Estandarización del cultivo de embriones de

pollo sin cáscara

Ana Isabel Téllez Beltrán

Universidad Antonio Nariño

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Bogotá, D.C Colombia

2013

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Estandarización del cultivo de embriones de
pollo sin cáscara

Ana Isabel Téllez Beltrán

Proyecto de PIF ll

Dirigido por:

Edwin Acosta Virgüez PhD.

Universidad Antonio Nariño

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Bogotá, D.C Colombia

2013

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 INDICE

1 INTRODUCCION………………………………………………………………………4
1.1 Desarrollo embrionario aviar…………………………………………………………...5
1.2 Condiciones de incubación………………………………………………………………..9
1.3 Metodologías de cultivo de embriones de pollo ex-ovo………………….…12
1.4 Planteamiento………………………………………………………………………….…..…13
1.5 Justificación……………………………………………………………………………....….…14

2 OBJETIVOS…………………………………………………………….……………....14
2.1 Objetivo general…………………………………………………………………………….14
2.2 Objetivos específicos…………………………………………………….……………..…15

3 METODOLOGIA………………………………………………….………..………….15

4 CRONOGRAMA………………………………………………………………..…..….17

5 PRESUPUESTO………………………………………………….……….…………...17

6 RESULTADOS ESPERADOS……………………………………………….…….18

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1. INTRODUCCIÓN

El Cultivo de embriones de pollo sin cáscara es un método que permite observar el

desarrollo embrionario de forma directa, es importante resaltar que el procedimiento es
delicado y debe realizarse con el mayor de los cuidados, sin embargo no es considerado
un procedimiento difícil (Winstead.,1974). Antes de realizar el cultivo de embriones de
pollo ex-ovo es importante tener en cuenta diversos aspectos para que éste tenga éxito.
Dado que el proceso abarca diferentes fases y que cada investigador puede requerir
intervenir en una determinada, el proceso se puede llevar hasta una cierta fase del
desarrollo embrionario. En este proyecto en específico se llevará a cabo hasta el estadio
HH19 (68-72 horas) donde se observa al embrión con 38-40 somitas extendidos hacia la
cola que finalizan en segmentos, la alantoides se ve como una bolsa de tamaño variable
no vesicular y los ojos aún no están pigmentados (Hamburger y Hamilton.,1951). Como se
indicó con anterioridad, para que el embrión crezca hasta el límite establecido es
necesario, no sólo, tener conocimientos acerca de las condiciones de incubación de
embriones de pollo ex-ovo sino del proceso de desarrollo en sí mismo. Ya que el embrión
crecerá sin cáscara, la cuál encierra los nutrientes necesarios para su correcto desarrollo
(agua, proteínas, grasas y minerales) (Needham.,1931). Los principales factores que se
deben manejar para su supervivencia son, asepsia, temperatura, humedad y
disponibilidad de oxígeno. El porcentaje de este último siempre es el mismo, sin embargo
su disponibilidad (cantidad de oxígeno que llega a los tejidos por unidad de tiempo), varía
según la altura (fluctúa con la presión atmosférica). La escasez de oxígeno afecta en el
intercambio gaseoso (entrada de oxígeno y salida de dióxido de carbono), además de
alterar funciones endocrinas, tienen una importancia vital para un adecuado desarrollo
embrionario durante la incubación (Li y col., 2009). En condiciones de hipoxia disminuye
en gran medida la tasa metabólica en el embrión, además de la reparación celular y
desarrollo tisular, esto induce a un trastorno cardiovascular, lo que produce una hipertrofia
cardiaca afectando la supervivencia del embrión (Visschedijk.,1980). El segundo factor a
manejar es la temperatura la cuál es determinante sobre la vida del embrión y su eclosión,
la tasa de crecimiento puede ser hereditaria, sin embargo, la temperatura está
estrechamente relacionada con el desarrollo embrionario (Needham., 1931), esta debe
ser de 37.5ºC, ya que se ha demostrado que un porcentaje alto de embriones (18%)
cultivados sin cáscara han logrado sobrevivir hasta la etapa HH15 (Schomann, 2013). En
cuanto a la humedad se mantendrá en un 60% para evitar que la membrana

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corioalantoidea (CAM) se seque, lo que finaliza en la muerte del embrión. Vale recalcar
que si la temperatura es inferior en un rango mínimo a 37.5 ºC, el embrión tendrá un
desarrollo excesivamente lento (Dohle.,2009). Los tres factores mencionados con
anterioridad son de alta importancia para que el embrión logre desarrollarse en un cultivo
ex-ovo.

El presente proyecto se llevara a cabo en Bogotá D.C, con una altura de 2.625 msnm y
una temperatura que oscila entre 8 y 19 ºC. El objetivo principal de esta investigación es
estandarizar el cultivo de embriones de pollo sin cáscara en las condiciones óptimas
nombradas con anterioridad para su correcto desarrollo hasta la etapa HH19 (72 horas).

1.1 DESARROLLO EMBRIONARIO AVIAR

Fertilización:

La fertilización se lleva a cabo en el momento preciso en el que el óvulo y el

espermatozoide de unen.

Mórula (blastodermo):

Los espermatozoides viajan a través del oviducto buscando al óvulo que se encuentra en
el infundíbulo. La división celular (clivaje), inicia aproximadamente 5 horas después de la
fertilización, y es llevado a cabo cuándo el cigoto formado entra en el istmo, al salir de
este, el cigoto ahora llamado blastodermo posee alrededor de 8 células y luego de estar 4
horas en el útero han crecido a 15.000 células aproximadamente. El blastodermo mide
aproximadamente 4 mm, la zona central que lo conforma es conocida como zona pelúcida
y la periférica como área opaca. Entre el área pelúcida y el área opaca, existe una capa
delgada de células conocida como zona marginal, esta última es considerada como
importante, ya que llega a jugar un papel vital en la determinación del destino de las
células durante el desarrollo temprano del pollo (Brown. 1982).

Gastrulación:

Las células de la zona pelúcida se encuentran en la superficie formando el epiblasto,

mientras que otras permanecen más profundas formando el hipoblasto. El espacio entre
ambas capas celulares es conocido como blastocele.

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El desarrollo embrionario aviar difiere de el de los peces o anfibios en que se lleva a cabo
sobre el vitelo (yema), sin embargo se observa el mismo proceso global para todos
(Sunderland., 2000).

El epiblasto presenta un engrosamiento en la región posterior del embrión, formando la

línea primitiva, que posteriormente se alargará por la migración de células presentes en la
zona lateral del epiblasto posterior hasta el centro del mismo, formándose una depresión
en la zona anterior de la línea primitiva, luego se forma un engrosamiento conocido como
el nodo de Hensen, que a su vez tiene una depresión (fosita primitiva). Después sucede
una migración de las células a través de la línea primitiva, formándose así el endodermo
(intestino anterior). Las próximas células que migran al blastocele se mantienen en el
endodermo y epiblasto para formar en mesodermo, estas células se mueven hacia
adelante para iniciar la formación de la cabeza (Winstead., 1974). Posteriormente las
células del mesodermo se invaginan, mientras que la línea primitiva retrocede a una
posición posterior. El epiblasto se compone de células ectodérmicas. Cuándo la
gastrulación finaliza el ectodermo rodea al vitelo (yema).

El endodermo reemplaza a las células del hipoblasto y el mesodermo queda situado en el

medio de las dos capas mencionadas con anterioridad, a partir de estas tres capas se
forman los órganos del animal. El ectodermo es el encargado de formar, plumas, pico,
piel, ojos y sistema nervioso. El endodermo a su vez forma el sistema respiratorio,
digestivo y los órganos secretores, mientras que el mesodermo forma el esqueleto,
músculos, sistema respiratorio, órganos reproductores y sistema excretor (Brown., 1982).

Formación de Membranas extra-embrionarias:

En el mesodermo, la región de la notocorda constituye mesodermo paraxial y lateral

(periférica). Poco después de que se forma la cabeza, el mesodermo paraxial se ve
invadido por hendiduras transversales que se cortan en bloques o segmentos conocidos
como somitas, el primero que se forma se encuentra junto a la línea primitiva. En 1930
Waddington informó que la línea primitiva induce a la formación de pliegues neurales y
llega a la conclusión de que la misma, es un organizador funcional (Stern., 2000). Luego
se forman detrás de la primera somita una secuencia de las mismas. Dentro del
mesodermo paraxial se lleva a cabo una división horizontal, posteriormente aparece una
cavidad dentro de este y por la división se forma una capa somática exterior y una capa
esplácnica anterior.

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La capa somática tiene relación con el ectodermo, a partir de esta unión se forma la
somatopleura, mientras que la esplácnica tiene estrecha relación con el endodermo
formando la esplacnopleura. El espacio que se forma entre estos dos se le conoce como
celoma (Bradley.,1915). Las membranas extraembrionarias son conocidas como amnios,
corioalantoides y saco vitelino (SV). Las dos primeras son formadas por la somatopleura.
Evidentemente el embrión aviar no tiene ningún vínculo anatómico con la gallina después
de la oviposición (Neddham.,1931), por lo tanto la cáscara le provee nutrientes
esenciales, excepto el oxigeno.
El saco vitelino es formado por el endodermo esplácnico, este rodea el vitelo (yema). La
capa que rodea al saco vitelino es llamada esplacnopleura, posteriormente se forman
canales de vasos sanguíneos derivados del mesodermo esplácnico, esto proveerá
nutrientes al embrión. Luego de haberse formado el tubo neural, el mesodermo y el
ectodermo se desprenden del vitelo y crecen sobre el embrión, dando como resultado la
formación del amnios. La membrana que lo rodea es conocida como somatopleura, esta
cavidad protege al embrión de cualquier tipo de traumatismo; el corion (cubre a amnios)
que se sitúa cerca de la cáscara, es vascular y ayuda en el intercambio de gases. La
alantoides se desarrolla a medida que crece el embrión entre el amnios y el SV, está
conducido por el corazón embrionario, cuándo se desarrolla completamente rodea al
embrión en su totalidad, esta membrana cumple funciones respiratorias, oxigena la
sangre y expulsa el CO2, además también cumple funciones excretoras, eliminando los
desechos del metabolismo. Por último permite que el embrión tenga acceso a la albúmina
y al calcio presente en la cáscara (Roux, descriptive embriology)

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Grafica 1. Dìa 7. Séptimo día de la formación de membranas extra-embrionarias y vasos
sanguíneos del embrión de pollo

Tomado de: Winstead, from egg to chick A 4-H manual of embryology and incubation, 1974.

Etapas, Hamburger y Hamilton:

En 1951 Hamburger y Hamilton establecieron una secuencia de 46 estadíos donde

describen el desarrollo embrionario del pollo. Las etapas establecidas están organizadas
según las horas que transcurren tras incubación. Para ordenar los estadios, Hamburger y
Hamilton observaron las estructuras anatómicas que aparecían durante el desarrollo del
embrión de pollo.

El presente trabajo se desarrollará en las etapas de HH1-HH19 (72 horas), ya que Los
embriones de pollo a partir del estado en el que se ha desarrollado el tubo neural
constituyendo un cerebro funcional, pueden ser capaces de percibir dolor desde esa
etapa, es decir los procedimientos experimentales que se quieran realizar deben llevarse
a cabo antes del día 7 (Close., 1986).

 HH1: Antes de que se forme la línea primitiva, un “escudo embriónico” se hace visible,
se acumulan células en la mitad posterior del blastodermo.

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 HH2: La línea primitiva se engrosa, mide 0.3-0.5 mm aproximadamente en el borde
posterior de la zona pelúcida, 6 horas tras incubación.
 HH3: (12-13 horas). La línea primitiva se extiende desde el margen posterior del
centro de la zona pelúcida y toca el área opaca.
 HH4: (18-19 horas). La línea primitiva ha alcanzado su longitud máxima, 1.88 mm, el
surco primitivo, la fosita primitiva y el nodo de Hensen se hacen presentes, la zona
pelúcida toma la forma de pera y se extiende a dos tercios de su longitud.
 HH5: (19-22 horas). La notocorda se hace visible, el mesodermo condensado de
extiende hacia adelante desde el borde anterior del nodo de Hensen.
 HH6: (23-25 horas). Un pliegue definido del blastodermo anterior es observado. No
hay somitas, se considera una etapa transitoria.
 HH7: (23-26 horas). Se forman los dos primeros somitas, los pliegues neurales son
visibles en la zona de la cabeza.
 HH8: (26-29 horas). Los pliegues neurales se reúnen a nivel del cerebro medio, “islas”
de sangre se observan en la mitad posterior del blastodermo.
 HH9: (29-33 horas). Aparecen las vesículas ópticas primarias, el primordio
emparejado con el corazón empiezan a fundirse.
 HH10: (33-38 horas). Diez somitas formados, el primero se dispersa y no está incluido
en la cuenta para las etapas subsiguientes, se ven de forma clara las tres primeras
vesículas cerebrales y el corazón se observa ligeramente inclinado hacia la derecha.
 HH11: (40-45 horas). Se observa una leve flexura craneal, las vesículas ópticas se
contraen y el corazón se dobla la derecha.
 HH12: (45-49 horas). Dieciséis somitas, la cabeza rota hacia la izquierda, se observan
telencéfalo, el tallo y las vesículas ópticas bien establecidos. Pozo auditivo está
profundo y abierto, el corazón toma la forma de una “S”.
 HH13: (48-52 horas). Diecinueve somitas, la cabeza gira totalmente hacia la izquierda,
las flexiones craneales y cervicales forman curvas amplias, se observan cana
atrioventricular, amnios que cubre cerebro anterior y por último cerebro medio.
 HH14: (50-53 horas). Veintidós somitas, los ejes del cerebro anterior forman un ángulo
derecho del cerebro posterior, la vesícula óptica empieza a invaginarse, más allá de
esta etapa, el número de somitas formado se hace difícil de identificar.
 HH15: (50-55 horas). Veintisiete somitas, los pliegues de la parte lateral se extienden
hasta el nivel del ala, de forma paralela se condensa el mesodermo, el amnios se

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 extiende hasta el somita catorce aproximadamente, la parte posterior del cerebro
forma un ángulo agudo. Se observa prosencéfalo, el arco visceral forma el paladar
hendido.
 HH16: (51-56 horas). 32 somitas, los pliegues del cuerpo lateral se extienden
alrededor de toda la circunferencia del cuerpo, el amnios va desde el tronco posterior
y la cola, la flexión craneal no se modifica. Las fosas nasales son observadas
 HH18: (65-69 horas). 36 somitas que se extiende más allá de la pierna, en ocasiones
se ve un agujero oval en la zona lumbar, la cola se gira a la derecha al eje del tronco,
el proceso maxilar está ausente.
 HH19: (68-72 horas). 40 somitas extendidos a nivel de la cola, en el eje de la médula
se forma un ángulo agudo con el eje del tronco, en cuánto al arco visceral, el proceso
maxilar se ve como un abultamiento de la misma longitud que el proceso mandibular,
el segundo arco se proyecta en la superficie del embrión, la alantoides se observa no
vesicular y sus ojos aún no están pigmentados.

1.2 CONDICIONES DE INCUBACIÓN

Almacenamiento:

Antes de iniciar la incubación de los embriones de pollo sin cáscara es importante

almacenarlos 2-3 días, en este tiempo el CO2 se libera del huevo, aumentando los niveles
de albumina, lo que mantiene un P.H óptimo de 6.5, por lo tanto el embrión tendrá un
adecuado desarrollo embrionario temprano (Gerd de Lange., 2009). El tiempo de
almacenamiento tiene efectos sobre la PO2, PCO2 y hormonas tales como tiroxina (T4),
triyodotironina (T3) y corticosterona (vitales para el crecimiento). Si los embriones de
pollo se almacenan más de 3 días tendrán una proporción menor de T3/T4 y
corticosterona, en cuánto a los gases la PCO2 aumenta y la PO2 disminuye (Tona.,
2003), también se sabe que si el almacenamiento supera las dos semanas, la capacidad
de eclosión se reduce considerablemente (Smith., 2004).

Humedad:

La humedad es un factor de vital importancia para la formación del embrión aviar. Esta
expresada en porcentaje. Durante la incubación se recomienda que la humedad relativa
sea de 60%, si baja de este valor, resultará en una evaporación excesiva del huevo y el
embrión de pegará a la cáscara. El nivel de temperatura cambia según los niveles

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relativos de humedad en el aire (Winstead., 1974). El embrión pierde agua a través de la
cáscara, esta pérdida puede deberse al grosor de la misma, según estudios esta
característica afecta la conductancia de agua, si la cáscara es más delgada habrá una
perdida mayor de líquidos (Sahan.,2003). La humedad tiene efectos sobre el peso del
embrión. Se han incubado embriones a 53,63 y 43%, en este ultimo porcentaje de
humedad el embrión tuvo un peso menor y un porcentaje de proteína cruda (P.C)
igualmente reducido (Peebles.,2001), Vale recalcar que el porcentaje de humedad varia
en diversos estudios, por ejemplo, En un estudio, la tasa de supervivencia del embrión de
pollo cultivado ex-ovo no se vio afectada trabajando con una humedad del 80%(Datar.,
2005).

El presente trabajo se realizará de acuerdo a procedimiento de cultivo ex-ovo de

embriones de pollo realizado en la Universidad de Cornell, con una humedad del 60%,
porcentaje considerado como aceptable para la supervivencia y posterior observación del
embrión. La humedad se medirá con un termómetro húmedo de mercurio, el que se
envuelve en un paño de algodón totalmente empapado de agua, esta se evapora al recibir
una corriente de aire, dependiendo de la humedad presente en el mismo.

Temperatura:

La temperatura es un factor que permite el correcto desarrollo y metabolismo del embrión

de pollo (Romanoff.,1960), para que esto se cumpla la temperatura ambiente debe ser
37.5ºC, la temperatura, valga la redundancia afecta la capacidad de eclosión y un co-
rrecto desarrollo embrionario (peso y longitud). La combinación de una temperatura am-
biente y bajos niveles de O2 aumenta los índices de mortalidad embrionaria (Verhoelst.,
2011). Si el embrión se encuentra a una temperatura inferior a 37.5ºC 5ºC tendrá un
desarrollo embrionario excesivamente lento (Dohle., 2009). En los cultivos de embriones
de pollo sin cáscara la temperatura ambiente ha mostrado buenos resultados en la súper-
vivencia del mismo hasta el día 13 (Schomann, 2013), lo cual favorece al presente trabajo
que tiene como propósito realizar la estandarización de los embriones de pollo sin cáscara
hasta la etapa HH19 (72 horas). La temperatura debe ser manejada de forma adecuada
por medio de la incubadora. Por último, la temperatura tiene efectos en la concentración
de glucosa en el plasma, lo que provoca cambios en la tasa de crecimiento, vale recalar
que esto ocurre cuándo hay un exposición a una temperatura mayor a 37.5ºC
(Christensen, 2001).

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Gases (PO2, PCO2):
El oxígeno es clave para la supervivencia de los seres vivos. En los cultivos de embriones
de pollo sin cáscara un ambiente rico en oxigeno (95%) y de dióxido de carbono (5%) es
utilizado para mantener la calidad de vida de los embriones, evitando la acidificación del
cultivo descrito por Chapman en 2001, usando papel filtro posteriormente puesto en
placas especiales de cultivo (Ho.,2010). La frecuencia cardiaca también se mantiene en
condiciones de normoxia (Romanoff.,1960). El porcentaje de oxígeno (21%) siempre es el
mismo, sin embargo su disponibilidad (cantidad de oxígeno que llega a los tejidos por
unidad de tiempo) varía según la altura (fluctúa presión atmosférica).
La escasez de oxígeno representa inconvenientes a medida que el embrión lo consume
como en el intercambio gaseoso, además de alterar funciones endocrinas, tienen una
importancia vital para un adecuado desarrollo embrionario durante la incubación (Li y col.,
2009). En condiciones de hipoxia disminuye en gran medida la tasa metabólica en el
embrión, además de la reparación celular y desarrollo tisular, esto induce a un trastorno
cardiovascular, lo que produce una hipertrofia cardiaca, afectando la supervivencia del
embrión (Visschedijk., 1980). En respuesta a la hipoxia el embrión genera una respuesta
de órganos secundarios para mantener a los órganos vitales (Zhang., 2012).

Ventilación:
Gracias a los poros de la cáscara del huevo, se mantiene equilibrado el intercambio
constante de oxígeno y dióxido de carbono, por lo tanto es importante mantener la
incubadora con los orificios de ventilación abiertos. El presenta trabajo cuenta con una
incubadora Betriebsanleitung APTlineTM (E2), que cuenta con un conducto de escape
con un diámetro de 50mm, 1.97 pulgadas con una palanca de ventilación ajustable
(Binder., 2004).

1.3 METODOLOGIAS DE CULTIVO DE EMBRIONES DE POLLO SIN CASCARA

Las técnicas de laboratorio para cultivo de embriones de pollo sin cáscara han sido
implementadas para una mejor observación y manipulación del embrión, con diferentes
objetivos como conocer la morfología del mismo, la expresión de genes y diversas células
al inyectar algún sustrato obteniendo resultados útiles para la medicina humana y
veterinaria (Tuan.s., 2000). Uno de los primeros cultivos ex– ovo, fue descrito por Denis

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New, consiste en la plantación del blastodermo a su propia membrana vitelina, esta a su
vez se extiende sobre un vidrio de reloj, para posteriormente hacer una reserva de
albumina debajo de la membrana y ponerlo en una caja de petri, cubrirla con agua y lana
de algodón, haciendo la función de una cámara húmeda mientras se inyecta solución
salina. Los resultados obtenidos fueron, una tasa de supervivencia del 93%, expansión
normal de el blastodermo, no se presentaron anormalidades anatómicas y alcanzaron a
desarrollarse hasta la formación de 30 somitas. La muerte se produce inevitablemente
cuándo se inicia la formación de las extremidades (New., 1955). A partir de este
experimento, varios científicos como Nicolet y Gallero, introdujeron modificaciones en
1963, al usar un doble anillo, para que la membrana vitelina se sujetara a estas
manteniendo una tensión normal.
En 1971 Jacob recomendó el uso de anillos exclusivamente de acero (Stern.,1997). sin
embargo, estas técnicas han tenido limitaciones, como por ejemplo, al tener contacto con
el blastodermo existe la posibilidad de una fuga lenta del vitelo lo que produce la muerte
del embrión. Vale recalcar que en las últimas décadas se han implantado técnicas
mejoradas en el cultivo de embriones de pollo sin cáscara en todo el mundo, por ejemplo
en la Universidad de Dharwad localizada en India, realizaron en el 2003 el método de
Nicolet y Gallero (1961), en un cultivo humidificado a 37.5ºC, donde el embrión llego
hasta la etapa HH14. Científicos de esta universidad aseguran que es un buen modelo
para estudiar operaciones quirúrgicas, tratamientos con teratógenos, factores de
crecimiento o efectos de radiación En esta universidad usan dos anillos disecados para
separar el área pelúcida de el área opaca, para posteriormente inyectar sacarosa con
detergente Nonidel NP- 40, lo que mancha las células, con el objetivo de ver los
promedios en los tiempos de duplicación en el área opaca y pelúcida.
En la Universidad de Bielefel, usan el método de la universidad de Cornell, el mismo que
guiará el presente trabajo, descrito más adelante. El objetivo de la investigación en
Bielefel fue realizar trasplantes de células madre adultas mediante la inyección de células
madre derivadas de la cresta neural, donde se demostró que la integración de las células
humanas permiten una investigación del potencial de diferenciación de las mismas. En la
Universidad de Duisburg-Essen, no se hizo un método exactamente ex ovo sin embargo
estudiaron la CAM realizando el corte de una ventana a través de la cáscara del huevo,
procedimiento que impone altas limitaciones al acceder al embrión, para su observación y
documentación fotográfica (Dohle., 2009). Existe un método implantado en 1995 conocido
como “Cornish Pasty”, donde explantan a los embriones de sus huevos y sus membranas

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vitelinas, posteriormente los pliegan a la mitad, con el endodermo “mirando” hacia
adentro, con unas tijeras se procede a cortar el margen entre el área opaca y pelúcida,
para sellar las dos mitades en forma de media luna, luego los embriones son puestos en
tubos que a su vez serán puestos en medios de cultivo con calfserum fetal (Stern.,1997).
Este método permite al embrión desarrollarse sin una membrana vitelina. En el 2010 se
usó con una serie de modificaciones, como agregar una mezcla de albumina y solución
Pannett Compton al cultivo en una caja de plástico en lugar de una botella de rodillo
(método original), se incubaron a 38.5ºC. Después de 24 horas los embriones presentaron
una forma de globo inflado, probablemente por el transporte de fluido activo originario de
del interior de endodermo y que sale por ectodermo (Stern.,1988), con este método el
95% de los embriones s desarrollaron normalmente (Nagai., 2010).

1.4 PLANTEAMIENTO

El proyecto que se va a realizar, como se dijo con anterioridad, se ha llevado a cabo

innumerables veces. La realización del cultivo de embriones de pollo sin cáscara se hará
debido a que hay una mejor observación del desarrollo embrionario, lo cual hace más
sencillo estudiar las etapas de Hamburger y Hamilton. La principal problemática es
mantener las condiciones óptimas para que el embrión cultivado sin cáscara logre
sobrevivir, y de esta forma realizar una observación directa de cada una de sus etapas de
desarrollo.

En la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Antonio Nariño no se han

llevado a cabo estudios en el cultivo de embriones de pollo sin cáscara, por lo tanto el
trabajo práctico que se va a realizar será de utilidad para las clases de anatomía como
material didáctico.

1.5 JUSTIFICACIÓN

Estandarizar el cultivo de embriones de pollo sin cáscara tiene una gran importancia, ya
que con éste procedimiento puede accederse fácilmente al embrión, para llevar a cabo los
estudios deseados, que generalmente se hacen para estudiar el desarrollo embrionario o
la angiogénesis y por supuesto, éstos estudios tienen múltiples objetivos que finalmente

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se cumplen para beneficiar a la especie en específico y lograr avances para la ciencia. Se
considera que el cultivo sin cáscara específicamente con embriones de pollo es una
técnica sencilla de realizar, vale recalcar que existen diversas técnicas que varían, por
ejemplo, en el uso de recipientes, temperaturas y materiales con los que se trabajarán.
Otra ventaja de realizar cultivo sin cáscara con embriones de pollo, es que éstos se
desarrollan de manera rápida, lo cual es favorable ya que se podrán obtener resultados
en un tiempo breve.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general:

 Estandarizar el cultivo de embriones de pollo sin cáscara

2.2 Objetivos específicos:

 Encontrar óptimas condiciones para el desarrollo del embrión ex ovo (temperatura,

recipientes, soluciones).
 Conocer las etapas de Hamburger y Hamilton, por la cuáles será guiado el
Proyecto.
 Aportar material didáctico para la clase de Anatomía y embriología
 Adquirir experiencia en técnicas de laboratorio.

3.METODOLOGIA, CULTIVO DE EMBRIONES DE POLLO SIN

CÁSCARA(Universidad de Cornell, 2010)
Materiales

 Incubadora
 huevos fértiles
 tijeras

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 pinzas
 cuentagotas
 Depósitos de agua y agua estéril
 cajas de petri
 modelos de embriones (etapas de Hamburger y Hamilton)
 Kimewipes húmedas (limpiadores desechables)
 etanol
 cartón especial para huevos
 Vasos de plástico
 placas de Petri

Procedimiento (ex -ovo protocolo, Universidad de Cornell, 2010)

 Almacenar huevos fertilizados a 13ºC 5 días antes de la incubación.

 Incubar huevos fertilizados (lado romo), 60% de humedad constante a 37ºC durante
72 horas.

Preparación de hamacas (estandarización)

 Se requieren aproximadamente 9 vasos de plástico con agua estéril tibia, lo común es

que los vasos tengan un diámetro de 8 cm, máximo.
 Cortar 20 cm de plástico (transparente) aproximadamente, fijar de forma
circunferencial en la parte superior del vaso, posteriormente ajustar una banda de
goma alrededor, el plástico debe hacer contacto con la superficie del agua.
 Limpiar el plástico con kimwipes humedecido con etanol al 70%.
 Retirar los huevos de la incubadora después de 72 horas de incubación.
 Esterilizar huevos, limpiando la superficie con etanol al 70% con kimwipes húmedas.
 Poner los huevos horizontalmente aproximadamente 2 minutos, para el
posicionamiento adecuado del embrión, puede hacerse con el cartón especial para
huevos.
 Usar un borde afilado (borde de una cubeta de metal, por ejemplo) toque el huevo
suavemente hasta que haya una pequeña abolladura en la parte inferior del huevo y
tirar las cáscaras horizontalmente.

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 Colocar la yema de huevo del embrión así como albúmina en la hamaca, la albúmina
proporciona un entorno de amortiguación alrededor de la yema, cuándo se hagan
transferencias de los vasos, además juega un papel importante en la nutrición del
embrión.
 El embrión debe estar puesto en la parte superior del mismo si la transferencia fue
realizada correctamente, de no ser así se debe usar un objeto estéril (punta de tijeras
con curvas cerradas, por ejemplo) y acariciar direccionalmente la yema de tal manera
que el embrión se gire a la cima.
 Poner una placa de petri de aproximadamente 10 cm en la parte superior de la
hamaca para sellar el embrión.
 Transferir a incubadora, ésta debe mantenerse a una temperatura de 37,5ºC,
posteriormente deben ponerse dos tazas llenas de agua destilada para mantener la
humedad al 60%.
 el cultivo de embriones se realizará hasta el día 7, por lo tanto, se deben usar piezas
de cáscara aplastadas que posteriormente serán esparcidas alrededor de la periferia
del embrión como fuente de calcio para un correcto desarrollo óseo y maduración.

4. CRONOGRAMA

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Mes Duración

Consecución de huevos
Junio-julio 72 horas/mes

Práctica de laboratorio,
Estandarización de
cultivo de embriones de Agosto 72 horas
pollo ex-ovo, en
incubadora del edificio de
morfofisiología,
Universidad Nacional de
Colombia

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 Realización de proyecto
escrito
Septiembre,octubre,noviembre 72 horas/mes
Resultados y conclusión

5. PRESUPUESTO

PRESUPUESTO
(costo de materiales/unidad)
Materiales Precio Total
Uso de incubadora de embriones de pollo $200.000 pesos m/cte, por día 600.000$
en el edificio de posgrados de la de utilización.
Universidad Nacional de Colombia.

Embriones de pollo c/u (1 día), 15 $8.000 c/u $120.000

unidades.

Cajas de Petri de vidrio c/u, 15 unidades $3.000 $45.000

Pinzas $3.000 $3.000

Tijeras $3.000 $3.000

Kimwipes húmedas $8.000 $8.000

Etanol (frasco) 2.000$ $2.000

Transportes c/u 1.400$ $8.400

Vasos plásticos(bolsa) 2.000$ $2.000

Plástico (rollo) 4.000$ $4.000

Total
$795.000

8. RESULTADOS ESPERADOS
Tras el desarrollo del proyecto de investigación se espera:

18
 Lograr el desarrollo embrionario hasta la etapa HH19, gracias a las condiciones
óptimas del ambiente (temperatura, oxígeno y humedad).
 Asimismo aportar material didáctico para la clase de Anatomía y embriología
 Tener habilidades para trabajar en laboratorio.
 Tener experiencia en la estandarización del cultivo de embriones sin cáscara, para
futuros estudios en Biología del desarrollo.

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