Tinciones


Para observar las características morfológicas de las
bacterias para diferenciar entre especie y dentro de la
misma especie a las células pueden ser:

Tipo de Tinciones:

 Tinción simple: Usa un solo colorante.

Su fundamento es el hecho de que las células tienen una


composición química diferente a la de su entorno, de
modo que ambos se comportan de forma diferente frente a
un colorante.
(Azul de metileno, verde malaquita Nigrosina).
 Tinción diferencial: Se basan en el hecho de que
distintos tipos de células tienen distinta
composición química, y por lo tanto reaccionan de
forma diferente frente a una tinción, lo que permite
clasificar los microorganismos en diferentes
grupos, según su capacidad de tinción.
Ej. La tinción de Gram, Ziehl-Neelsen.
Estas tinciones utilizan más de un colorante.

 Tinción negativa: Colorea el medio que rodea a la


bacteria permaneciendo ésta sin teñir.

Selectivas: Se basan en el hecho de que distintas estructuras


celulares tienen distinta composición química, de modo
que se tiñen diferente. Ej.: tinción de esporas, de flagelos, de
paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos.
Pueden utilizarse uno o más colorantes.

Tipos de tinción selectiva:

 Tinción de Flagelos: Se usa mordiente el cual


aumenta el grosor del microorganismo.
 Tinción de endósporas: Las esporas pueden situarse
en el centro de la célula o cerca de un extremo de la
misma.

 Tinción de esporas:
 Se usa verde de malaquita en contraste con
safranina.
 El de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita.
 Este colorante se une fuertemente a las esporas
gracias a la utilización de calor como mordiente.
 La fase de decoloración en este caso se realiza
con agua abundante.
 Las formas vegetativas pierden el color verde y
se tiñen con el colorante de contraste (fucsina o
safranina).
 Tinción de cápsula: Colorante Nigrosina

 Tinción negativa

1.- Colocar una gota 2.- Tomar muestra 3.- Mezclar con la
de Nigrosina en un del Nigrosina y
porta microorganismo extender por todo
con el asa, flamear el porta. Secar al
el tubo y tapar aire y observar
TIPO DE TINCIONES SEGÚN EL METODO

 Vitales: Son aquellas que se practican sobre células


vivas, usa un colorante. Ej: el verde Jane o el azul de
metileno.
 No vitales: Se realizan sobre células muertas.
 Directa: Cuando se produzca una inmersión o un
baño de colorante.
 Indirecta: Se tiñen soluciones y esta tiñe la muestra.
 Progresiva: Se usan soluciones con colorantes
diluidos hasta obtener la intensidad del color deseado.

FUNDAMENTO DE LA COLORACION GRAM

 La pared celular de las bacterias Gram positivas posee


una gruesa capa de peptidoglucano.
 Además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la
cara interna de la pared celular y unida a la membrana
plasmática.
 La capa de peptidoglucano de las Gram negativas es
delgada y se encuentra unida a una segunda membrana
plasmática exterior por medio de Lipoproteínas.
 En las Gran Negativas la capa de peptidoglicano es
demasiado delgada como para poder retener el complejo
de cristalvioleta/yodo que se formó, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-
violácea.
 Por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared
celular más resistente y con mayor proporción de
Peptidoglicano.
 No son susceptibles a la acción del solvente orgánico,
quien actúa deshidratando los poros cerrándolos
impidiendo que salga el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloración azul violeta.
 Está basado en las diferencias físicas y composición
química de la estructura de la pared celular de los
diferentes M.O.
 Los mismos que al ser coloreados pueden retener siendo
Gram (+).
 No retienen el color y ser Gram (-).

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias


entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas.

Se deshidratan los poros No retiene el complejo de


cerrándolos, impidiendo cristal violeta/yodo.
que escape el complejo
cristal violeta/yodo.
COLORACIÓN GRAM

La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se


utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas.

Una tinción diferencial consiste de tres pasos principales:

 Coloración primaria.
 Decoloración, que remueve el colorante.
 Coloración con un colorante de contraste, o coloración
secundaria.

PASOS BÁSICOS PARA HACER UN COLORACIÓN GRAM:

1. PREPARACIÓN DE UN FROTIS.
2. FIJACIÓN DEL FROTIS.
3. APLICACIÓN DE COLORANTES.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS

 Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca


una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o
un poquito de la muestra solida la muestra.
 Este material es suspendido en una gota de agua o
solución salina previamente colocada sobre el
portaobjetos.
FIJACIÓN DEL FROTIS.

 Luego las células generalmente son tratadas con calor


para coagular el protoplasma y teñirlas, (fijación).
 El material colocado en el portaobjetos se deja secar al
aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la
llama del mechero hasta que el vidrio esté caliente que
moleste al tacto pero no queme.

 También se pueden fijar con sustancias químicas como


formaldehido, ácidos y alcoholes.
 Después de la fijación, si se añade el colorante.
 La fijación produce habitualmente el encogimiento de
las células.
 La tinción, por el contrario, hace que las células
aparezcan mayores que lo que son realmente.

Aplicación de colorantes
 Las células fijadas al calor se tiñen, primero con cristal
violeta.
 Luego son lavadas para quitar el exceso de colorante.
 En este estado, todas las células, tanto las Gram
positivas como las Gram negativas, están teñidas de
azul.
 El portaobjetos se cubre entonces con yodo-yoduro,
lugol que es soluble en agua.
 El I2 entra en las células y forma un complejo cristal
violeta iodo haciéndolo insoluble en agua.
Procedimiento de la tinción GRAM

1. Preparación de la muestra en un portaobjeto

Colocar una gota de SSF o Tomar la muestra con el asa


agua destilada en un de Kole
portaobjeto
Colocar la muestra sobre la gota de agua antes colocada en el
portaobjeto y expandir cuidadosamente

2. Extender en una fina capa de células sobre el portaobjeto

3. Secado al aire

4. Fijación por flameado del portaobjeto


5. Adicionar colorante azul violeta y teñir con cristal violeta
durante 1 min la muestra.

6. Lavar el exceso de cristal violeta

7. Agregar lugol y dejar actuar durante 1 min

8. Decolorar con una mezcla de alcohol y acetona al 50%


durante 5 min
9. Teñir fucsina durante 30 segundos

10. lavar con agua

11. Observar en el microscopio, El colorante de contraste


(fucsina) tiñe de rosa las bacterias Gram-negativas
Resumiendo el procedimiento de la Tinción Gram

1. Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus).


2. Fijación.
3. Cristal violeta 1-2 minutos.
4. Lavar el exceso de colorante
5. Añadir lugol, esperar 1 minuto.
6. Decolorar con alcohol cetona (30 segundos)
7. Lavar con agua.
8. Añadir Safranina (colorante de contraste), por 1 min
9. Lavar con agua.
1 0. Secar.
1 1. Observar (x40, x100).
Observación en el microscopio

 Cocos Gram (+)

Racimos: forma típica de Staphylococcus sp: S. aureus

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp: S. feacalis

Tetratadas: forma típica de Micrococcus sp


Streptococcus

Enterococcus

Coco Gram (-)


Bacilos Gram (-)

Bacilos Gram (+)

Gruesos: forma típica de Clostridium sp: C. perfringens,


C. botulinum
Finos: forma típica de Listeria sp

 Bacilos Gram (-)

Bacilos finos y cortos: forma usual de enterobacteriaceae,


gr Eschericha especie E. Coli

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae


 Cocos Gram (-)

Diplococos: Neiseria sp y Acinetobacter sp aparecen con


morfología de diplococos.

Las Bacteria Gram positivas, tienen varias capas de


peptidoglucano (hasta 25 en algunos casos)
El peptidoglucano representa hasta el 90% de la pared,
constituye la mayoría de las Gram+ (20-80 nm de
espesor).
Pequeñas cantidades de ácidos teicoicos también formar
parte de la misma.
Los ácidos teicoicos son polialcoholes, que aportan carga
negativa
Estructura Pared
Bacterias Gram Positivas

Características de las bacterias Gram (+)

 Son más susceptibles a la penicilina.


 Pared celular relativamente gruesa.
 Contenido de lípidos relativamente bajo (l – 4%).
 Contiene los aminoácidos principales: lisina, cisteína,
triptófano.
 Células resistentes a la ruptura mecánica,
 Polisacáridos (35 – 60%).
 Su pared celular es solubilizada por lisozima (enzima).
 Son solubles en KOH (10%).
 Son formadoras de esporas.
 No son patógenas.
 Son resistentes al calor y a la refrigeración.

Ejemplo de bacterias Gram (+)

Gr. Staphylococcus.

 Cocos Gram (+) de 0.5 a1.0 de µm diámetro.


 Aerobios o anaerobios facultativos.
 En el microscopio aparecen formando racimos o
parejos.
 Son inmóviles.
 Se encuentran en la piel o cavidades mucosas.

 Produce pigmento dorado.

 Es coagulosa (+) fermenta la glucosa

 Son muy resistentes a agentes físicos

 Causa infecciones e intoxicaciones (alimentos).

 La toxina no se produce cuando el alimento se


refrigera a 4° C.

 Crecen a T° de 30 a 37° C

 Causan infecciones en la piel como furúnculos u otras


heridas infectadas.
 Producen enfermedades en animales como mastitis
(inflamación de la mama).

 La enterotoxina es una toxina que tiene una estructura


proteica de bajo, peso molecular 20,000

Bacterias Gram (+) esporuladas anaerobias

Gr. Clostridium

 Bacterias anaeróbicas estrictas.


 Pueden ser patógenas (C. botulinum)
 Produce putrefacción en los alimentos especialmente
carnes.
 Fermentan el azúcar y producen butanol.

Bacterias Gram (+) aerobias

 Son formadoras de esporas.


 Viven generalmente en el suelo
 Son termoresistentes en forma de endosporas
Bacterias Gram Negativa

 El peptidoglicano constituye sólo alrededor del 10% de la


pared, estando constituido el resto por una capa
compleja.
 Cuando se agrega el primer colorante (c. violeta) y el
mordiente lugol.
 El complejo queda retenido en la capa de arriba.
 Cuando se agrega el alcohol acetona el mismo disuelve
la capa juntamente con el colorante.
 Al agregar el segundo colorante, este penetra en la capa
basal y es retenido (M.O. color rosado).
CRACTERISTICAS BACTERIAS GRAM (-)

 Son susceptibles a la estreptomicina.


 Pared celular ligeramente delgada.
 Contenido de lípidos 22%.
 Células menos resistentes a la ruptura mecánica.
 Polisacáridos 10 – 30 %
 No son solubles en KOH
 No forman esporas.
 Son patógenas.
Bacterias Gram (-) aerobios facultativos

 Bacillos cortes
 Bacterias intestinales: grupo entéricos.
 Bacterias de agua.

Eschericha Coli
No patógenas aunque puede haber cepas que causen
problemas intestinales.

ESCHERICHIA

 Hábitat: intestino humano y animales de sangre caliente

 Sintetiza vitaminas (K)


 Gram - anaerobio i facultativos y aerobios
 Fermenta la Lactosa
 Fuente de Nitrógeno: Amoniaco
 Raras veces patógena.
 Género más importante E. Coli.
E. Coli
 Se transmite por alimentos contaminados, agua y
contacto personal.

 Presenta varias especies patógenas


- ECEP
- ECET
- ECEI
- ECEH

 Ampliamente estudiada por lo sencillo y rápido de su


cultivo

 Es un indicador de contaminación fecal


Cocos Bastones

Estreptococos Escherichia coli

Bacterias Gram (-) aerobias


 Móviles con flagelación polar.
 Oportunistas.
 Producen pigmentos.

Genero Vibrio

 Bacilos Gram negativos


 Poseen forma de coma
 Anaerobios facultativos
 Móviles por un flagelo polar
 Habitan aguas dulces o saladas
 Son sensibles al pH ácido pero resisten el pH alcalino
Agar TCBS – Vibrio
SALMONELLA

 Es Patógena

 Amplia distribución en la naturaleza y animales

 Habita en el tubo digestivo (pollos y huevos)

 Principales Especies:
- S. Typhi (Fiebre Tifoidea)
- S. Choleraesuis
- S. Enteritis

 Fuente de energía y carbono: Glucosa.

 No fermenta la Lactosa pero si la Glucosa.


Aporta dos ideas básicas para la definición taxonómica de las
bacterias: (A) el color que adquieren tras la tinción y (B) la
forma que presentan las células bacterianas.

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