UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA.

UNAN-LEÓN
Escuela de Medicina Veterinaria.
Medicina Veterinaria.

Componente: Técnicas de Diagnóstico Inmunológico.

Docente: Dr. Felipe Nery González

Elaborado por:
Juan Francisco Alvarado R.

Miércoles 27 de mayo del 2015

 1-TÉCNICA SEROLÓGICA: ELISA
1.1-Fundamentos y Tipos de Elisa.
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al
estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (Inmuno-adsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Existen diferentes tipos de ELISA, los cuales se enumeran a continuación:
Anticuerpos Marcados: Antígeno Marcado:
a) ELISA Directo. A) ELISA Competitivo
b) ELISA Indirecto.
c) ELISA Sándwich.
d) Doble (DAS)
e) Heterólogo (HADAS)

1.2-ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:

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  Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para
eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
 Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
 Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
 Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

1.3- ELISA Indirecto.

Consta de las siguientes etapas:
 Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto
de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no
fijados.
 Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
 Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran
fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no
hayan reaccionado.
 Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
 Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

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1.4- Pasos Generales de un ELISA.
1-Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2-Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3-Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el
pocillo.
4-Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido.
5-Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima.
6-Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo.
7-Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida.
8-Adición del sustrato.
9-Unión del substrato a la enzima.
10-Desarrollo del color.

1.5- ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).

Consta de las siguientes etapas:
 Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no
fijados.
 Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de
tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),
reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no
fijados.

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  Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados
con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra
problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
 Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
 Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

1.6- ELISA Sándwich “HADAS”.

Consta de las siguientes etapas:
 Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
 Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
 Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales
reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan
reaccionado.
 Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en
el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
 Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
 Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

1.7- ELISA Competitivo.

Consta de las siguientes etapas:

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 Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo
utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos
objeto de estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado
en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que
no hayan reaccionado.
Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el antígeno
a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el
soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de
estudio, está relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar
el soporte y la diferencia de densidad óptica, es proporcional a la concentración del
antígeno problema en la muestra.
Todos los tipos de ELISA descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
1. ELISA para detectar antígenos: ELISA sándwich.
2. ELISA para detectar anticuerpos: ELISA indirecto.
La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácil manejo (especialmente en los
procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos o anticuerpos sobre su
superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350µL son especialmente
ventajosas para procesar un elevado número de muestras y una vez tapizadas, el material
inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja
temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que
pueden adquirirse estériles y con o sin tapa.

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 Microplacas de poliestireno de 96 pocillos.

Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos
necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse
manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatización de todas y cada
una de las etapas. Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y
analizar un gran número de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados.

Lavador de placas de 96 pocillos. Lector de placas de 96 pocillos.

1.8- Adsorción de antígenos y anticuerpos (“tapizado”).

Los métodos empleados son dos fundamentalmente:
 Dilución del antígeno o anticuerpo en tampón carbonato (pH 9,6) e incubación
posterior durante 3h a 37°C o 16h a 4°C.
 Tratamiento a 40-50°C en tampón fosfato (PBS) o en agua fisiológica tamponada
pH 7,2-7,4 hasta desecación.
Solución de lavado.
Solución salina con Tween 20 como agente tensioactivo:
ClNa.................................. 8,5gr
Tween……………………...0,5Ml
Agua destilada………........1000mL

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1.9- Conjugados.
La enzima escogida como marcador debe unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogénico o
fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa
alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa; a continuación se muestra una tabla
con las ventajas y desventajas de cada una así como los substratos que se emplean con cada
una de ellas.
Las operaciones de marcado o conjugación, llevan implícitas dos etapas:
1. Purificación de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una
precipitación generalmente salina de las proteínas del antisuero, seguida de una
diálisis y purificación de la fracción de anticuerpos mediante filtración molecular,
cromatografía o separación en gradiente de densidad mediante ultracentrifugación.
Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis
de 1mg/mL.
2. Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que
normalmente suele ser el glutaraldehído o el del m-periodato sódico (apenas existen
diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales)
Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la
detección de IgGs y es la utilización de proteína A o G marcadas con peroxidasa.

Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su
utilización; esta conservación se suele realizar mediante liofilización, congelación a –70°C
o filtrado estéril y conservación a -20°C mezclado con igual volumen de glicerol
bidestilado estéril.
La búsqueda de la concentración óptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA
empleado; para cualquier ELISA que utilice anti anticuerpos conjugados, se suele probar
diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas
diluciones de antisuero en placas tapizadas con antígeno a concentración idónea. Aquella
dilución del conjugado que produzca menor reacción inespecífica (menor color de fondo o
“background”) con muestras negativas e implique una clara distinción de las muestras

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positivas, será la óptima. La elección de una concentración de conjugado óptima va
completamente ligada a planteamientos económicos en los que se ha de procurar el mayor
ahorro del conjugado aún a costa de aumentar el tapizado.
La elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA
y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad,
repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparación, así como estabilidad
después de la parada de la reacción.
Hoy en día existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y, por lo tanto, el método
de detección de los complejos antígeno-anticuerpo y así tenemos sistemas de detección
colorimétricos, fluorescentes y luminiscentes que a continuación pasamos a desarrollar:

• Colorimetría. Los ensayos colorimétricos dan un producto de reacción coloreado que

absorbe luz en el espectro visible, siendo la densidad óptica (DO) del mismo proporcional a
la cantidad de producto medido.
Para todos los ensayos enzimáticos, la etapa final es la adición del substrato enzimático, el
cual da lugar a productos de reacción soluble o insoluble y es elegido por su rendimiento
cuantitativo de producto de reacción. Para ensayos colorimétricos, la tasa de desarrollo de
color es proporcional, dentro de un cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimático
presente.

Tanto la peroxidasa como la fosfatasa alcalina, tienen substratos que dan productos de
reacción coloreados solubles. La decisión de qué substrato es el mejor para cada tipo de
ensayo, depende de la sensibilidad deseada, los requerimientos de tiempo y el sistema de
detección que se vaya a utilizar. Para ensayos que necesitan ser muy sensibles, el substrato
ideal debe producir color intenso con una tasa de reacción muy rápida; sin embargo, para
ensayos que requieren un rango dinámico amplio, son deseables substratos que den
producto de reacción en un período de tiempo largo (15-30 minutos) y den un rango de
intensidad de color amplio, dependiendo de la cantidad de muestra presente. Para ensayos
que se vayan a parar (se vaya a añadir a la reacción, tras una cantidad de tiempo definido,
un inhibidor químico que pare el desarrollo de color y permita la detección dentro de un
período razonable de tiempo), es necesario la utilización de un substrato que tenga una tasa

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de reacción “lenta” (15-30 minutos hasta su finalización); sin embargo, cuando se vayan a
realizar ensayos cinéticos de la reacción, debería usarse un substrato que tenga una tasa de
reacción “rápida” (5 minutos o menos).

Aunque muchos son los factores que afectan la medida de la actividad enzimática
(temperatura, pH, fuerza iónica, composición del tampón, reducción del substrato,
formación de productos inhibidores, feed-back por formación del producto final,
desnaturalización de la enzima y, en algunos casos, exposición a la luz), los que más
afectan al ensayo, hoy en día, son el tiempo de reacción, la temperatura y la exposición a
la luz.
Antes de leer la DO y/o tras la adición de la solución de parada, es importante mezclar
completamente el contenido de los pocillos para asegurar el cese por completo de la
reacción (ensayos de punto final solamente) y la total dispersión del producto de color. La
precisión del ensayo puede ser drásticamente mejorada añadiendo este simple paso al
protocolo. El efecto físico que la agitación de la placa antes de la lectura tiene en la DO
resultante es muy importante. Los colorímetros de microplaca solamente leen el centro
exacto del pocillo, lo cual implica que una placa no agitada tendrá pocillos que se
asemejarán más al formato “A” de la figura, ya que, debido a que la disolución del
producto de la reacción es lenta, si no es mecánicamente agitada o mezclada, el producto
coloreado de la reacción estará concentrado en la superficie del pocillo (donde la enzima
está localizada) y el lector no estará midiendo la verdadera DO del pocillo. Cuando sí se

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 mezcla, el producto coloreado es completamente homogeneizado en el pocillo
(formato “B” de la figura), y el lector detectará la verdadera DO del pocillo.
Hay varias formas de realizar esta mezcla: hay agitadores de microplaca para 2-4 placas a
la vez, de tal manera que esas placas puedan ser agitadas en grupo antes de ser
introducidas en el lector; hoy día, muchos, si no la mayoría, de los lectores de microplaca
llevan incorporados agitadores que permitan que las placas sean homogeneizadas justo
antes de ser leídas. Ambos métodos (agitadores internos o externos), cuando son usados
correctamente, pueden tener efectos positivos en la precisión del ensayo.
• Fluorescencia. Los inmunoensayos de fluorescencia (ELFIA) son una simple variación
de los colorimétricos; la enzima convierte el substrato en un producto de reacción que
emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda, siendo las
unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad
de producto analizado.
En comparación con los métodos colorimétricos, los ensayos de fluorescencia son
ligeramente más sensibles y, lo que es más importante, amplían el rango de medida, en
oposición al límite de 2,0-4,0 DO impuesto en los ensayos colorimétricos.
Un substrato fluorogénico es elegido por la cantidad de luz emitida tras su excitación, la
cual debería ser proporcional a la cantidad de conjugado enzimático presente. El substrato
debería ser estable a temperatura ambiente y en presencia de luz. Asimismo, el producto
de la reacción enzima-substrato debería tener distintas longitudes de onda de emisión y de
excitación, ya que el substrato, por si mismo, no debería ser fluorescente.
Los ensayos fluorimétricos están sujetos a distintos problemas que reducen o aumentan la
señal inespecíficamente. La detección por fluorescencia es susceptible a cambios en el
pH, temperatura, concentración iónica, concentración de detergente, secado, y a la matriz
sólida, lo cual puede conducir a distorsión de luz, un elevado background, y fenómenos de
“apagamiento” y/o “blanqueamiento”. El fenómeno de “light scattering” (dispersión de
luz) está ocasionado porque la luz emitida rebota cuando entra en contacto con moléculas,
partículas en suspensión o la superficie de la microplaca. Por esta razón, es importante
eliminar las burbujas que se puedan formar en los pocillos y utilizar reactivos químicos de
elevado grado de pureza. Las placas negras opacas y las tiras de la más alta calidad están

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diseñadas para reducir esta dispersión de luz, ya que absorben la luz que rebota en la
superficie del pocillo y solamente se mide la luz dirigida hacia el detector.
El “background” (fluorescencia de fondo) y/o la autofluorescencia son el principal
problema para la realización de ensayos en placas de 96 pocillos. Las fuentes de este
background son los propios componentes de la muestra (hemoglobina, bilirrubina,
partículas de celulosa, drogas), los componentes de los diluyentes (iones metálicos), el
material de la placa (tipo de plástico utilizado) y la contaminación variable (partículas de
polvo, huellas digitales). El background puede ser eliminado de tres formas: mediante el
diseño del ensayo (dilución de la muestra para ensayos homogéneos y filtrado de los
reactivos a través de una membrana de 0,45µm para ensayos heterogéneos), mediante la
instrumentación y mediante una estricta limpieza. El fenómeno de “apagamiento”
(“quenching”) se caracteriza por una reducción inespecífica de la señal y es causado por
la absorción de la emisión por el oxígeno disuelto, por lo que los reactivos pueden ser
desgasificados antes de su utilización para eliminar este efecto. El fenómeno de
“blanqueamiento” (“bleaching”) o “decoloración” (“fading”) está también caracterizado
por una reducción en la señal, pero está causado por un exceso en el tiempo de excitación.
Actualmente, no suele ser un problema debido a la baja energía y corto tiempo de
excitación de los fluorímetros actuales.
Otras interferencias que pueden distorsionar las lecturas de fluorescencia incluyen las
variaciones de temperatura, la estabilidad de la fuente de luz y el ancho de la banda de
excitación. La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura, por lo que es
importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos, ya que,
pequeñas variaciones de un ensayo a otro, pueden ocasionar cambios en la sensibilidad
del mismo.
Muchos de los plásticos usados para fabricar placas y tiras son autofluorescentes; por ello,
es importante elegir una placa que esté fabricada específicamente para fluorescencia.
Estas placas normalmente son negras (aunque las blancas pueden ser usadas para
compuestos fluorescentes que emitan luz a longitudes de onda más altas), ya que se
reduce significativamente el background (no son autofluorescentes y absorben la luz
dispersada) y se eliminan, prácticamente, las contaminaciones cruzadas. Estas placas
negras pueden tener fondo opaco o transparente. Las de fondo transparente se utilizan

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 normalmente para ensayos fluorescentes basados en células, lo cual permite su
visualización durante el crecimiento de las mismas, al mismo tiempo que reducen la
transmisión de luz lateral o la contaminación cruzada durante la detección. Con la llegada
de los fluorímetros para placas de 96 pocillos, que son capaces de efectuar lecturas desde
el fondo o desde la parte superior del pocillo, estas placas han permitido aumentar la
versatilidad asociada con el diseño del experimento, p.e., usando una placa de fondo
transparente, se puede realizar un ensayo doble en el que se utilice un anticuerpo marcado
con peroxidasa (detectado colorimétricamente con TMB) para la primera parte del
ensayo, y otro anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (detectado fluorimétricamente
con 4-MUP) para la segunda parte.
• Luminiscencia. Al igual que la fluorescencia, la luminiscencia es una variación del
método estándar de ELISA. Una enzima transforma un substrato en un producto que emite
fotones en lugar de dar color visible. La luminiscencia se describe como la emisión de luz
por parte de una sustancia, que regresa desde un estado electrónicamente excitado a su
estado original. Las diferentes formas de luminiscencia difieren, precisamente, en la forma
en que se alcanza dicho estado excitado:
 Fotoluminiscencia: la excitación se alcanza mediante luz de una determinada longitud
de onda, es decir, igual que en la fluorescencia.
 Bioluminiscencia: la excitación se alcanza mediante la utilización de un compuesto que
emite luz al ser degradado, por ejemplo, luciferina o luciferasa.
 Quimioluminiscencia: la excitación se alcanza mediante una reacción química.
Actualmente, es el método disponible más sensible debido a la posibilidad de
multiplicación y amplificación de la señal. Las reacciones de luminiscencia se miden en
RLU (Unidades Relativas de Luz), que son típicamente proporcionales a la cantidad de
muestra presente.
El substrato luminiscente debe ser estable a temperatura ambiente durante todo el período
que dure el ensayo, y debe ser elegido por su baja luminiscencia de fondo en estado basal
(“background”), por su capacidad para producir luz intensa en estado activado, por su
capacidad de emitir luz estable durante un período prolongado de tiempo (minutos) y por
su disponibilidad comercial (calidad y consistencia).
Existen dos métodos de detección de luminiscencia:

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 FLASH: es inestable en la Naturaleza y alcanza una intensidad máxima de luz en
segundos o milisegundos, por lo que es necesario comenzar la reacción mientras los
reactantes están frente al sistema de detección (fotomultiplicador). Es de capital
importancia que el intervalo de tiempo transcurrido entre la adición de los reactivos y el
proceso de detección sea siempre constante.
 GLOW: consiste en una serie de estados transitorios secuenciales que originan una
señal constante. La luz emitida, a diferencia del color o la fluorescencia, no se acumula,
por lo que la ésta debe ser intensa y la reacción enzimática prolongada para obtener
suficiente señal.
Los aspectos positivos de este tipo de luminiscencia son: la reacción puede ser iniciada
fuera del aparato de detección, por lo que se elimina la necesidad de dispensación interna
y mezcla dentro del propio lector, la simplicidad del procedimiento, la elevada
sensibilidad, la posibilidad de incrementar la señal y que el procedimiento es muy
adecuado para sistemas de placas de 96 pocillos. Además, este tipo de reacción
luminiscente puede ser medido usando un luminómetro, capturando la imagen en una
película fotográfica o mediante sistemas de análisis de imagen.
Aunque en teoría estas reacciones son estables durante al menos 20 minutos, los
resultados entre pocillos y entre diferentes placas son más homogéneos cuando el tiempo
de incubación enzima-substrato es corto (se recomienda efectuar un período de
estabilización de 2 minutos tras la adición del substrato y entonces leer inmediatamente
las placas).
Elegir la mejor placa para luminiscencia es crucial para desarrollar un ensayo fiable, y
ésta ha de estar diseñada específicamente para luminiscencia. Habitualmente son blancas
y opacas, con el fondo transparente u opaco; ambas versiones están diseñadas para reducir
contaminación cruzada y el background ocasionado por la composición de la resina
blanca. Las placas con fondo transparente se utilizan habitualmente para ensayos
luminiscentes basados en células, tales como ensayos de proliferación celular, ya que
permiten la visualización de las células durante su crecimiento y también previenen de la
transferencia lateral de luz entre pocillos durante el paso de detección. También son útiles
para ensayos dobles con un producto colorimétrico para un primer análisis y otro
luminiscente para un segundo.

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 Finalmente, se debe optimizar el tiempo de incubación, realizándose lecturas seriadas
hasta encontrar el óptimo, que será aquel en el que se encuentre mayor diferencia de color
entre positivos y negativos de referencia. Las reacciones enzimáticas colorimétricas
siguen curvas del tipo del que se muestra en la gráfica para muestras positivas y
negativas, por lo que existe un tiempo de lectura para el cual la diferencia colorimétrica
entre muestras positivas y negativas es máximo.

1.10- Lectura e interpretación de los resultados.

La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimétricamente. A
simple vista, pueden ser leídos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una
cuantificación y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de
discernir una variación de 0,1 de densidad óptica) ya que dicha lectura visual tendrá el
inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos límite. No
obstante, evita la adquisición de aparatos relativamente costosos como son los lectores de
microplacas.
Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura
y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatización se puede conseguir con un simple
colorímetro o espectrofotómetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática
de microplacas.
Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante
valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más
adecuada para la coloración final alcanzada. Aplicaciones del ELISA.

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 2-PRUEBA SEROLÓGICA:
AGLUTINACIÓN PARA
SALMONELLA POLLORUM

2.1- Introducción
El termino Salmonelosis se emplea para describir la infección causada por
microorganismos del genero Salmonella. En la actualidad se reconoce la existencia de más
de 1100 diferentes serotipos dentro de este género; solamente algunos de ellos son capaces
de producir enfermedad en los animales domésticos y el hombre. Se sabe que estos
organismo poseen una marcada especificidad de huésped, por ejemplo: S typhi solo afecta
a el hombre: S. cholera suis afecta solo a porcinos; S. pullorum y S. gallinarum producen
enfermedades principalmente en las aves, particularmente a pollos y gallinas; la s. diblin
infecta principalmente a bovinos, mientras que S. ovis y S. abortus equi son infecciones
para ovinos y equinos respectivamente. En contraste S. typhimurium carece de
especificidad, encontrándose frecuentemente asociada con enfermedad en diversos
huéspedes. Las infecciones por otros serotipos suelen reducirse a ciertas regiones, o durante
determinadas épocas, por lo general son esporádicas, ocurriendo en casos individuales, sin
producir enfermedades severas.
La salmonelosis aviar es una enfermedad altamente contagiosa que provoca pérdidas
económicas importantes por una disminución en la producción de huevo, baja incubabilidad
del mismo, así como gastos en tratamientos. Causada por las bacterias Salmonella
gallinarum (tifoidea aviar) y Salmonella pullorum (pullorosis). Afecta aves de cualquier
edad, especialmente a pollas de 3 meses su período de incubación es de 4 a 6 días y
presenta una mortalidad variable de 4 al 50%.
Las aves progenitoras y reproductoras juegan un papel muy importante en la erradicación
de la enfermedad, principalmente afecta a gallinas domésticas y pavos, aunque también
puede llegar a afectar a patos, faisanes, pavo reales, gallina de guinea y aves silvestres.

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Es un germen Gram negativo, no posee flagelos, aerobio y anaerobio facultativo, puede
aislarse de la sangre, hígado y bazo de aves infectadas. Este germen produce colonias lisas,
brillantes opalescentes y de bordes continuos en cultivos de agar. Su temperatura óptima
para crecimiento es de 37grados centígrados con un PH de 7.
2.2-Pullorosis
Esta enfermedad es causada por la S. pullorum, la cual puede diferenciarse de los otros
miembros del género con base en sus características del cultivo. Esta bacteria en
antigénicamente similar a S. gallinarum causante es la tifoidea aviar. La pullorosis fue la
primera enfermedad en la que se estudió el ciclo de infección a través del huevo. Las aves
que sobreviven en un brote se convierten en portadora, localizándose la bacteria en varios
órganos, pero especialmente en ovario, de esta forma los huevos están infectados desde
antes de la postura.
En las incubadoras la infecciones se difunde rápidamente ya sea por contacto directo o por
la inhalación de deyecciones, los nuevos lotes son infectados rápidamente en la misma
incubadora si estas no se desinfectan en forma correcta, le resto del equipo es también
importante durante la trasmisión. Los pollitos son más susceptibles durante las primeras
semanas de edad, infectándose fácilmente el ingerir agua o alimentos contaminados. La
contaminación por las manos y ropa de los sexadores es frecuente.
2.2.1-Manifestaciones clínicas: en pollitos la enfermedad es de curso agudo con
porcentaje de mortalidad superiores al 40%. Los animales que se infectan in ovo suelen
morir 48 horas después de salir del cascaron; en este caso la mortalidad es elevada y no hay
muchos signos clínicos ni lesiones.
En contraste, los pollitos que se infectan en los criaderos mueren entre el séptimo y le
vigésimo día; la mortalidad es baja y las manifestaciones clínicas son más marcadas. Se
puede observar inapetencia, debilidad, alas caídas, plumas erizadas. Puede hacer diarrea de
aspecto blanquecino.
A la necropsia puede identificarse congestión hepática y pulmonar produciendo áreas
necróticas de color blanco grisáceo.
La forma crónica de la pullorosis ocurre en pollos más grande. En este caso el promedio de
mortalidad es bajo, es común observar aves con cojeras, acompañadas de artritis. Las aves
presentan retraso de crecimiento y el plumaje es escaso y opaco.

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En aves adultas rara vez ocurre brotes agudos o subaguda sin embargo, es común la
infección crónica. Los animales crónicamente infectados presentan aspecto físico poco
sugestivo de enfermedad, pero la producción de huevos puede ser del 10 al 20 % inferior
que en las aves sanas. Además la fertilidad y la encubabilidad del huevo se encuentran
también notoriamente reducidos. Al practicarse la necropsia de estas aves es
frecuentemente observar que un número variables de óvulos están afectados, conteniendo
un material sanguinolento y con un aspecto caseoso, ocasionalmente se produce peritonitis
crónica.

2.3- Aglutinación rápida en placa

Es una prueba serológica en la que se utiliza un
antígeno denominado K Polivalente y se considera una
prueba complementaria al aislamiento. La
interpretación de esta prueba se da positiva, si la
aglutinación es suave o fuerte entre los cero y noventa
segundos, después de realizar la mezcla sangre-
antígeno. La interpretación es negativa, si la
aglutinación aparece después de 120 segundos después de realizar la mezcla sangre-
antígeno. La interpretación será sospechosa si la aglutinación ocurre entre los 90 y 120
segundos después de haber realizado la mezcla sangre-antígeno.

2.3.1-Descripcion de la prueba: Para efectuar la prueba se utiliza sangre completa en el

caso de pollos y gallinas, y únicamente suero en el caso de pavos.
La prueba debe ser efectuada a una temperatura ambiente de 21 a 27°C. Antes de realizar la
prueba, retire del refrigerador el antígeno y suero problema, dejándolos durante 10 minutos
a temperatura ambiente.
Agite el antígeno antes de usarlo. Deposite 0.05 ml del antígeno en la placa y agregue
0.02 ml de sangre o suero del ave. Mezcle el antígeno y la sangre o suero con un asa limpia
y estéril, formando un área líquida de sangre y antígeno de un diámetro de 2.5 cm.
Es importante que la proporción de las cantidades de sangre o suero y antígeno sea correcta.

17
Una vez efectuada la mezcla, agite la placa con movimientos rotatorios, dejándola reposar
eventualmente para observar la reacción de
aglutinación.
Lea los resultados de las pruebas en un máximo
de 2 minutos. Después de 2 minutos pueden
presentarse reacciones falsas positivas. Una
reacción positiva se presenta con pequeños
grumos de color.
Esto se podrá observar más claramente cuando
se disponga de una fuente de luz bajo la placa de
aglutinación.
Antes de usar el antígeno debe comprobarse su eficacia exponiéndolo a sueros sanguíneos
positivo y negativo a la presencia de anticuerpos contra S. pullorum.
2.3.2- Instrucciones:
 La prueba debe realizarse con sangre completa o suero de pollo o gallina y
únicamente con suero de pavo.
 El suero problema no debe provenir de una muestra de sangre hemolisada.
Consérvelo en refrigeración hasta antes de usarlo. Una vez realizadas las pruebas,
vuelva a refrigerar el antígeno.
 Utilice el suero y antígeno a una temperatura de 21 a 27°C.
 Utilice siempre el gotero para tomar el antígeno y evite la contaminación de éste.
 Para mayor seguridad, no efectúe más de 25 pruebas simultáneamente.
 Conserve el antígeno siempre en refrigeración entre 2 y 4°C.
 Evite la congelación.
 Antes de realizar las pruebas de AP, deposite sobre la placa una gota de antígeno y
observe si se presenta aglutinación espontánea.
 Pueden presentarse reacciones falsas positivas cuando el antígeno se encuentre en
malas condiciones o cuando haya sido congelado durante su conservación.
 Asimismo, pueden presentarse aglutinaciones inespecíficas con la sangre de aves a
las que se haya administrado varias dosis de productos inactivados o de aves
severamente infectadas con colibacilos o bacterias gramnegativas.

18
 2.4- Prueba rápida de Aglutinación de suero
La RST se lleva a cabo de la misma manera con la excepción de sustituir la sangre
entera por suero. Para pruebas con fines de exportación, la aproximación óptima
consiste en realizar un muestreo inicial de los sueros mediante una RST con la posterior
confirmación de los resultados positivos mediante una prueba de aglutinación en tubo.
Lo ideal es que las muestras de suero que se vayan a probar siguiendo cualquier método
se analicen dentro de las 72 horas de la recogida, ya que en las muestras más viejas
pueden aumentar las reacciones inespecíficas. Pueden congelarse muestras frescas si la
postergación es inevitable.
2.5- Prueba de Aglutinación en tubo
El suero fresco procedente de pollos, pavos u otras aves se utiliza a una dilución inicial
de 1/25, obtenida mezclando 0,04 ml de suero con 1,0 ml de antígeno2. En cada prueba
se incluyen sueros control positivo y negativo. El antígeno se prepara a partir de
cultivos no teñidos de S. Pullorum o S. Gallinarum diluidos hasta una concentración de
No. 1 según la escala de McFarland (como se ha descrito más arriba). La mezcla se
incuba a 50°C durante 18–24 horas antes de la lectura. Se considera una reacción
positiva cuando se observa un depósito blanco granular y un sobrenadante claro; una
reacción negativa muestra una turbidez uniforme. Las muestras positivas a una dilución
de 1/25 se prueban de nuevo en un rango superior de diluciones y un título de 1/50 se
considera normalmente positivo aunque este valor parece que varía en la literatura
2.6- Prueba de Microaglutinación
Esta prueba es parecida a la prueba de aglutinación en tubo pero requiere volúmenes de
reactivos mucho menores. La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulación.
Primero se diluyen los sueros adicionando a cada 10μl de suero 90 μl de solución salina
normal y a continuación se añaden 100 μl del antígeno teñido estandarizado
previamente hasta conseguir una dilución final de 1/20. Mediante la titulación del suero
en diluciones al doble en las que se adiciona un volumen igual del antígeno teñido
estandarizado se puede obtener un punto final (título). Las placas se sellan e incuban a
37°C durante 18–24 o 48 horas. Una reacción positiva consiste en una precipitación
fina y difusa en tanto que una reacción negativa muestra un precipitado como un botón.

19
 Los títulos de 1/40 normalmente se consideran positivos pero esta prueba tiende a
producir más resultados falso positivos con los sueros de pavo
2.7- Ventajas y desventajas de la Prueba de Aglutinación
 Las ventajas de las reacciones de aglutinación
desde el punto de vista de su utilidad en el
laboratorio es que son muy sencillas de
realizar
 no requieren ningún equipamiento para su
lectura,
 son rápidas y fáciles de implementar.
 Sin embargo, cabe mencionar, que las
reacciones de aglutinación presentan menor
sensibilidad que las reacciones de interacción
primaria tales como ELISA e
Inmunofluorescencia indirecta
2.8- Materiales
 25 μm de suero de la sangre de ave
 30 μm antígeno para S. pollorum.
 Porta objeto

20
3 - H e m ag l u t i n ac i ó n e i n hi bi ci ó n d e
l a h e m a gl u t i n ac i ó n .

3.1- Introducción
Ya que la aglutinación es una técnica mucho más sensible que la precipitación, a veces es
útil convertir un sistema de precipitación en uno aglutinante. Esto puede hacerse por la
unión química de un antígeno soluble a partículas inertes, como eritrocitos, bacterias o
látex. Los eritrocitos son las mejores partículas para este fin y las pruebas que se emplean
eritrocitos recubiertos se denominan pruebas de hemaglutinación pasiva. Una variante
interesante de las pruebas de hemaglutinación es el uso de anticuerpos monoclonales
bifuncionales.
Algunos virus poseen en su envoltura proyecciones cortas de una constitución química
definida (glicoproteínas) denominadas hemoaglutininas. Estas tienen la propiedad de unirse
a glóbulos rojos de ciertas especies animales, formando en suspensión, un enrejado de
glóbulos rojos-virus.
Por otra parte algunos virus pueden unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y de aves. Esta
hemaglutinación inducida por virus puede ayudar a caracterizar virus desconocidos. La
inhibición de la hemaglutinación vírica por anticuerpos hace posible identificar un virus
específico o cuantificar los niveles de anticuerpos en el suero. Los microorganismos
hemaglutinantes incluyen los ortomixovirus y paramixovirus, alfavirus, flavivirus, y
bunyavirus, así como algunos adenovirus, reovirus, parvovirus y coronavirus. También se
incluyen algunos micoplasmas Como Mycoplasma gallisepticum
En los virus del grupo Orthomixovirus (Influenza humana) y Paramixovirus (Parainfluenza
tipo 3) la ubicación de la enzima neuraminidasa entre las glicoproteínas virales, determina
que en algunos virus (por ejemplo, Parainfluenza tipos 3) la técnica de hemoaglutinación
debe realizarse a bajas temperaturas para retrasar la elución de los eritrocitos por la acción
de la neuraminidasa.

21
La neuraminidasa actúa sobre la unión entre los glóbulos rojos y hemoaglutinina
provocando la destrucción del sitio receptor específico en el glóbulo rojo con posterior
elución del virus. Este fenómeno es visualizado en el fondo del pocillo de la policubeta por
la formación de un pequeño botón rojo.
Los Adenovirus y Enterovirus son capaces de hemoaglutinar glóbulos rojos de ciertas
especies, pero no poseen la enzima neurominidasa, por lo que la hemoaglutinación es
irreversible. En otros virus, la hemoaglutinación está asociada a una fracción soluble del
virus separable de la partícula viral (Poxvirus).
La característica principal de la técnica de hemoaglutinación es la rapidez, el bajo costo de
los reactivos y la simplicidad de su realización, lo que determina su fácil adaptación a
laboratorios de escasa infraestructura.

3.2-Hemaglutinación

Otra categoría de aglutinación que involucra la aglutinación espontánea de los eritrocitos

por ciertos virus, es la reacción de
hemaglutinación viral, la cual puede inhibirse de
manera específica en presencia de anticuerpos
antivirales. Por lo tanto, la hemaglutinación viral
puede emplearse para medir la cantidad de virus
o para determinar, por inhibición homóloga, el
título de los anticuerpos dirigidos en contra de
los virus hemaglutinantes.
Los ácidos nucleicos de muchos virus codifican proteínas de superficies que aglutinan
eritrocitos de varias especies. El fenómeno se emplea con mucha frecuencia para el
diagnóstico de las infecciones causadas por ortomixovirus, paramixovirus, flavivirus y
bunyavirus. La presencia del virus en cultivos celulares infectados puede detectarse por
hemaglutinación; la identidad del virus o de los anticuerpos presentes en el suero de un
paciente puede determinarse por la inhibición específica de esta hemaglutinación. La
tipificación del aislamiento más eficiente se logra por inhibición de la hemaglutinación. La
reacción de las hemaglutininas virales con los eritrocitos da como resultado un retículo de

22
células aglutinadas que sedimentan en forma irregular en un tubo
o cubeta de microtitulación. Las células no aglutinadas
sedimentan en forma de botón compacto.

3.2.1- Hemoaglutinacion indirecta: Estas metodologías son

ampliamente utilizadas en el laboratorio clínico para la detección serológica de anticuerpos
en diferentes patologías infecciosas.

3.2.2- Hemoaglutinacion directa: La presencia de antígenos en la superficie de los

glóbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinación producida cuando se añade un
antisuero con anticuerpos frente a dichos antígenos. Esta técnica se emplea habitualmente
para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada
se le añaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh
negativos). Habrá aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del
antisuero añadido De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinación
de los distintos grupos Rh.

3.2.3-Ventajas
 Es sensible y de bajo costo.
 Las ventajas de emplear eritrocitos para recubrirlos con antígeno son su
disponibilidad inmediata, la sensibilidad como indicadores y la posibilidad de
almacenamiento prolongado a 4°C.

3.2.4- Preparación de los eritrocitos:

1. Una vez obtenida la sangre se deposita en un medio de solución Alsever (EDTA)
2. Para su utilización se hace un lavado previo (tres veces) con PBS y se centrifuga
durante 5 minutos a 4000 rpm.

23
 3. Los eritrocitos se preparan al 1% agregando 50 ml de PBS y 500 μl de sangre
previamente preparada (eritrocitos)

3.2.5- Procedimientos de la hemaglutinación

1. Se agrega 50 μl de PBS (control) en la primera fila.
2. Se agrega 100 μl del antígeno (vacuna) en el primer pocillo de la segunda fila
3. Se colocan 50 μl de PBS en los pocillos restantes.
4. Se toman 50 μl del pocillo que contiene el antígeno y se colocan el pocillo siguiente
y así sucesivamente hasta el último pocillo, descartando los últimos 50 μl, para
obtener las dilusiones 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128…
5. Se colocan 50 μl de eritrocitos a cada pocillo, previamente preparados
6. Se incuba durante una hora a 4ºC, debidamente tapado.

3.3-Inhibición de la hemaglutinación
La inhibición de la aglutinación de los eritrocitos recubiertos con antígeno por el antígeno
homólogo es un método sensible y específico para la identificación de pequeñas cantidades
de antígeno soluble en la sangre o en otros líquidos de los tejidos. El principio de este
análisis es que, el anticuerpo incubado previamente con antígenos homólogos solubles o de

24
reacción cruzada, es «inactivada» cuando se incuba con eritrocitos recubiertos de antígeno.
Este método de inhibición de la hemaglutinación ha resultado muy útil para la
identificación de HBsAg en la hepatitis y para la identificación del antígeno factor VIII en
la hemofilia y trastornos afines de la coagulación.
En la prueba de inhibición de hemaglutinación, detecta y cuantifica anticuerpos protectivos
en el suero, el cual es de mucha utilidad en el control de la vacunación y en el diagnóstico
de enfermedades (sueros pareados). Esta prueba mide anticuerpos contra hemaglutininas
(H), sin embargo el suero debe contener anticuerpos para bloquear alrededor de 4 x 106

3.3.1- Materiales
A. Material biológico
a- Virus (New Castle cepa “la Sota” –vacuna)
b- Glóbulos rojos lavados (aves)
B- Material de laboratorio
a- Solución salina o PBS
b- Solución Alserver (EDTA)
c- Gradillas
d- Tubos de ensayos
e- Centrífuga
f- Placas con antígeno.
g- Pipetas
3.3.2-Procedimientos para la inhibición de hemaglutinación

1. Se colocan 25 μl de PBS a los pocillos a excepción de la

primera fila y las dos últimas columnas (B1-H10)

25
2. Se colocan 50 μl de PBS en las últimas dos columnas (la columna 11, es el control
del virus, la columna 12 es el control de rojos) a excepción del primer pocillo de la
columna 11 (H11).
3. Se agregan 45 μl de PBS a la primera fila a excepción de los últimos dos pocillos
(A1-A10)
4. Se agregan 5 μl de suero (muestra) en la primera fila a excepción de los últimos
pocillos (A1-A10)
5. Se toman 25 μl de la mezcla (45 μl PBS + 5μl suero) e ir diluyendo hacia los
siguientes pocillos (A1-H1,A2-H2…) descartando los últimos 25 μ; para obtener
diluciones 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320…
6. Se agregan 100 μl de virus en el pocillo A11
7. Luego se toman 50 μl del pocillo A11 y se pasa al siguiente pocillo (B11-H11) y así
sucesivamente, descartando los últimos 50 μl.
8. Se agregan 25 μl de virus del pocillo A1-H10
9. Agregar 50 μl de eritrocitos a toda la placa e incubar a 4 ºC durante 20 min.

26
4-PRUEBA DE
INMUNOCROMATOGRAFÍA
La Inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas
principales ventajas son la simplicidad y rapidez de la prueba. Cada vez son más las
aplicaciones de esta técnica, tanto en el ámbito de los test, debido a que no es necesario
reactivos ni instrumentación adicional, como en el campo clínico.
Se puede realizar mediante un dispositivo simple desarrollado para detectar la presencia (o
la ausencia) de un compuesto objetivo en la muestra (la matriz). Este tipo de pruebas son
utilizadas comúnmente para el diagnóstico médico tanto para pruebas en casa, o de empleo
en el laboratorio. Se presenta en un formato de tira, en el cual la muestra problema fluye a
lo largo de un sustrato sólido por medio de una acción capilar.
La Inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de una membrana
de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por
un anticuerpo específico contra uno de los epitopos del antígeno a detectar y un reactivo de
detección. Si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado
formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Sino,
migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.
La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo
del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del
antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará (muestras positivas). En el
caso contrario las muestras son negativas.
La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al
conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control
de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y
negativas.
4.1-SNAP® Filaria RT
Permite diagnosticar la Filariosis (antígeno de Dirofilaria
immitis) en menos de 10 minutos y establecer el tratamiento

27
 inmediatamente. Necesita 0.1mL de muestra, cosa que reduce la probabilidad de errores.
SNAP® Filaria RT detecta antígeno de Dirofilaria immitis.
4.1.1-Ventajas de la prueba
 Fácil de interpretar.
 Sensibilidad del 98% y especificidad del 99,9%.
 Alta sensibilidad en infestaciones leves.
 Resultados en 8 minutos.
 5, 15 y 30 tests por kit.
 Conservación a temperatura ambiente.
 Sangre entera, suero o plasma.
 El test rápido más preciso del mercado.

4.1.2-Tipos de Snap rápido para diferentes pruebas y animales.

TEST SNAP 4DX SNAP FILARIA RT SNAP COMBO PLUS

SNAP CPL TEST SNAP FPL

4.1.3-Información sobre la muestra

 Las muestras deben estar a temperatura ambiente (15–25°C) antes de comenzar el
procedimiento de análisis.
 Pueden utilizarse muestras de suero, plasma o sangre entera con anticoagulante (por
ejemplo, EDTA o heparina) recién extraídas o almacenadas a 2–8°C, como máximo
durante una semana.

28
 Para almacenar las muestras durante más tiempo, el suero o plasma puede congelarse (-
20°C o menos) y volver a centrifugarse antes de su uso.
 Las muestras hemolizadas o lipémicas no afectarán los resultados del análisis.

5-INMUNO-DIFUSIÓN DE AGAR
GEL

Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con el antígeno

correspondiente, se forman complejos antígeno-anticuerpo que se
insolubilizan en su mayor parte, dando lugar a una reacción de
precipitación.
Empleando soportes adecuados es posible que los antígenos y
anticuerpos migren con diferentes velocidades, de modo que al
encontrarse inter reaccionen y precipiten. Los geles utilizados como
soporte tienen como base pectina, alginatos, poliacrilamida e incluso
pueden utilizarse tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los
precipitados que se originan se visualizan como bandas, que permanecerán estables
mientras un mayor flujo de moléculas de alguno de los reactivos empleados no provoque su
redisolución.
Se utiliza normalmente el método de Oucherlon y o de doble difusión. Consiste en
enfrentar en pequeñas perforaciones efectuadas en el agar, las soluciones de antígeno y
anticuerpo. Al difundir y ponerse en contacto, producirán una banda de precipitación sólo
si se encuentran en concentraciones óptimas. Si ésta concentración es la que corresponde a
la zona de equivalencia de la banda de precipitación estará situada aproximadamente en la
distancia media que separa los reservorios. Cuando hay exceso de antígeno o anticuerpo, la
banda estará más próxima al pocillo del anticuerpo o del antígeno, respectivamente.

29
Este sistema permite identificar las bandas de precipitación mediante el empleo simultáneo
de antígenos y anticuerpos conocidos.
Se pueden observar tres tipos de reacciones.
a. (I) Reacción de identidad: los dos sistemas difunden en una
única banda de precipitación.
b. (II) Reacción de no identidad: cada sistema reacciona
independientemente, originando bandas de precipitación
que se cruzan.
c. (III) Reacción de identidad parcial: Se produce cuando uno de los antígenos tiene menos
de un componente y es capaz de dar una reacción cruzada con un anticuerpo elaborado
contra un antígeno más simple. En este caso las bandas de ambos sistemas se unen y
funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación o espolón. Esto
indica que en este antígeno hay componentes antigénicos no compartidos.

5.1-Ventajas y desventajas
Una de las ventajas es que este método, es sencillo, se puede realizar en cualquier
laboratorio, ha sido utilizado en prácticas de virosis, también como método de
diagnóstico serológico.
Como desventaja este método es limitado, debido la baja sensibilidad, ha sido desplazado
por otras técnicas.
En virología veterinaria se lo utiliza en la actualidad para identificar reactores para las
siguientes infecciones: Fiebre aftosa, Leucosis Bovina Enzoótica, Lengua Azul, Anemia
Infecciosa Equina, Enfermedad de Gumboro, Bronquitis Infecciosa.

5.2-Técnica de inmunodifusión en agar para leucosis bovina enzoótica

5.2.1-Materiales
a. Agar: Buffer Tris 0,05 M PH 8, CINa 8,5%, Agar Noble 0,85%.
b. Antígeno y antisuero control.
c. Sueros problema.
d. Otros: Portaobjetos, Pipetas y Cámara húmeda.

30
5.2.2-Método
a. Preparación del agar:
Disolver a Baño María hasta que se vea transparente. Colocar 3,5ml. Sobre un portaobjeto
limpio y desengrasado. Dejar enfriar en un ambiente libre de polvo o tapado hasta que
solidifique bien. Una vez solidificado conservar tapado y a 4ºC hasta su uso. Perforar
usando el sacabocado convencional que indique el kit,de 7 bocas (una central y 6
periféricas). Extraer el agar de los pocillos con bomba de vacio.

b. Siembra
Colocar el suero positivo de referencia en 3 de los pocillos periféricos en forma
alternada. Colocar luego los sueros problema en los orificios restantes. Llenar los
pocillos hasta la superficie, sin dejar menisco (aproximadamente 25 ul.).
Colocar el antígeno en el pocillo central de la misma manera. Incubar a temperatura
ambiente (20 - 25º), en cámara húmeda durante 48 horas.
c. Interpretación de resultados
Usar una fuente de iluminación que provea y que incida en forma oblicua al plano inferior
de la placa.
Negativo (reaccion de no identidad): La línea control continúa hasta el pocillo del suero
problema.
Positivo (reacción de identidad): La línea control se une en forma continua con la línea
producida por el suero problema.
Inespecífico: La línea del suero problema se cruza con la línea control.
Positivo o débil: La línea control se curva ligeramente pero no alcanza a formar una línea
completa entre el suero problema y el antígeno

31
 6-REACCIÓN EN CADENA DE
POLIMERASA (PCR).
6.1-Principio de la técnica:
PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en cadena de la
Polimerasa La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento
de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que
proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de
ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reacción de
PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN.

La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se

desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica
consiste en ciclos repetitivos de:
 Desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario;
 unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN
diana;
 extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los cebadores
utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg²+

Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son

diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el
segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN
molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador constituyen un «ciclo» del método
de amplificación por PCR. La siguiente figura ilustra las tres fases principales del proceso
de amplificación por PCR.

32
 Figura 1:
.

Paso 1:
Desnaturalización

Paso 2: Unión

Cebadores directos e
indirectos
Paso 3: Extensión
Solo dNTPs
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde para el
ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta reacción
exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos por los
extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene dada por la distancia
entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de amplificación efectiva son
moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas longitudes pueden superar la distancia
entre los sitios de unión de los dos cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan
hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas
posteriores de amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción.
Así, la amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se
expresa con la siguiente ecuación:
(2𝑛 -2n)x

Donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto

obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo ciclo
con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original.
Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces,

33
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una PCR
varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se haya
conseguido.

En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres fases de
la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y
extensión)

Figura 2: La amplificación exponencial del ADN mediante PCR

6.2-Desnaturalización del ADN molde

Durante la desnaturalización, la hebra doble se funde, abriéndose para dar ADN
monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimáticas (es decir, la extensión de un
ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el aumento de la
temperatura, lo que se denomina desnaturalización. Para obtener la desnaturalización del
ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96°C.
De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el número de bases
desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN bicatenario se convierte en
monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario ha pasado a

34
monocatenario se denomina temperatura de fusión, Tf. El proceso de desnaturalización
depende del tipo de disolvente, de la concentración salina y del pH utilizado; por ejemplo,
la temperatura de fusión desciende al bajar la concentración salina, al subir el pH y en
presencia de disolventes orgánicos como el formaldehído.

El valor de la Tf también se puede ver afectado por la concentración de G/C y T/A. La Tf

de una estructura de ADN que contiene una elevada proporción de G/C es más alta que la
de un ADN más rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene aproximadamente un
60 % de G/C y una Tf de unos 94 °C, mientras que Pneumococcus tiene aproximadamente
un 40 % de G/C y una Tf de unos 85 °C.

6.3-Anillamiento del cebador

La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una temperatura inferior
(generalmente, entre 55 y 65 ºC). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos hebras
complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una molécula de ADN
bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y es continua la formación y
la ruptura de puentes de hidrógeno entre el cebador monocatenario y el ADN molde
también monocatenaria. Los enlaces más estables duran un poco más (los cebadores que se
corresponden exactamente con el ADN molde) y es en ese pequeño fragmento de ADN
bicatenario (ADN molde con cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a
copiar el ADN molde. Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace iónico entre
el ADN molde y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe

6.4-Extensión del cebador

En esta fase, los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando una
ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq polimerasa) en
presencia de dNTP, lo que produce la duplicación del material diana inicial. La temperatura
de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 ºC. Cuando los cebadores se han
extendido unas cuantas bases, ejercen una atracción iónica más fuerte sobre el ADN molde,
lo que reduce la probabilidad de que se invierta el proceso. Los cebadores que no se

35
corresponden exactamente se vuelven a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan
lugar a la extensión del fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al
cebador en el extremo 3’ (la polimerasa añade dNTP desde 5’ hacia 3’, leyendo el ADN
molde desde 3’ hacia 5’). La duración del tiempo necesario para las fases de extensión del
cebador puede aumentar si es larga la región de ADN que se va a amplificar; sin embargo,
en la mayoría de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min para conseguir una
extensión completa.

6.5-Instrumentación y componentes del PCR.

6.5.1-Instrumentos
El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances:
a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivación a temperaturas
elevadas; así pues, es posible que una alícuota inicial de polimerasa se mantenga a lo largo
de muchos ciclos del protocolo;
b) el desarrollo de baños termostatizados que pueden subir y bajar rápidamente su
temperatura de forma automatizada y programada; se denominan termocicladores o
máquinas de PCR.
Se utilizan diversos diseños de termocicladores como, por ejemplo, calentamiento y
refrigeración por fluidos, calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por fluidos,
y calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por semiconductores.

Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de los
ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y extensión del
cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclo descritos en los párrafos
siguientes.
6.5.2- ADN diana
En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al menos un
ejemplar intacto del gen diana. Si el número de ejemplares del gen diana es mayor, también
lo será la probabilidad de que tenga éxito la amplificación del ADN.
Cualquier alteración, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la amplificación
por PCR. El tamaño de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y unas cuantas

36
kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la PCR está entre 0,05 y
1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la secuencia diana. Aunque las
muestras no tienen que estar muy purificadas, sí es necesario eliminar algunos
contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes quelantes de Mg2+ o los
detergentes, para evitar que inhiban el proceso de amplificación.

6.5.3- Cebadores
Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que permite que
la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los cebadores no deben tener
tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni motivos repetidos, ya que podrían
hibridarse de forma inadecuada con el ADN molde. Deben evitarse las secuencias repetidas
invertidas, a fin de prevenir la formación de estructuras secundarias del cebador, que
impedirían su hibridación con el ADN molde. También deben evitarse las secuencias
complementarias de otros cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridación entre
cebadores o la formación de dímeros de cebadores (esto es especialmente importante en
relación con el extremo 3’ del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo
3’ del cebador tenga gran proporción de bases G y C para aumentar la hibridación del
extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10 kb en
longitud. Normalmente se observa una importante reducción del rendimiento cuando los
cebadores se encuentran a más de unos 3 kb de distancia entre sí. La concentración usual de
oligonucleótidos para la PCR es de 1 µM. Esto resulta suficiente para al menos 30 ciclos de
amplificación. La presencia de oligonucleótidos a una concentración superior puede
provocar la amplificación no deseada de secuencias distintas de la diana. Por el contrario,
la PCR no es eficaz si la concentración del cebador es limitante.

6.5.4- ADN polimerasa

El método original de PCR utilizaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E.

coli (Saiki et al., 1985). Sin embargo, esta enzima se desnaturaliza a temperaturas
inferiores a las necesarias para desnaturalizar la mayoría de ADN molde bicatenario. Así
pues, en los primeros experimentos era necesario añadir más enzima a la reacción tras cada

37
ciclo. Por otra parte, había que trasladar las muestras desde un baño a una temperatura
hasta otro a otra temperatura para permitir el desarrollo de las distintas fases de
desnaturalización, anillamiento y polimerización. Evidentemente, el uso de una ADN
polimerasa termorresistente ha facilitado el proceso porque ha dejado de ser necesario
añadir enzimas tras cada fase de desnaturalización. En principio, las ADN polimerasas solo
pueden incorporar nucleótidos al extremo 3’ de un polinucleótido. La primera ADN
polimerasa termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria
Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la más
utilizada a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN
polimerasas.

6.5.4.1- ADN polimerasa Taq/AmpliTaq

Como ya se ha indicado, esta enzima se aisló de la bacteria Thermus aquaticus que vive en
una fuente caliente del parque nacional de Yellowstone, de EE.UU., a temperaturas
próximas a los 85 ºC. La temperatura óptima de funcionamiento de esta enzima es de 70 a
80 ºC, a la que la bacteria sintetiza ADN a la velocidad de 35 – 100 nucleótidos/segundo.
Se conoce como procesividad el número medio de nucleótidos que incorpora una enzima al
ADN antes de separarse del ADN molde. La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima
modificada genéticamente expresada por E. coli. Como AmpliTaq es recombinante, su
pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin embargo, es posible
que durante la amplificación del ADN se produzca contaminación con algunas secuencias
homólogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una ADN polimerasa que no se
haya expresado con E. coli como organismo hospedador. Tanto la ADN polimerasa Taq
como la AmpliTaq poseen actividad exonucleásica de 5’ a 3’, con lo que eliminan
nucleótidos por delante de la cadena en crecimiento.

6.5.4.2-ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma.

Estas enzimas tienen actividad exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los
residuos mal apareados hasta que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin
embargo, la actividad exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los

38
cebadores. Por tanto, la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien
habría que utilizar cebadores modificados químicamente.

6.5.4.3-ADN polimerasa AmpliTaqGold.

Esta enzima consiste en una ADN polimerasa AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente,
y que solo puede activarse durante un periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el
programa del termociclador debe incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de
92 – 95 ºC. En caso de PCR con liberación gradual es posible suprimir el tiempo de pre-
incubación, pero deben efectuarse al menos 10 ciclos más que con la PCR clásica.

6.5.5-Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR

Además de los reactivos que participan directamente en la reacción, la PCR necesita un

tampón adecuado, cuya composición depende del tipo y de las características de la enzima
utilizada. La mayoría de los proveedores proporcionan normalmente un tampón 10x para
utilizarlo con la enzima respectiva. El tampón de reacción más común utilizado con la
ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene:
 Tris 10 mM, pH 8,3
 KCl 50 mM
 MgCl2 1,5-2,5 mM.

En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de MgCl2

en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la concentración óptima se
determina empíricamente.
Los iones Mg2+:
 forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la
incorporación de estos;
 estimulan la actividad polimerásica;
 aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la
interacción entre las dos cadenas).

39
Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o incluso
nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se acumulen productos
inespecíficos (errores de cebado). Es importante evitar que en la solución de ADN molde
haya una concentración elevada de agentes quelantes, como el EDTA, o de grupos iónicos
con carga negativa, como el fosfato. En la bibliografía actual se encuentran discusiones
sobre diversos tampones y suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la
formamida, el glicerol, la espermidina y los detergentes no iónicos, utilizados para
aumentar la especificidad o el rendimiento de la reacción (Roux, 1995).
Efectivamente, algunas ADN polimerasas alcanzan su nivel óptimo de actividad solo en
presencia de tales suplementos (Rolfs et al., 1992).

6.5.6-Desoxirribonucleósido-trifosfatos

Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libres (dNTP). La

concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y 200 µM, y los
cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para minimizar los errores
de incorporación (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que suministran dNTP de
elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de los dNTP o bien como
mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP (generalmente 100 mM) se
deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para garantizar que el pH de la reacción
final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin embargo, ahora se suministran muchas
soluciones madre de dNTP con el pH ya ajustado.

6.5.7-Número de ciclos y efecto de meseta

El número de ciclos de amplificación necesarios para producir una banda visible en un gel
depende mucho de la concentración inicial del ADN diana. A fin de amplificar 50
moléculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para amplificar
3x105 moléculas hasta la misma concentración es suficiente con entre 20 y
30 ciclos. Esta falta de proporcionalidad se debe al efecto denominado de meseta, que es la
atenuación de la velocidad exponencial de acumulación del producto en las últimas etapas
de una PCR, cuando el producto alcanza la concentración de 0,3-1,0 nM. Puede deberse a

40
una degradación de los reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores
o dNTP: lo primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibición
por el producto final (formación de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de
productos inespecíficos, competencia por la unión con el cebador mediante nueva
hibridación del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se obtiene el
producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequeña muestra (1µl) del producto
amplificado, la cual se mezclará y volverá a amplificar durante 20 o 30 ciclos en una nueva
mezcla de reacción, en lugar de prolongar la tanda haciendo más ciclos. En algunos casos
en que es limitante la concentración del ADN molde, esta nueva amplificación puede
proporcionar un buen producto, mientras que la extensión de los ciclos a más de 40 no lo
hace.
6.6-Ventajas del PCR

1) Simplicidad y rapidez.
2) A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad
considerable para el estudio que se vaya a realizar.
3) El producto de puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
4) Especificidad.
5) Sensibilidad.
6) Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
7) Alternativas a la detección tradicional.

6.7-Desventajas del PCR

1) Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo
menos una mínima secuencia de 20-40pb.
2) Se necesitan ``primers´´ específicos que sean complementarios al fragmento
que se desea sintetizar.
3) La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN.
4) Puede contaminarse por otro ADN (puede ser el del mismo investigador o el de
otro)

41
 Tubos de PCR.

Termociclador: permite realizar los ciclos de

temperaturas necesarios para una reacción en
cadena de la polimerasa de amplificación de
ADN.

Desnaturalización, unión y
extensión de ADN en PCR según
tiempo y temperatura Componentes
de reacción del PCR

7-Electroforesis en gel de Agarosa.

7.1- Principios de la electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las
proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa.
Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución

42
tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica
de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de
fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las moléculas en
función de su tamaño.

Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros,

dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:
 fuerza del campo.
 tamaño y forma de las moléculas.
 hidrofobicidad relativa de las muestras.
 fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.

Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en la
electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a esta
técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de potencial (E),
que puede expresarse con la siguiente ecuación:
E = V/d (1)
donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y d, la distancia en cm entre los
electrodos.
Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una molécula cargada,
que puede expresarse con la siguiente ecuación:
F = Eq (2)
donde q corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la fuerza,
medida en newtons, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo.

Existe asimismo una resistencia de fricción que ralentiza el desplazamiento de las

moléculas cargadas. Esta fuerza de fricción es función de los siguientes factores:
 tamaño hidrodinámico de la molécula.
 forma de la molécula.
 tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis.
 viscosidad del tampón.

43
La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del gradiente de
potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede expresarse con la
siguiente ecuación:
v = Eq / f (3)
donde f es el coeficiente de fricción.
La movilidad electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la
velocidad del ión por el gradiente de potencial:
M=v/E (4)

Además, de la ecuación (3) se infiere que la movilidad electroforética M puede expresarse

de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el coeficiente de
fricción (f):
M=q/f (5)

Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen distintas cargas
globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades electroforéticas. La
movilidad electroforética es un parámetro significativo y característico de las moléculas o
partículas cargadas y depende del valor de pK del grupo cargado y del tamaño de la
molécula o partícula. Incluso las moléculas con cargas semejantes empezarán a separarse si
sus tamaños moleculares son distintos por cuanto estarán sometidas a fuerzas de fricción
diferentes. El ADN bicatenario lineal migra por las matrices de gel a velocidades
inversamente proporcionales al log10 del número de pares de bases. Las moléculas más
grandes migran más despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la menor
eficacia del desplazamiento a través de los poros del gel.

La corriente que atraviesa la solución entre los electrodos es conducida principalmente por
los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por los iones de la muestra. La
relación entre intensidad I, tensión V y resistencia R se expresa según la ley de Ohm:
R=V/I (6)

44
Esta ecuación muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la separación
electroforética aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al correspondiente
incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada será proporcional a la
intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V) y el incremento
correspondiente de intensidad e (I) ocasionaría uno de los principales problemas que
plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la generación de calor. Este
fenómeno queda ilustrado con la siguiente ecuación, en la que la potencia (W, medida en
vatios) generada durante la electroforesis equivale al producto de la resistencia multiplicado
por el cuadrado de la intensidad:
W = I2R (7)

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se disipa en

forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:
 aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el
consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas
 formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las muestras
separadas
 inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por
ejemplo, desnaturalización del ADN)
 disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia del
medio.
7.2-Componentes de la electroforesis en gel de agarosa

7.2.1-Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso
molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la
agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa. La
agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de
agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las
moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kDa.

45
Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada
por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a
esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.

Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón
acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en
una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se
deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la
agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración.

7.2.2-Tampón de electroforesis
La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica
del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el
ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la
conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el
peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.

Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario.

Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una
concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los tampones de electroforesis
suelen prepararse en forma de soluciones concentradasy se conservan a temperatura
ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso
de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x
proporciona un poder más que suficiente y en la actualidad prácticamente todas las
electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentración.

7.2.3-Concentración de agarosa

Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a través

de los geles según la concentración de agarosa. En función de la concentración de agarosa o
tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb. En los

46
geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas
entre un 0,7 % y un 3 %.

7.2.4-ADN marcador

Para una tensión, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón determinadas, la

distancia de migración depende del peso molecular del material inicial. Así pues, debe
cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las ranuras situadas en los extremos
derecho e izquierdo del gel. Generalmente un marcador contiene un número determinado
de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el tamaño de los
ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsión sistemática del gel
durante la electroforesis.

7.2.5-Tampón de carga
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer lugar
con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por
ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.). La cantidad
máxima de ADN que puede cargarse depende del número de fragmentos. La cantidad
mínima de ADN que puede detectarse mediante fotografía de los geles teñidos con bromuro
de etidio es de aproximadamente 2 ng en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de
este ancho contiene más de 500 ng de ADN, la ranura estará sobrecargada y se producirá
emborronamiento.
El tampón de carga se emplea con tres fines:
 aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo
 añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga
 incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace
hacia el ánodo a una velocidad previsible.

7.3-Práctica

47
Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutágena/carcinógena potente y
moderadamente tóxica. Se deberán llevar siempre guantes cuando se manipulen
soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.

7.3.1-Instrumental
 Unidad de electroforesis horizontal con alimentación eléctrica
 Horno microondas o incubador-agitador
 Micropipetas
 Tubos de reacción de 1,5 ml
 Balanza que pueda pesar 0,01 g
 Espátulas
 Soporte para tubos de reacción
 Material de vidrio
 Transiluminador (radiación UV, 312 nm)
 Instrumentos para documentación (por ejemplo, cámara Polaroid o
magnetoscopio).

7.3.2-Reactivos
 Agarosa adecuada para electroforesis de ADN
 Tris[hidroximetil] aminometano (Tris) CAS 77-68-1
 Ácido bórico
 Na2EDTA CAS 6381-92-6
 Bromuro de etidio CAS 1239-45-8
 Sacarosa
 Cianol de xileno FF CAS 2650-17-1
 ADN marcadores:
 Lambda ADN EcoRI/HindIII digerido (u otros marcadores adecuados
similares)
 Escalera de ADN de 100 pb.

48
Tampón de TBE 10x (1 litro)

Tris [hidroximetil] aminometano (Tris) 54,0 g

Ácido bórico 27,5 g
Na2EDTA 7,44 g

 Mezclar el reactivo con agua desionizada para obtener una solución de un litro con
un pH de 8,3.
 Conservar a temperatura ambiente.

Tampón de carga 6x (10 ml)

Cianol de xileno FF 0,025 g
Sacarosa 4g

 Añadir sacarosa y cianol de xileno FF al agua desionizada para obtener 10 ml de

solución.
 Mezclar la solución, pasar por autoclave y conservar a 4°C.

7.3.3-Procedimiento

 Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o deotro
modo. Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos completos al
añadir la solución de agarosa.
 Diluir tampón de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE 0,5x
para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.
 Pesar la agarosa en polvo según lo indicado en el cuadro 2 y añadirla a una cantidad
apropiada de tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con tapa suelta
(normalmente 150 ml de solución de gel para un molde de 15 x 15 cm y 100 ml de
gel para un molde de 15 x 10 cm).

49
  Calentar la mezcla en un horno microondas o al baño maría hasta que se disuelva la
agarosa (comprobar el volumen de la solución tras haberla calentado).
 Enfriar la mezcla a 50 - 60°C y añadir bromuro de etidio (de una solución madre de
10 mg/ml) hasta lograr una concentración final de 0,2 μg/ml y mezclar bien.
 Verter la solución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel
empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.
 Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la cinta
adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.
 Añadir tampón de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel quede
cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.

7.3.3.1-Preparar muestras y marcador para ADN genómico del siguiente modo:

Muestra Marcador
Agua 3 μl Agua 6 μl
Tampón de carga 2 μl Tampón de carga 2 μl
Muestra 5 μl ‫ג‬ADN EcoR I / Hind III 2 μl
10 μl 10 μl

7.3.3.2-Preparar muestras y marcador para productos de PCR del siguiente modo:

Muestra Marcador
Tampón de carga 2 μl Escalera de ADN de 100 pb15 μl
Muestra 8 μl
10 μl

 Cargar 10 μl de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador

adecuado en las calles primera y última.
 Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el ADN
migre hacia el ánodo y aplicar una tensión de 5 - 10 V/cm.

50
  Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia
adecuada a través del gel (~ 40 - 60 minutos).
 Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el gel
en un transiluminador UV y fotografiarlo.
 Tirar el gel en el recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio
previsto a tal fin.

7.4-Ventajas y desventajas de la electroforesis en gel de agarosa

Las ventajas son que el gel es fácilmente vertido, no desnaturalizas las muestras y las
muestras pueden ser también recuperadas.
Por otra parte, las desventajas son que los geles puede fundirse durante la electroforesis, el
buffer puede agotarse, y diferentes formas de material genético pueden tratarse cuando su
forma no es predecible.

Resultados en una prueba

Cámara de Cámara de electroforesis
de electroforesis
electroforesis
donde se vierte el gel.

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