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La columna es el lugar donde ocurre la separación. Es la parte esencial del cromatógrafo de líquidos ya que
en ella, a través de diferentes mecanismos (adsorción, partición, cambio iónico, exclusión, etc.), tiene lugar la
separación o discriminación entre analitos e interferentes.
Las columnas de HPLC han mejorado significativamente. El material de empaquetamiento es más uniforme
y el tamaño de las partículas menor, lo que implica un aumento de la presión de trabajo. Las fases estacionarias se
encuentran químicamente enlazadas al soporte. Los métodos de preparación han mejorado significativamente.
Material de Empaque
Naturaleza de la superficie del empaque (esta puede ser modificada física o
químicamente)
Tamaño de la Partícula
Forma de la Partícula
Soportes
Originalmente estos eran sílica y alúmina de formas irregulares. Hoy en día están disponibles una serie de
soportes sintéticos de formas muy regulares.
Tamaño de partículas
En la medida que se reduce el tamaño de la partícula, aumenta la eficiencia, así como los requerimientos
de presión.
FASES ESTACIONARIAS
- sílica o alúmina
- fases enlazadas químicamente a sílica o alúmina
- geles
- vidrio o sílica con tamaño de poro controlado
Fases de adsorción
1. Alúmina:
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Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen
2. Sílice:
Las partículas de sílice utilizadas en cromatografía de adsorción poseen una cierta abundancia de grupo
silanol (Si-OH), anclados en una superficie. Estos grupos son químicamente activos y pueden aprovecharse como
punto de partida que permita la filación de radicales orgánicos (Si-R) en la superficie de la sílice. Si se consigue un
grado de funcionalización suficiente de la superficie, el resultado puede asemejarse al conseguido por una simple
impregnación.
Los soportes para casi todos los rellenos con fases enlazadas se preparan con sílice rígida o
composiciones constituidas básicamente por sílice. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente
resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 µm. La superficie de la sílice totalmente hidrolizada (por
calentamiento con HCI 0,1 M durante uno o dos días) está constituida por grupos SiOH químicamente reactivos.
Los recubrimientos de fase enlazada más utilizados son los siloxanos, que se forman por reacción de la
superficie hidrolizada con un organoclorosilano. La letra “R” representa un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido.
Los grupos SiOH que no han reaccionado, imparten una polaridad indeseable a la superficie, lo que origina
picos con cola en especial con los solutos básicos. Para reducir este efecto, los rellenos de siloxano muchas veces
se desactivan por reacción con clorotrimetilsilano, el cual, debido a su pequeño tamaño, puede unirse químicamente
a los grupos SiOH que no habían reaccionado.
* En cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que es más
soluble en la fase móvil; un aumento de la polaridad de la fase móvil provoca una disminución del tiempo
de elución.
En los rellenos de fase enlazada en fase normal el recubrimiento unido químicamente contiene grupos
funcionales polares. En la estructura del siloxano, “R” es un grupo funcional polar como es el
caso de los grupos...
Las polaridades de estos materiales de relleno varían en un gran intervalo, siendo el tipo ciano el menos
polar y el tipo amino el más polar. Los rellenos de diol son de una polaridad intermedia.
La elución se realiza con disolventes relativamente no polares, tales como el etiléter, cloroformo y n-
hexano.
* En la cromatografía en fase inversa, los componentes más polares eluyen primero; un aumento de la
polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
En los rellenos de fase enlazada en fase inversa el recubrimiento tiene un carácter no polar. Por lo
general, el grupo “R” del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (C-8; RP8), una
cadena C18 (C-18; RP18). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga
se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando un
recubrimiento enlazado se puede tratar como si fuera un líquido convencional retenido
físicamente.
La elución se lleva a cabo con una fase móvil de elevada polaridad como es el caso de una solución
acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como metanol, acetonitrilo (ACN) o
tetrahidrofurano (THF). Se ha de procurar que el pH sea menor de 7,5 porque si no puede tener
lugar la hidrólisis del siloxano, lo que originaría la degradación o destrucción del relleno.
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Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen
Las partículas poliméricas porosas no resultan del todo adecuadas como rellenos cromatográficos debido a
la baja velocidad de difusión de las moléculas de los analitos a través de los microporos de la matriz polimérica, y
también debido a la compresibilidad de la matriz. Para solventar este problema, se han desarrollado dos nuevos
tipos de rellenos que se utilizan más que el tipo de polímero poroso,
* Uno es el relleno de partícula pelicular en el que la superficie relativamente grande (de 30 a 40 µm) de
una partícula, esférica y no porosa, de vidrio o polimérica se recubre con una resina sintética de
intercambio iónico.
* Un segundo tipo de relleno se prepara recubriendo micropartículas porosas de sílice, tal como las que
se utilizan en la cromatografía de adsorción, con una delgada película del intercambiador.
Con cualquiera de ellas, se obtiene un aumento de la eficacia debido a que la difusión en el polímero es
más rápida. Por otra parte, la capacidad de carga de estos rellenos es menor, especialmente los de tipo pelicular.
Las fases móviles en cromatografía de intercambio iónico suelen ser disoluciones acuosas que pueden
contener cantidades moderadas de metanol u otros disolventes orgánicos miscibles con el agua; estas fase móvil, a
menudo contienen especies iónicas en forma de disolución reguladora. La fuerza eluyente y la selectividad se
determinan por el tipo y concentración de esos ingredientes añadidos. En general, los iones de la fase móvil
compiten con los iones del analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico.
La selección se hace con base en los requerimientos de presión y el rango de tamaño que aplica a los
analitos. Se encuentran dos tipos de rellenos - partículas poliméricas y partículas de sílice - con diámetros de
partícula que oscilan de 5 a 10 µm. Los últimos tienen la ventaja de:
Los inconvenientes de las partículas de sílice son su tendencia a retener solutos por adsorción, y su
capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del soluto.
Las partículas de vidrio y de sílice porosas, que se comercializan actualmente, tienen tamaños promedio de
poro que oscilan entre 40 y 2500 Å. A fin de reducir la adsorción, las superficies de estas partículas se modifican por
reacción con sustituyentes orgánicos.
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Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen
En cromatografía líquida se utilizan dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de partícula porosa:
* El relleno pelicular consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos
diámetros característicos de 30 a 40 µm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y
porosa de sílice, alúmina o de una resina de intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un
recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción.
Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Por lo
general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas
analíticas.
* Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía líquida están formados por micropartículas
porosas con diámetros entre 3 y 10 µm. Las partículas son de sílice, alúmina o resinas de intercambio
iónico, aunque la sílice es el material más común. Las partículas de sílice se sintetizan aglomerando
partículas de sílice de tamaños inferiores al micrón en unas condiciones tales que se forman partículas
mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se recubren muchas veces con
películas orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie.
TIPOS DE COLUMNA
- columnas convencionales
- empaquetamiento pelicular
por recubrimiento
porosidad superficial
- empaquetamiento de micropartículas porosas
- microcolumnas
- microtubulares abiertas
- microcapilares parcialmente empaquetadas
- microcolumnas totalmente empaquetadas
Se observa una distinción básica entre las convencionales y las microcolumnas (en relación con su
diámetro.
Dentro de las columnas HPLC convencionales, son las de empaquetamiento de película las primeras que
se usaron. El material (fase estacionaria) consiste en bolitas esféricas regulares (30 – 70 m) de un sólido no
poroso, generalmente vidrio, que están recubiertas de una capa (1 –3 m) de material activo cromatográfico poroso,
de naturaleza polimérica. La distribución cromatográfica entre fase móvil y estacionaria es más asequible que si se
tratase de partículas porosas de igual tamaño. No obstante, la capacidad y eficacia de las columnas con este tipo de
empaquetamiento en HPLC aumenta considerablemente cuando se sustituye el recubrimiento posterior por un
tratamiento especial de las bolitas de vidrio (30 – 60 m) para que adquieran una microzona porosa externa (1 – 3
m), también de vidrio, para que pueda actuar de sólido activo en cromatografía de adsorción, o bien como soporte
de la fase estacionaria líquida (enlazada o no). El volumen de poro de estas bolitas es muy pequeño, lo que origina
una rápida difusión de los solutos en ambos sentidos, por lo que son adecuadas para cuando se requiere una gran
velocidad de determinación.
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Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen
Las columnas para cromatografía líquida se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de
diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.
Estas últimas sólo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi.
Las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas.
Recientemente, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen
menores dimensiones que las anteriormente descritas. Presentan la ventaja de la rapidez (unos segundos) y del
mínimo consumo de disolvente.
Las microcolumnas en HPLC suponen una reducción sustancial del diámetro de las mismas y un aumento
considerable de la longitud. Las características técnicas de la HPLC miniaturizada llevada a cabo en la modalidad
“microcolumna” son tres:
Además, las condiciones técnicas son diferentes para cada tipo de microcolumna.
Para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en
suspensión y los contaminantes de los disolventes. La precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase
estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica. La composición del relleno de la
precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común
mayor para minimizar la caída de presión.
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Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen
Termostatación
El sistema de termostatación es por aire en unas cámaras denominadas “hornos, para las columnas que
controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado ( 0.3 – 0.5 ºC). La temperatura normal es de 25 ºC,
aunque para cietos tipos de cromatografías, como la de exclusión por tamaños, en determinados casos, son
necesarias temperaturas del orden de 200 °C.
Son escasos los sistemas HPLC con programación de temperatuar durante el proceso cromatográfico. Una
dificultad importante estriba en que la máxima temperatura tiene que ser al menos 20 ºC inferior al punto de
ebullición de la fase móvil; por ello, la capacidad de incremento de la resolución cromatográfica empleando una
variación de temperatura es mucho menor que la de variación de la composición de la fase móvil. Se: reducción de
los tiempos de retención de picos que salen muy lentamente y mejora de la resolución al principio y al final del
cromatograma.
EFICACIA DE LA COLUMNA
El efecto del tamaño de partícula del relleno se realiza mediante un examen del coeficiente de
transferencia de masa de la FM de la ecuación de Van Deemter (C) observando que C es función del cuadrado del
diámetro dp de las partículas que constituyen el relleno. La eficacia de una columna de HPLC debería mejorar mucho
cuando disminuye el tamaño de partícula.
En cromatografía líquida, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de
la columna. Este ensanchamiento de banda extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a través de
tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los detectores y en los tubos que conectan los
distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las
capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una
banda de soluto se mueve con más rapidez que la periferia.
Todos los esfuerzos han de orientarse a la reducción del radio de los tubos del sistema externos a la
columna.
Existe, por último, un efecto del tamaño de muestra en la eficacia de la columna. Los rellenos de fase
enlazada en fase inversa, comparados con otros tipos de rellenos, presentan una HETP muy baja y casi constante.
Longitud de la Columna
Diámetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de diámetro externo)
Tamaño de las partículas del relleno
Naturaleza de las fases
Cantidad de fase estacionaria
Temperatura de la columna
Velocidad del gas portador
Cantidad de muestra inyectada
Material del cual está elaborada la columna
APLICACIONES
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Criterios de selección de columnas para HPLC – resumen
Los rellenos con fases unidas químicamente, cuando se utilizan en fase inversa en combinación con
disolventes muy polares (a menudo acuosos) se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografía líquida.
Para investigar la separación de nuevos tipos de muestras, estos son los rellenos que se utilizan en primer lugar.
Algunas aplicaciones típicas de la HPLC de reparto son: productos farmacéuticos, bioquímica, productos
alimentarios, productos de la industria química, contaminantes, química forense, medicina clínica.
En algunos casos, es conveniente la formación de derivados, o sea, transformar los componentes de una
muestra en otros compuestos antes, o a veces después, de proceder a la separación cromatográfica. Puede ser
necesario,
(1) para reducir la polaridad de las especies y de este modo poder utilizar columnas de reparto y
no de intercambio iónico,
(2) para aumentar la respuesta del detector para todos los componentes de la muestra y
(3) para aumentar selectivamente la respuesta del detector para determinados componentes de la
muestra.
Las aplicaciones de la cromatografía de pares iónicos con frecuencia se superponen con las de la
cromatografía iónica. Para la separación se pequeños iones inorgánicos y orgánicos se prefiere la cromatografía
iónica a no ser que haya un problema de selectividad.
Las fases estacionarias quirales (CSPS) para separar isómeros ópticamente activos (enantiómeros) tanto
por cromatografía de gases como líquida, aunque se adapta mejor a la HPLC.
Actualmente se comercializan más de una docena de fases estacionarias quirales. Todas ellas son
recubrimientos sobre soportes de gel de sílice. El recubrimiento por lo general consiste en un material polimérico al
cual se le ha unido un isómero ópticamente activo.
Separan las moléculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso
molecular y de las sales. También es útil en la separación de homólogos y oligómeros. Otra gran aplicación es la
determinación rápida de los pesos moleculares, o de la distribución de pesos moleculares en los grandes
polímeros o en los productos naturales.