Laboratorio 3: INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

(SIMULACIÓN VIRTUAL)

Yaritsa Cifuentes Molina 201722821

Yennifer Daniela Guevara 201722896
Laura Geraldine Fajardo 201722695

Angélica María García Torres

Doctor en Química

Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia

Escuela de Química
Electiva Interdisciplinar: Fotoquímica y Fotobiología
Tunja
2019
 Laboratorio 3: Introducción a la espectroscopia de Fluorescencia
(Simulación virtual)
RESUMEN
Esta práctica se desarrolló con ayuda de un programa llamado FluSpec el cual
está compuesto por cuatro ventanas denominadas Teory, Experiment, Flu Spece y
Lab Book en las cuales la primera es una teoría con todo lo relacionado con
espectroscopia de fluorescencia la segunda es las pautas de los ejercicios a
realizar la tercera es el simulador de espectroscopia de fluorescencia y la cuarta la
solución de las preguntas de la ventana Experiment.
De esta manera el grupo de trabajo desarrollo como primera instancia el ejercicio
1 con ayuda de las pautas de la ventana 2 así mismo se tubo encuenta el
fluóroforo y sus longitudes de emisión relacionados con la Rodhamina B. Lo cual
fue ejecutado en la ventana tres flu spece donde se encontraba el simulador.
Después se realizó los apartados 14-15 de la ventana experiment ejecutándolo en
el simulador pero teniendo en cuenta que el fluoroforo utilizado era el bisulfato de
quinina y además que se debía obtener dos graficas una en presencia del
apagador (NaCl) y otra en ausencia del mismo.
Se programó al equipo para utilizar diferentes longitudes de onda para realizar el
experimento del apartado 2,1 con el fluoroforo Rodhamina B y a su vez se utilizó
diferentes concentraciones de la muestra para observa su comportamiento, esto
se ejecutó dándole click en la ventana tres y click (RhB conc) con lo cual permitió
modificar las concentraciones, se realizó el mismo procedimiento para el bisulfato
de quinina pero en el cual se modificaba la concentración del apagador (NaCl)
dándole clik en (quencher )obteniendo así espectros de fluorescencia.
Para terminar se guardó todos los datos y gráficas para futuros análisis .

MARCO TEORICO.

La fluorescencia es un fenómeno de emisión en la cual las moléculas son

excitadas por la absorción de radiación electromagnética, las especies excitadas
se relajan al estado fundamental, liberando un exceso de energía en forma de
fotones. Los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos
de absorción debido al número relativamente limitado a sistemas químicos que
pueden hacer fluoreser. La mayoría de las moléculas poseen un número par de
electrones, estos electrones poseen diferente giro o diferente spin cuando están
en el estado basal, de manera que los pares electrónicos que se encuentran
apareados se les denomina singlete1.
El proceso de excitación electrónica y las formas en que una molécula excitada
electrónicamente puede dispar su energía se pude observar de mejor manera en
el diagrama de Jabloniski en los cuales se presentan diversos procesos de
desactivación como la conversión interna, las relajaciones vibracionales y cruzes
entre sistemas2.
Uno de los instrumentos utilizados para detectar espectralmente y registrar la
emisión de la fluorescencia es el espectrofluorimetro o el fluorimetro el cual se
encuentra compuesto por una lámpara de xenón, en algunos casos una
combinación de una lámpara de deuterio, junto con una lámpara halógena,
además está compuesto por un manocromador, una celda y un fotomultiplicador 3.
Pero no solo el espectrofluorimetro nos permite detectar la emisión de
fluorescencia, existen diversos programas que ayudan a observar la
espectroscopia de fluorescencia, uno de estos es FLUSPEC siendo este un
paquete de software que permite realizar un Experimeto simulado en
espectroscopia de fluorescencia con sustancias como la rodamina B y el bisulfato
de Quinina.

RESULTADOS

Gráfica 1: Espectro de emisión de la rodamina B

 Pico de dispersión
de Rayleigh

Gráfica 2: Espectro de emisión de la rodamina B, además se muestra el pico de dispersión de

Rayleigh

Gráfica 3: Espectro de emisión del bisulfato de quinina con el apagador o quencher (NaCl)
APAGADO.
 Gráfica 4: Espectro de emisión del bisulfato de quinina con el apagador o quencher (NaCl)
ENCENDIDO.

Gráfica 5: Espectro de emisión (Fluorescencia) de la Rodamina B, utilizando una longitud de onda

de excitación de 500nm.
Gráfica 6: Espectro de emisión (Fluorescencia) de la Rodamina B, utilizando una longitud de onda
de excitación de 525nm.

Gráfica 7: Espectro de emisión (Fluorescencia) de la Rodamina B, utilizando una longitud de onda

de excitación de 555nm.
Gráfica 8: Espectro de emisión (Fluorescencia) de la Rodamina B, utilizando una longitud de onda
de excitación de 565nm.

Longitud de Longitud de
Concentració Concentración Onda de
Onda de
n (M) Emisión
Emisión
(M) (nm)
(nm)
0.30X10-7 560-750 0.008 370-660
0.80X10-7 560-750 0.038 370-660
1.20X10-7 560-750 0.058 370-660
1.90X10-7 560-750 0.078 370-660
-7
2.30X10 560-750 0.098 370-660
Tabla 1: Concentraciones de la Tabla 2: Concentraciones de la
Rodamina B para realizar el Espectro Rodamina B para realizar
de fluorescencia. el Espectro de fluorescencia
 2.30X10-7M

1.90X10-7M

1.20X10-7M

0.80X10-7M

0.30X10-7M

Grafica 9: Espectro de Fluorescencia Para la Rodamina B utilizando las diferentes concentraciones

reportadas en la Tabla 1

0.008M

0.038 M
0.078M

0.058 M 0.098M

Grafica 10: Espectro de Fluorescencia Para el Bisulfato de quinina utilizando las diferentes
concentraciones del apagador o quencher de NaCl reportadas en la Tabla 2
 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A través de esta experiencia virtual y la teoría que presenta esta aplicación se
puede analizar que:
-Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La
espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales
y electrónicos. En general, las especies objeto de examen (Rodamina B y Bisulfato
de Quinina) tienen un estado electrónico basal "un estado de baja energías de
interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. (entro de cada uno de
estos estados electrónicos) hay diferentes estados vibracionales. En la
espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la
absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los
distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con
otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional) hasta
que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La
molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden
caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los
fotones emitidos tendrán diferentes energías y longitudes de onda.
- En la gráfica 2: Espectro de emisión de la rodamina B, además se muestra el
pico de dispersión de Raleigh. Este pico en esta grafica se muestra como una
torre, está localizado aproximadamente en el rango de 520-570nm La luz dispersa
por dispersión de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente,
dentro del espectro este pico se debe evitar cuando se realiza los espectros de
fluorescencia y de absorción ya que sea cualquier tipo de espectro tanto de
excitación como de emisión se debe solo observar bandas y no barras como la
que es el pico de dispersión de Rayleigh
-Debido a muchos factores que afectan la fluorescencia existen algunas
sustancias apagadoras de fluorescencia que al interaccionar con el fluoroforo
produce una disminución de la señal fluorescente en este caso sucede con el
apagador de NaCl utilizado en el bisulfato de quinina, observando de esta manera
en las grafica que va disminuyendo la intensidad fluorescente, otro aspecto muy
importante que influye que el NaCl sea un apagador es su peso atómico debido al
llamado efecto del átomo pesado pues por esta razón también se observa una
disminución de la fluorescencia haciendo que este efecto aumente la probabilidad
que se produzca el entrecruzamiento entre sistemas.
-Observando las gráficas de las diferentes concentraciones tanto para la
Rodhamina B como para el bisulfato de quinina, se puede analizar que a bajas
concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general proporcional a la
concentración del fluoroforo utilizado.
-Observando las gráficas 5, 6, 7,8, y 9 se percibe que las sustancias utilizadas
tiene mayor longitud de onda de emisión que la utilizada para la excitación de la
especie, esto se debe a que la mayor parte de la energía que recibe la molécula
se disipa en forma de calor (procesos no radiativos) y solo parte de esta energía
se reemite como radiación electromagnética (fluorescencia).
-En la gráfica 1 en el momento del proceso de la exploración se notó la poca
intensidad de fluorescencia o la diferencia del “resplandor” durante el análisis;
esto es posible debido a las diferentes condiciones como lo es el “pH” ya que este
es un factor muy importante que afecta la fluorescencia de los analitos a estudio
dependiendo si es un pH acido o básico.
-Teniendo en cuenta que las sustancias utilizadas en la práctica son fluorescentes
se puede determinar que estas tienen poca energía ya que tienen longitudes de
onda de emisión altas; rodamina b (625-750nm) y bisulfato de quinina (452-660)
esto se debe a que la energía es inversamente proporcional a la longitud de onda
c
(E=hx ¿ y que en procesos de fluorescencia se cuenta con procesos de
ℷ
desactivación de la especie excitada tales como: conversión externa, conversión
interna,cruzamineto intersistemas,eficacia cuántica y tipo de transición entre otros
lo cual podemos rectificar en las distintas gráficas.
CUESTIONARIO
Ejercicio 2- Exploración de fluorescencia espectro de emisión y excitación
Preguntas 2,1
1) Durante la recogida de un estado espectro de emisión de fluorescencia
¿Que monocromador es escaneado? ¿Qué ocurre con la intensidad de
emisión de fluorescencia que emana de la muestra durante la carrera?
Respuesta: Durante la colección de un espectro de emisión fluorescente la
emisión del monocromador explora y la intensidad de emisión de
fluorescencia de la muestra permanece constante.
2) Comparar la magnitud de longitud de onda máxima de absorción con la
longitud de onda máxima de emisión. Con referencia a un diagrama de
Jablonski explicar esta diferencia y hacer una generalización en relación
con la longitud de onda el intervalo en que la fluorescencia se observa
normalmente en comparación con el rango de longitud de onda sobre la
que se produce la absorción para un analitos dado.
 Respuesta: para Rhb en ETOH es claro que la longitud de onda máxima
de absorbancia es=540nm y longitud máxima de emisión =625nm así la
emisión de fluorescencia ocurre en una longitud de onda más larga (p. ej. la
energía inferior) comparado con la absorción. En términos del jablonski
hacen el diagrama de esta diferencia de energía es explicado por la energía
asociada con la relajación vibracional en el S1 y estados de s0 como las
vueltas de molécula al nivel de vibracional más bajo de s0.
3) Utilice los archivos de datos creados durante este ejercicio para producir un
gráfico que muestre cada uno de los espectros de emisión recogidos
superpuestas unas sobre otras. Etiqueta de cada espectro con la longitud
de onda de excitación correspondiente.
Respuesta: refiérase a los espectros de emisión (dejados). Longitudes de
onda de excitación correspondientes son indicadas.

4) ¿Qué efecto tiene la longitud de onda de excitación tiene en el espectro de

emisión?
Respuesta: los resultados sugieren que la intensidad de emisión de
fluorescencia máxima sea obtenida cuando la muestra está excitada en su
longitud de onda de máxima de absorbancia.
5) Sobre la base de sus observaciones hechas en la pregunta 2.1 (4) explicar
por qué es preferible seleccionar la longitud de onda de absorbancia
máxima de un analito como la longitud de onda de excitación cuando uno
está registrando espectros de emisión de fluorescencia.
Respuesta: para espectros de emisión de fluorescencia, es preferible excitar
en longitudes máximas de absorbancia con esto producirá el anuncio de señal
más intenso de ahí optimizan la sensibilidad de la técnica.
PREGUNTAS Y EJERCICIOS 2,2.
 1.) Durante la recogida de un estado de fluorescencia del espectro excitado
¿Qué manocromador es escaneado y que ocurre con la intensidad de
emisión de fluorescencia que emana de la muestra durante la carrera?
Respuesta. Durante la recolección del espectro de excitación de fluorescencia, el
manocromador de excitación es escaneado, y la intensidad de la fluorescencia
varia.
2.) Explique su observación hecha en relación a la pregunta 2,1.
Respuesta .En condiciones de estado estable la intensidad de la fluorescencia
está directamente relacionada con la absorbancia, así, cuando la muestra se
excita con una longitud de onda que absorbe fuertemente, se observa una fuerte
fluorescencia y viceversa. El espectro de excitación de fluorescencia corresponde
así al espectro de absorción del analito.
3.) Utilice los archivos de datos creados durante este ejercicio para producir un
gráfico que muestra cada uno de los espectros de excitación recopilada
superpuesta la otra. Etiqueta de cada espectro con la longitud de onda de
emisión correspondiente.

4.) ¿Qué efecto tiene el cambio de la longitud de onda de emisión que tiene la
excitación observada del espectro?
Respuesta Según los resultados el espectro de excitación de fluorescencia es
más intenso cuando se registra utilizando la longitud de onda del máximo del
analito como la longitud de onda de monitoreo.
5.) Explicar por qué es preferible seleccionar la longitud de onda de emisión
máxima de un analito como longitud de onda de supervisión cuando se está
grabando espectros de exitacion?
Respuesta Para los espectros de excitación de fluorescencia es preferible
monitorizar ya que esto producirá la señal más intensa y por lo tanto optimizara la
sensibilidad de la técnica.
PREGUNTAS Y EJERCICIOS 2,3.
1.) La longitud de onda máxima de exitacion corresponde a la longitud de onda
máxima de absorción, explicar por qué esto debería ser así?
Respuesta El análisis del espectro de exitacion de fluorescencia muestra que la
longitud de onda máxima de exitacion es de 540nm. Esto corresponde al máximo
de absorción de la Rodamina B, es decir 540 nm lo cual se espera que el espectro
de excitación de fluorescencia debe corresponder al espectro de absorción del
analito.
2.) Use los datos de este ejercicio para producir un gráfico que muestre cada
uno de los espectros recogidos trazando el mismo conjunto de los ejes.
 3.) Calcular el desplazamiento de Stokes para la muestra de Rodamina en
unidades de cm-1.
1 1 -1
Respuesta Corrimiento de Stokes = ( 540 - 625 ) / (10-9 *100) cm =
2518 cm-1
4.) La muestra obedece a la regla de la imagen especular.
Respuesta Si se supone que el espectro de emisión de la rodamina B es el mismo
que su espectro de absorción, los resultados sugieren que el espectro de emisión
de la rodamina b sea casi una imagen reflejada de su espectro de absorción, en
muchos casos la probabilidad de que un electrón retorne a aun nivel de vibración
particular en el estado fundamental es similar a la probabilidad de que la posición
de los electrones en el estado fundamental antes de la exitacion siendo los
espectros de emisión y absorción de fluorescencia a menudo imágenes
especulares entre sí, de esta manera la muestra de rodamina B obedece esta
regla de buena forma.

Preguntas 2,4
1) A partir de sus observaciones realizadas con SBC como la muestra, el
estado en el caso de ambos un espectro de emisión de fluorescencia y un
espectro de excitación de fluorescencia: ¿que monocromador es
escaneado durante su recogida y qué ocurre con la intensidad de emisión
de fluorescencia que emana de la muestra durante la carrera? En relación
con la parte (ii) de esta pregunta, explique su respuesta en cada uno de los
casos.
Respuesta: Durante la colección de una emisión de fluorescencia el espectro de
emisión del monocromador explora y la intensidad de emisión de fluorescencia de
la muestra permanece constante. Durante la colección de una excitación de
fluorescencia el espectro de excitación del monocromador explora y anuncio la
intensidad de emisión de fluorescencia de la muestra varía. En condiciones fijas la
fluorescencia de intensidad directamente es relacionada con la absorbancia. Así
cuando la muestra está excitada con una longitud de onda es absorbida
fuertemente una fluorescencia fuerte es observada de manera viceversa la
fluorescencia excitada del espectro corresponde al espectro absorbido del analito.
2) Utilice los archivos de datos creados durante este ejercicio para producir un
gráfico que muestra los espectros de emisión y excitación recopilada
superpuesta a la otra. Etiqueta de cada espectro con la correspondiente
longitud de onda de excitación o emisión en el que se fue grabado. también
etiquetar λ max ( ex) y λ max ( em) e indicar el desplazamiento de Stokes.
Respuesta: refiérase a espectros de emisión y la excitación. Longitudes de
onda de excitación/emisión correspondiente y máxima son indicadas.

3) Confirma eso λ más ( ex) a λ máx. ( abs) y explicar por qué esto debería ser así.
Comparar la magnitud de (abs) y explicar por qué esto debería ser así. y
con referencia a un diagrama de Jablonski: (i) explicar esta diferencia y (ii)
hacer una generalización en relación con el rango de longitud de onda
sobre el que normalmente se observa fluorescencia en comparación con el
rango de longitud de onda sobre la que se produce la absorción para un
analito dado.
Respuesta: el análisis del espectro de excitación de fluorescencia muestra que
en longitud de onda máxima de excitación=348nm. Esto corresponde al
máximo dado de la absorción de QBS (p. ej. 348nm). El espectro de excitación
de fluorescencia corresponde al espectro de la absorción del analito en casos
donde la producción cuántica de fluorescencia es constante sobre las gamas
de longitud de onda de exploración recomendadas en los solventes escogidos.
Sin embargo, debería ser notado que esto es no siempre el caso en general.
Para QBS Longitud de onda máxima de absorbancia =348nm y longitud de
onda máxima de emisión=452nm. Así la emisión de fluorescencia ocurre en
una longitud de onda más larga (p. ej. la energía inferior) comparado con la
absorción. En términos del diagrama de Jablonski, esta diferencia de energía
es explicada por la energía asociada con la relajación vibracional en el s1 y
estados de s0 como las vueltas de molécula al nivel de vibracional más bajo de
s0.
4) Estado, el efecto de: (i) el cambio de la longitud de onda de excitación en el
espectro de emisión y (ii) cambiar la longitud de onda de emisión en el
espectro de excitación.
Respuesta: los resultados sugieren que: (i) intensidad de emisión de
fluorescencia máxima ocurre cuando la muestra está excitada en su longitud
de onda de máxima absorbancia y (ii) el espectro de excitación de
fluorescencia es el más intenso cuando es registrado usando la longitud de
onda de emisión máxima del analito, como la longitud de onda de supervisión.
5) Sobre la base de sus observaciones hechas en la pregunta 2.4 (4) explicar
por qué es preferible seleccionar: (i) λ max ( abs) como la longitud de onda de
excitación cuando uno está registrando espectros de emisión de
fluorescencia y (ii) λ max ( em) de un analito como la longitud de onda de
supervisión cuando se está grabando espectros de excitación de
fluorescencia.
Respuesta: para espectros de emisión de fluorescencia, es preferible excitar
en longitud máxima de absorbancia, con esto producirá la señal más intensa y
de ahí optimizará la sensibilidad de la técnica. Asimismo para espectros de
excitación de fluorescencia, es preferible supervisar en longitudes máximas de
emisión con esto también producirá la señal más intensa y de ahí optimizará la
sensibilidad de la técnica.
6) Calcular el desplazamiento de Stokes para la muestra SBC en unidades de
cm- 1.
Respuesta:
Desplazamiento de Stokes= (1/348-1/452)/ (10 -9X100) cm-1
=6612cm-1
7) ¿La muestra obedecen la regla de "imagen en espejo"? Explique
Respuesta: en muchos casos la probabilidad de un electrón que vuelve a un
nivel de vibracional particular en el estado de tierra es similar a la probabilidad
de aquel electrón es la posición en el estado de tierra antes de que la
excitación y entonces la emisión de fluorescencia y espectros de la absorción
sean a menudo las imágenes especulares el uno del otro. Saben esto como "
la regla de imagen especular”. Si uno asume que el espectro de excitación de
QBS es el mismo como su espectro de la absorción entonces pasa sugieren
que el espectro de emisión de QBS sea casi una imagen especular de su
espectro de la absorción, pero no exactamente. El espectro de excitación QBS
expone un segundo (el hombro) el pico en la California 317nm que
corresponde a una excitación al estado de s2. Sin embargo, en QBS el estado
de S2 rápidamente se relaja al estado de s1 y entonces la emisión de s2 no es
observada. De dónde, el espectro de emisión de QBS es comprendido de sólo
una amplia cinta centrada en 452nm. Así QBS no se conforma a la regla de
imagen especular.
Ejercicio 3- Fluorescencia Rendimiento cuántico
1) Dado que el 4,4 × 10- 6 solución M SBC se hizo en 0,5 así que la
absorbancia de la solución de SBC es 0,0251 a 348 nm, φ F( SBC, 0,5 MH
SBC, ASI QUE 4) = 0,546 a 25 ° C, y la absorbancia de la 2,4 0,546 a 25 °
C, y la absorbancia de la 2,4 × 10- 7 M RhB en solución de etanol es
0,0254 a 540 nm, utilizar sus datos recogidos junto con la ecuación (1) en la
teoría observa para calcular el rendimiento cuántico de fluorescencia de
RhB en etanol. [Nota: El 0,5 MH asi que 4 solución está suficientemente
diluida para que el índice de refracción de esta solución puede ser tomada
a ser la misma que la del agua, 1.333; el índice de refracción de etanol es
1.360. Para que el instrumento simulador de la relación de las intensidades
de excitación es yo 0 (348 nm) / 348 nm) / 348 nm) / 348 nm) / 348 nm) /
348 nm) / yo 0 ( 540 nm) = 2,198.]
Respuesta: De ecuación (1) en la sección de teoría incluyendo corrección de
factor de intensidad):

agua

Donde
Agua
así

Agua

2) Compare su resultado en la pregunta 3 (2) con la que figura en la literatura.

Véase, por ejemplo: López Arbeloa, F .; Ruiz Ojeda, P .; López Arbeloa, I.
fluorescencia auto-extinción de las formas moleculares de Rodamina B en
solución acuosa y soluciones etanólicas J. Luminesc. 1989,
Respuesta: el resultado anterior (típico) se compara favorablemente con el
valor de la literatura de 0.7 obtenido por López Arbeloa, yo. Autoextinción de
fluorescencia de las formas moleculares de B Rhodamine en j de soluciones
Acuosa y Ethanoic. Luminesc.1989, 44,105-102.
3) Si se utiliza un instrumento real para llevar a cabo mediciones
fluorométricos es importante trabajar con espectros de emisión "corregida"
en el cálculo de, por ejemplo, el rendimiento cuántico de fluorescencia. ¿Lo
que se entiende por el espectro de emisión de fluorescencia “corregida”?
Respuesta: usando las verdaderas correcciones de instrumento a veces
puede tener que ser hecho al espectro de emisión de fluorescencia para
 tomar en cuenta de diferencias de transmisiones de intensidad ligeras por la
óptica instrumental (monocromador) que es dependiente de longitud de
onda.
4) En el caso de un instrumento real, es importante asegurarse de que "las
condiciones instrumentales idénticos" se utilizan cuando la grabación de los
espectros de emisión de la muestra y de referencia. ¿Qué se entiende por
esta expresión y por qué es importante mantener “condiciones
instrumentales idénticos” entre las carreras?
Respuesta: en es importante para mantener condiciones idénticas
instrumentales entre carreras de modo que la muestra y la emisión de
referencia áreas espectrales ser puedan ser comparadas y utilizadas conforme
a la ecuación (1)

PREGUNTAS Y EJERCICIO 4.
1.) para cada caso en que se utilizó una longitud de onda de exitacion
diferentes en el experimento, es decir los casos en que la longitud de onda
excitación es igual a la longitud de onda máxima de exitacion 525 nm o
558nm en el mismo conjuntos de ejes, el área bajo el espectro de emisión
de fluorescencia frente a la concentración de rodamina B.
Respuesta: En las grafica bajo el espectro de emisión de fluorescencia vs
concentración de la rodamina B se observa un comportamiento lineal las cuales se
observa que estas líneas pasan cerca al origen lo cual es adecuado.
 2.) De su comentario de datos sobre el uso de medidas de emisión de
fluorescencia como una técnica analítica cuantitativa de la fluorescencia de
en concentraciones bajas de analitos.
Respuesta: La linealidad delas graficas anteriores confirma que las mediciones de
emisión de fluorescencia se pueden utilizar como una técnica de análisis
cuantitativa para los analitos fluorescentes en concentraciones bajas.
3.) ¿Que efecto tu¡iene la longitud de onda de excitación que tiene la
sensibilidad del metodo?
Respuesta: Según los datos se sugiere que la sensibilidad de la técnica (según lo
indicado por los gradientes de los gráficos) es máxima cuando se realiza la
excitación utilizando la longitud de onda de absorción máxima.

Ejercicio 5: Extinción de Fluorescencia

1) Grafique α 0 / α versus [NaCl] donde α 0 es el área bajo el espectro de emisión

de fluorescencia QBS en ausencia de extintor y α es el área cuando el extintor
está presente en FluSpec: espectroscopia de fluorescencia, cont. 27 el sistema.
Con referencia a su gráfica, comente sobre la aplicabilidad de la ecuación de
Stern-Volmer a este sistema
2) La ecuación de Stern-Volmer se expresa en términos de la relación de los
rendimientos cuánticos φ ° f / φ f, mientras que en este ejercicio α 0 / α se
representa como una función de la concentración del inhibidor. Explique por qué
se puede usar la proporción de áreas en lugar de la proporción de rendimientos
cuánticos al construir el gráfico de Stern-Volmer.
3) Dado que la vida útil de la fluorescencia de QBS en una solución de H2SO4 0.5
M es 19.02 ns (ver: Meech, SR; Phillips, D. Fotofísica de algunos estándares de
fluorescencia comunes J. Photochem. 1983, 23, 193–217) calcule el segundo
Constante de velocidad de orden, kq para la extinción de QBS por NaCl.
4) Utilice la ecuación derivada de las ecuaciones de Debye-Smoluchowski y
Stokes-Einstein para obtener una estimación de la constante de velocidad limitada
por difusión para el proceso de extinción, kdiff, a 20 ° C.
5) ¿Qué suposiciones son inherentes al cálculo realizado en la pregunta 5 (4)?
6) Dado que los coeficientes de difusión de las especies QBS y Cl– en solución
acuosa son 0.70 × 10-9 m2 s-1 y 2.03 × 10-9 m2 s-1 respectivamente, el área de
superficie de QBS es 359.06 Angstrom2 y el radio del ion Cl es 1.81 × 10-10 m,
obtenga una estimación más precisa de kdiff utilizando solo la ecuación de Debye-
Smoluchowski.
(7) Compare kq con los valores de kdiff calculados e interprete lo que implican las
magnitudes relativas de estas constantes.
Solución

1) Se muestra el grafico de Stern –Volmer (Arriba). Su linealidad y la

intersección del eje están cerca de la unidad que confirma la aplicabilidad
de la ecuación de Stern-Volmer en este caso.
2) El rendimiento cuántico en la ecuación de Stern-Volmer se puede remplazar
en forma de baño de áreas siempre que se mantenga las mismas
condiciones instrumentales a lo largo de las carreras.
3) Gradiente de Stern-Volmer =Kq x Tf
73,941
Kq= −9
=3,9 x 109 M −1 s−1
19.02 x 10
4) A 20°C y asumiendo ᶯ=(0.5 M H2SO4)= ᶯ(Agua)= 1.002x10-3 kg m-1 s-1
entonces:
8000 Rt
Kdiff =
3ᶯ

20+273
Kdiff =8000 x 8.314 x
3 x 10−3
Kdiff =6.5 x 109 m−1 s−1
5) Las supociones inherentes al cálculo anterior en la pregunta 4son:

-La viscosidad de la solución de H2SO4 0. 5 M de QBS es la misma que la

del agua a la temperatura del experimento
- El tamaño del apagador (Q) y las moléculas del estado excitado (M*) son
los mismos
 - Las especies Q y M* no están cargadas
6) Ecuación de Debye-Smoluchowski:

7) Al comparar el Kq y Kdiff ( Habiendo obtenido este último por cualquiera de

los métodos explorados en este ejercicio) está claro que el Kq <Kdiff. Este
resultado puede ser interpretado como el significado en H2SO4 0. 5 M no
todas las moléculas de QBS excitadas y los resultados del interruptor en la
extinción.
NOTA: Dado que tanto QBS (bisulfato de Quinina) H 2SO4 0. 5 M como el
inactivador (CI) están cargadas, el efecto de la interacción Ion- Ion en la
velocidad de difusión de las partículas juntas también se pueden considerar
para mayor precisión. Las ecuaciones directas para hacer esto son
presentadas en la literatura.

CONCLUSIONES
• En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra
mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal
a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico
excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula
excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional
más bajo del estado electrónico excitado y emite en este caso con un
proceso de fluorescencia.
 • El programa o software FluSpec resulta una herramienta muy útil para
entender el fenómeno de fluorescencia que presentan algunos compuestos,
pues en él se pueden simular diversos experimentos y valorar diferentes
muestras bajo ciertas condiciones.
• Se conoció el proceso de fluorescencia de manera más profunda y se
observó como la concentración del fluoróforo afecta el espectro de
fluorescencia.
• Se puede concluir que la presencia de apagadores hace que se disminuya
la intensidad fluorescente al interaccionar con el fluoroforo en este caso
siendo el apagador el NaCl en el bisulfato de quinina.

REFERENCIAS

[1] SKOOG, D.A.; Leary J.J.; ANÁLISIS INSTRUMENTAL, 4° ed.; Ed. McGraw-Hill
(1994), págs. 201-219 . [Consultado en línea 16 febrero 2019] RECUPERADO DE:
file:///C:/Users/Principal/Documents/lectura8.pdf.

[2] Lucas Hernández Hernández, Claudio González Pérez. Introducción al análisis

instrumental. Editorial Ariel, 2002. Pág. 105. [Consultado en línea 16 febrero 2019]
RECUPERADO DE: https://es.wikipedia.org/wiki/Fluorímetro_de_filtro.

[3] SN. SF. Fluorescencia. [Consultado en línea 16 febrero 2019]. Recuperado de:
https://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111d-
archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF
[4] Sn.2018.fluorescencia y apagadores. Consultado en línea 16 febrero 2019]
recuperado de: file:///C:/Users/datasystem/Downloads/Clase%20I
%20fluorescencia_2018.pdf.