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1 El principio básico es que cada compuesto absorbe o transmite luz sobre un cierto rango de longitud
2 de onda. Supongamos que usted mira dos soluciones de la misma sustancia, una de color más
3 oscuro que la otra. Su sentido común le dice que la de color más oscuro es la más concentrada. En
4 otras palabras, como el color de la solución se profundiza, se deduce que su concentración también
5 aumenta. Este es un principio subyacente de la espectrofotometría: la intensidad del color es una
6 medida de la cantidad de un material en solución.
7 Un segundo principio de la espectrofotometría es que cada sustancia absorbe o transmite ciertas
8 longitudes de onda de energía radiante pero no otras longitudes de onda. Por ejemplo, la clorofila
9 siempre absorbe la luz roja y violeta, mientras que transmite amarillo, verde y azul. Las longitudes
10 de onda transmitidas y reflejadas aparecen en verde, el color que su ojo “ve”. La energía de luz
11 absorbida o transmitida debe coincidir exactamente con la energía necesaria para transición (un
12 movimiento de un electrón de un nivel cuántico a otro) en la sustancia considerada. Sólo ciertos
13 fotones de longitud de onda satisfacen esta condición de energía. Así, la absorción o transmisión
14 de longitudes de onda específica es característico de una sustancia, y un análisis espectral sirve
15 como “huella dactilar” del compuesto.
16 La espectrofotometría visible es el método de elección en la mayoría de los laboratorios que se
17 ocupan de la medición de compuestos orgánicos e inorgánicos en una amplia gama de productos y
18 procesos – en ácidos nucleicos y proteínas, productos alimenticios, productos farmacéuticos y
19 fertilizantes, en aceites minerales y en pintura.
20 2. METODOLOGÍA
21 Primero se rotularon los tubos de ensayo, como paso seguido realizamos la preparación de las
22 soluciones patrón y problema, dando un total de 6 soluciones; para realizar la práctica de manera
23 óptima se optó por dividir la preparación de las muestras para obtener diferentes resultados en caso
24 de que se presentasen errores, de esta manera, en nuestro caso; preparamos dos soluciones en las
25 que se usó el P1, P3 y blanco añadiendo 1 mL de solución a cada una. Luego se procedió a preparar
26 la reacción de Lowry, para esto, a un vaso de precipitado se le agregaron 5 mL de Sulfato de cobre
27 0,5% en Tartrato al 1%, esperamos alrededor de 10 minutos para añadir el reactivo de Folin, este
28 reactivo fue previamente añadido a las 3 soluciones anteriormente mencionadas, después se esperó
29 30 minutos mas. Finalmente, se tomó la absorbancia de cada muestra en el espectrofotómetro a una
30 longitud de onda de 750nm.
31 3. RESULTADOS
0.6
9 0.4 Series1
11 0
0 5 10 15 20 25 30
-0.2
12 Concentración ug/mL
13 Cálculos
14 Teniendo nuestra ecuación podemos encontrar el valor de la concentración de la muestra problema
15 1 y 2 a las que se tomó la absorbancia.
16
17 Muestra problema 1.
18 Tenemos que, Y= 0.0349x - 0.013, despejando X
𝑦 + 0.013
19 =𝑥
0.0349
20
21 Reemplazando y, que es absorbancia en donde obtuvimos un valor de 0.08 nos da una
22 concentración aproximada de 6.4.
0.112 + 0.013
23 ≅ 3.6
0.0349
24
25 A partir de la curva patrón se logró identificar la concentración de albumina bovina en la muestra
26 problema que según los datos obtenidos se acerca a la concentración estimada.
27
1 Muestra problema 3.
2 Tenemos que, Y= 0.0349x - 0.013, despejando X
𝑦 + 0.013
3 =𝑥
0.0349
4
5 Reemplazando y, que es absorbancia en donde obtuvimos un valor de 0.08 nos da una
6 concentración aproximada de 6.4.
0.237 + 0.013
7 ≅ 7.1
0.0349
8
9 A partir de la curva patrón se logró identificar la concentración de albumina bovina en la muestra
10 problema que según los datos obtenidos se acerca a la concentración estimada.
11
12 4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
13 Basándose en el principio de que la absorbancia de una sustancia es proporcional a su
14 concentración1, logramos identificar que las sustancias más concentradas muestran una lectura más
15 elevada de absorbancia y que a medida que disminuye la concentración de una sustancia, también
16 disminuye su absorbancia.
17 De acuerdo con la ecuación de la recta que se genera a partir de los datos de concentración y los
18 obtenidos de absorbancia con el espectrofotómetro, se da una ecuación de la recta, Y= 0.0349x -
19 0.013, en donde Y, es absorbancia y X (Tabla 1), es concentración en g/mL; a partir de ello se
20 obtuvo un valor de correlación r, que indica la alineación de los puntos, es importante saber que el
21 resultado del coeficiente de determinación oscila entre 0 y 1. Cuanto más cerca de 1 se sitúe su
22 valor, mayor será el ajuste del modelo a la variable que estamos intentando explicar, en este caso
23 la absorbancia, y de forma inversa cuanto más cerca de cero, menos ajustado estará el modelo y,
24 por tanto, menos fiable será. A partir de esto, nuestro valor en r, es r² = 0.969, lo que nos indica
25 que al estar cercano al 1, nuestro modelo de absorbancia es cercano a un valor real.
26 De acuerdo al principio que la absorbancia de una sustancia es proporcional a su concentración1, e
27 identificado los resultados obtenidos en la relación de la absorbancia de las soluciones y sus
28 concentraciones, comprobamos que las medida de sus volúmenes influyen en los valores de la
29 absorbancia; es decir, que las sustancias deben tener una medida precisa para obtener los valores
30 deseados, además de otro factor como el tiempo, ya que es esencial que este sea manejado con la
1 mayor precisión pues a medida que éste transcurra, más la reacción se verá afectada y los datos de
2 absorbancia también.
3 Análisis método de Lowry. El fundamento del método de Lowry para cuantificación de proteínas
4 está basado en la interacción de las proteínas con el reactivo de Folin (tungstato, molibdato y
5 fosfato) en medio alcalino (pH 10-10.5) y con Cu2+. Es una valoración colorimétrica cuantitativa
6 de las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas.
7 Este método consta de dos etapas: En la primera los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las
8 proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos
9 complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la
10 estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a
11 participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de
12 su complejo con tartrato.
13 En la segunda parte se da la reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau,
14 por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas,
15 actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es
16 el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da
17 lugar a un complejo de color azul intenso2.
18 Cuando el reactivo de Folin es adicionado a la proteína tratada con Cu2+ el máximo color se da si
19 la reducción ocurre alrededor de un pH 10. En este punto el reactivo, solo esta reactivo por un corto
20 periodo de tiempo.
21 5. CONCLUSIONES
22 1. Aprendimos que, para evaluar un compuesto por medio de la espectrofotometría, éste debe
23 absorber la luz.
24 2. Determinamos que la absorbancia está representada por una recta ascendente, siendo esta
25 directamente proporcional.
26 3. Entendimos que el método de Lowry es colorimétrico de valoración cuantitativa de
27 proteínas, ya que al añadirlo se forma una coloración si hay presencia de proteínas siendo
28 la intensidad del color proporcional a la cantidad de proteína.
29 6. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
30 6.1. Determinar las concentraciones de las muestras problema en función de la curva de
31 calibración.
13
14 Fig. 1 Reacción de reducción con el ditiotreitol
15 Bibliografía
16 1. Eugene, D. Olsen, Métodos ópticos de análisis. Barcelona, España. Editorial Reverté S.A.
17 1990.
18 2. Jacobo, D.; Teresa, F. & Fernando, P. Aspectos básicos de bioquímica clínica. Madrid,
19 España. Ediciones Díaz de Santos. 1997.
20 3. Giraldo, G.; Chamorro, N. & Mejía, C. Laboratorio de bioquímica: una visión práctica.
21 Armenia, Quindío, Colombia. Ediciones Elizcom. 2010.
22 4. Universidad Nacional de San Martín. Determinación de proteínas por el método de Lowry-
23 Biuret. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Francia CP (1650).