MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

ELDER CAMPILLO LÓPEZ

RUGERO CÁRDENAS SÁEZ
TATIANA DÍAZ CHALARCA

CINDY BUSTAMANTE

LAB. ANÁLISIS DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
INGENIERÍA DE ALIMENTOS
SEDE-BERASTEGUI
2019
 INTRODUCCIÓN

Las proteínas son materiales que se desempeñan el mayor número de las funciones de las células de
todos los seres vivos. Forman parte de su estructura básica de los tejidos y desempeñan funciones
metabólicas y reguladoras también son seres vivos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que
son la base de la estructura del código genético ADN y de los sistemas de reconocimiento de
organismos extraños en el sistema inmunológico. Las proteínas son biomoléculas formadas por
cadenas lineales de aminoácidos. Por sus propiedades físico-químicas, las proteínas se pueden
clasificar en proteínas simples (holoproteidos), que por hidrólisis dan solo aminoácidos o sus
derivados; proteínas conjugadas (heteroproteidos), que por hidrólisis dan aminoácidos acompañados
de sustancias diversas, y proteínas derivadas, sustancias formadas por desnaturalización y
desdoblamiento de las anteriores. Las proteínas son indispensables para la vida, sobre todo por su
función plástica (constituyen el 80% del protoplasma deshidratado de toda célula), pero también por
sus funciones biorreguladora (forma parte de las enzimas) y de defensa (los anticuerpos son
proteínas) (thryr, 2002).

La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados con
proteínas en una multitud de temas de investigación. Se han desarrollado diferentes métodos para
cuantificar proteínas totales, o alguna en particular. Los métodos de cuantificación de proteínas
totales incluyen métodos tradicionales tales como la medición de la absorbancia a 280 nm, los
ensayos de Bradford y el ácido bicinconínico, así como métodos alternativos como el de Lowry o
novedosos ensayos desarrollados por los proveedores comerciales. Notmalmente, los proveedores
comerciales venden kits bien diseñados y prácticos para cada tipo de ensayo (Romero, 2004)
 MÉTODOS QUÍMICOS
Fundamento Las proteínas presentan un amplio rango de comportamiento químico debido a la
propiedad de los aminoácidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a las reacciones
químicas de estos grupos y a los enlaces peptídicos. Consideraciones en la aplicación de los
métodos químicos:
Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos métodos empíricos e
indirectos sean calibrados con el método de Kjeldahl;
Se espera una buena correlación entre estos dos tipos de determinación de proteína cuando la
relación N no proteico/N proteico es baja y constante;
Son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayoría de los vegetales y mezclas
de alimentos.
Método de Biuret
La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son complejados
por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo de proteína y su
intensidad depende del contenido de proteína presente.
Es un método más rápido y menos engorroso que el de Lowry. La reacción debe su nombre al
Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CONH2), que es la más
sencilla que da positiva la reacción. Bajo condiciones alcalinas, sustancias conteniendo dos o más
uniones peptídicas forman un complejo púrpura con sales de cobre. Tiene muy pocos agentes
interferentes (uno de ellos es el sulfato de amonio). Es un método menos sensible que el de Lowry
por lo que requiere mayor cantidad de muestra.
Lectura: 550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
Desventaja: Se ha encontrado poca aplicación en análisis de alimentos debido a la presencia de
interferentes como azúcares reductores que reducen el ion cúprico en medio alcalino produciendo
resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.
Método de Lowry
Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína, ésta se reduce a un complejo azul de molibdeno
por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisterna e histidina.
Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas
formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-
proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura
tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar
en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su
complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau,
por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas,
actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de FolinCiocalteau es el
ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da
lugar a un complejo de color azul intenso (berg, 2003).
Lectura: 750 nm
Ventajas Alta sensibilidad y simple de operar.
Desventajas: La respuesta del color varía de acuerdo al tipo de proteína. La intensidad del color no
es estrictamente proporcional a la concentración de proteína. Los iones potasio, magnesio, EDTA e
hidratos de carbono interfieren en la reacción.
Método "dye-binding"
Principio químico: Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína coloreado e insoluble
producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2. El
anióncoloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por
ejemplo a los grupos Mamino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos
terminales. Además se producen atracciones intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre
la proteína y la mitad no iónica del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del
anión en solución. El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de
tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de proteina.
Lectura A 595 nm
Consideraciones: El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal
que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad.
Ventajas: Util en análisis de rutina de muestras similares. Económico y rápido. Preciso como el
método de Kjeldhal. Usado como método de referencia.
Método de Bradford
Método por unión de colorantes En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las
proteínas pueden interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a
precipitados con un color característico. Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante
Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-
naranja) a una de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan
con los grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también
existe una relación lineal dentro de determinadas concentraciones de proteínas (peña, 2004).
Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras problemas preparadas. Dejar a
temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora
Ventajas: muy sensible
Desventaja: Muestra interferencias con detergentes
Método de titulación con formol
Fundamento: A la muestra neutralizada con álcali se le agrega formaldehido en exceso el cual
reacciona con cada grupo básico de lisina y arginina. El exceso de formaldehido se neutraliza con
un exceso de álcali estándar el cual se titula, y se relaciona con el contenido de proteína.
Desventaja: Su reproducibilidad es menor a la de otros métodos alternativos.
Método de BCA
El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso
con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de
monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio
alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método
para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran
tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.
Añadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estándar y muestras problemas preparadas.
Incubar 10 min a 60 ºC y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco.
Ventajas: Es un método sensible. Es el que muestra menos interferencias
Método de destilación alcalina
Fundamento: La hidrólisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amoníaco el cual es
destilado y su valor es relacionado con el contenido de proteína. Se ha encontrado que el
rendimiento de amonio es altamente reproducible para una proteína dada.
MÉTODOS FÍSICOS
Consideraciones Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de los
equipos es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las características del material a
analizar. La concordancia con nitrógeno total depende de que el material no varíe de muestra en
muestra. a) Espectroscopia infrarroja Fundamento Se aprovecha la absorción del grupo amida del
enlace peptídico a 6,46 Tm.
Ventajas Rápido: análisis de multicomponentes No destructivo.
Desventajas: Interferido por agua. Proceso de calibración complejo.
Espectroscopia infrarroja reflectante
Fundamento: La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja
(0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada. Consideración Es necesaria la calibración contra un
conjunto de muestras estadísticamente significativas, analizadas por métodos de referencia
tradicionales.
Ventajas Rápido, análisis de multicomponentes. Aplicable a materiales sólidos. Cuantifica proteína
en presencia de agua.
Desventajas Interfieren almidones y lípidos. Desplazamiento de espectro de reflectancia por
humedad contenida en las partículas. Proceso de calibración complejo.
Espectrofotometría UV
Fundamento Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos
aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.
a) Absorbancia a 280 nm La mayor parte de las proteínas poseen un pico de absorción máxima a
280 nm. Los grupos responsables de tal característica son los aminoácidos aromáticos (Tirosina y
Triptofano). Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede variar de
acuerdo a su composición aminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se puede considerar que
una unidad de absorbancia se corresponde con una concentración (C) de 1mg/ml de proteinas:
Abs280nm* E280nm = C, si E280nm se considera = 1 Abs280nm ≡ 1 mg/ml Si la solución de proteínas
contiene DNA y/o RNA se introduce un error en la medición, dado que estos absorben a 280 nm.
b) Absorbancia a 205-210 nm A dicha longitud de onda absorbe la unión peptídica, por lo tanto es
un método más sensible y no dependiente de los aminoácidos que componen la proteína en estudio.
La limitación de esta técnica esta dada porque la mayoría de los buffers utilizados también absorben
a esa longitud de onda.
Ventaja: Rápido, no destructivo. Util para monitorear eluentes en columnas cromatográficas.
Desventaja Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).
Métodos refractométricos
Fundamento: Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice de
rafracción causado por la remoción de la proteína de la solución.
Método turbidimétrico
Fundamento: Mide la reducción de la intensidad de la luz al pasar por una suspensión de partículas
de proteínas. Este cambio se relaciona con el contenido de proteína.
Espectroscopia electrónica
Fundamento: Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones liberados
característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína.

Conclusión
Es importante determinar las proteínas en alimentos porque esté es un macronutriente, que es muy
fundamental para el organismo humano, manejando funciones enzimáticas funcionales y
hormonales.
Las proteínas están constituidas por aminoácidos por los cuales los métodos se basan en el
reconocimiento de los aminoácidos
 BIBLIOGRAFÍA

 berg, j. (2003). metodos de proteinas . quito : acribia .

 peña, a. (2004). bioquimica analitica . mexico : acribia .

 Romero, N. (2004). METODOS DE ANALISIS DE DETERMINACION. 165-170.

 thryr, l. (2002). bioquimica . mexico : acribia .