Mariona Llad

– Prácticas BCMM –

Práctica 1: Fraccionamiento celular y análisis electroforética de las proteínas del compartimento

extracelular, citoplasma y membranas de una bacteria Gram-negativa

Medios: LB→ Caldo de lisogenia (Lysogeny Broth)

→ LB – normal : extracto levadura + peptona + NaCl 170mM
→ LB 0M : extracto levadura + peptona

Operón hemolítico hlyCABD (de E.coli uropatógena)

Alta síntesis de Hemolisina en medios de baja osmolaridad (como vejiga). La hemolisina es una
toxina EXTRACELULAR y por tanto se encuentra en la fracción extracelular.

Porinas Inespecíficas y OSMOLARIDAD:

(Omp_ → outer membrane protein)
OmpC (diámetro del poro 1.08nm)
OmpF (diámetro del poro 1.16 nm).
Si aumenta la osmolaridad disminuye OmpF y aumenta OmpC. La
proporción relativa de OmpC y OmpF se mantiene aproximadamente
constante.
Hay un sistema de dos componentes (S/RR) que responde a subidas
de osmolaridad: EnvZ/OmpR.

Anotaciones: materiales y otros

→ Ácido tricloroacético (TCA): para la precipitación de proteínas (Fracción extracelular)
→ EDTA: solución de “rotura”
→ Acetona: para lavar las sales
→ Gel con urea: la urea es agente desnaturalizante y se usa para la fracción particulada
(membranas).
→ Sonificación: se rompen las células yla muestra se aclara
→ Método Mini-Bradford: para evaluar la concentración de proteína. Absorbancia a 595 nm, recta
patrón con BSA.
→ Ácido acético: se usa después de correr el gel para desteñir.
→ Aunque OmpF sea más grande que OmpC corre más en el gel y esto se debe a la hidrofobicidad,
no corren de manera proporcional al tamaño. (sin urea si saldría en el orden esperado). Orden en
nuestro gel: OmpC > OmpF>OmpA

Práctica 2: Obtención de fusiones génicas entre genes (u operones) de una soca de Salmonella y el
gen reporter LacZ
Salmonella
Es lactosa – : no tiene los genes para usar la lactosa.

Gen reportero
Gen cuyo producto es fácilmente detectable. Se vinculan a una secuencia regulatoria de otro gen de
interés, en este caso a Salmonella.
Se usa en construcciones genéticas para verificar la transferencia del transgén a una célula o tejido,
o para estudiar la actividad de promotores y otras secuencias reguladoras.
→ En las prácticas usamos el gen reportero lacZ. El gen LacZ proviene del operón lac requerido
para el transporte y metabolismo de la lactosa en Escherichia coli entre otras. En este caso LacZ NO
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tiene promotor. Nos basaremos en la expresión de la β-galactosidasa para analizar la expresión de

la fusión transcripcional.
Se busca que el gen reporter se insierte en alguno de los genes de interés implicados en la
utilización de la MALTOSA que son inducibles. En Salmonella hay 4 operones implicados en la
utilización de la maltosa (se necesita porina específica, transportador ABC, enzimas específicas…).

Transducción vírica
El gen reporter (LacZ) está vehiculado en un transposón (MudJ). Eso se introducirá en la cepa
huésped (Salmonella enterica) a través de la transducción vírica.
También incluye el gen de la resistencia a la Kanamicina (Km) que es un antibiótico del grupo de
los aminoglucósidos. Esto sirve para seleccionar aquellas UFC que hayan incorporado en
transposón. Como tiene su propio promotor siempre se transcribirá → selección UFC resistentes.
La transposasa se no se encuentra estrictamente dentro del transposón pero reconoce la región
marcada con *:

* LacZ Km Transposasa *

Tn
Medios
→ McConkey normal: Lactosa + aminoácidos + indicador pH + NaCl…
→ McConkey Mal: Maltosa + aminoácidos + indicador pH + NaCl…

Escrutinio o “screening”
Se analizan miles de colonias sembradas en McConkey normal. Si hay degradación lactosa se
acumulan productos ácidos y el medio vira a rojo. Si la bacteria no puede degradar la lactosa, como
es el único azúcar, utilizará la peptona y el medio se basificará y será blanco.
Nosotros seleccionamos las UFC ROSAS, serán aquellas que han incorporado el transposón en el
sentido correcto, y además el Tn se habrá insertado en un operón de poca expresión (débiles,
inducibles...) →únicamente hay expresión basal como en los operones de la maltosa (que son
inducibles por la maltosa).
Si cogiéramos las rojas estaríamos cogiendo bacterias que sí han incorporado el Tn pero se ha
insertado en algún gen de expresión constitutiva o bien de expresión inducible (con inductor en el
medio). Lo que es seguro es que no será ningún operón de la maltosa.
Si cogiéramos las blancas estaríamos cogiendo bacterias que han incorporado el Tn pero invertido y
no puede haber transcripción de LacZ (ya que el nuestro no tiene promotor propio).

Las UFC seleccionadas que son las rosas se siembran en medio McConckey-MALTOSA.
Tendremos colonias blancas y rojas.
Las rojas son aquellas en las que hay degradación de la maltosa y serán la gran mayoría (la fracción
de DNA que son operones de la maltosa es muy pequeña comparado con todo el DNA).
Las blancas serán aquellas que se han vuelto incapaces de usar la maltosa porque el Tn se ha
insertado en uno o más operones de la maltosa. Serán aquellas que seleccionaremos y sembraremos
en LB-Km50.
Después se evalúa la actividad β-galactosidasa leyendo la DO a 600 nm.

Anotaciones:
- Se añade una gota de cloroformo para limpiar el lisado de posibles contaminaciones.
- Se mantienen los eppendorf 30 minutos a 37ºC para la adsorción y penetración del fago.
- Intentamos mantener la multiplicidad de infección 1:1.
- Dos controles: D→ bacteria + MgSO4. E → MgSO4 + lisado fago 1/10. Los dos sin crecimiento.
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- Se cogen las colonias rosas de McConkey-lactosa de las placas “C”, es decir, de la dilución 1/100
del lisado.
- Para el blanco: todo igual sustituyendo la muestra de cultivo por LB.
- Podría suceder que se inserte más de un Tn en los operones de la maltosa. En este caso la
actividad de la β-galactosidasa se vería aumentada.*

Práctica 3. Crecimiento de E. coli en distintos medios de cultivo y condiciones.

Se observan características metabólicas de E.coli determinando el crecimiento en
distintos medios de cultivo y el condiciones de aerobiosis/anaerobiosis.

Medio Aerobiosis Anaerobiosis Comentario

→ O2
1. Medio mínimo MOPS - 1,7 <1,7 El crecimiento en anaer. Es menos
glucosa porque en esta situación tiene lugar una
FERMENTACIÓN.
2. Medio mínimo MOPS 1 0 Hay menos crecimiento con malato
ácido málico (4C) que con glucosa. Esto se debe a que el
malato es peor fuente de C y E.
Consume energía para remontar y así
sintetizar los 12 BBs ya que no los
puede incorporar del medio (no hay)
No hay crecimiento sin O2 porque el
malato no es un sustrato fermentable.
3. Medio mínimo MOPS + 1,7 1 Si hay crecimiento. Con O2
KNO3 crecimiento3=crecimiento1. Sin O2
también hay y esto se debe a la
RESPIRACIÓN DE NITRATOS, se
usa nitrato como aceptor final de e⁻.
4. Medio mínimo MOPS + 0 0,5 En presencia de O2 no hay crecimiento
KNO3 sin NH4Cl ya que no hay fuente de nitrógeno.
En ausencia de O2 sí, esto se debe a la
NITRATO REDUCTASA
RESPIRATORIA: NO3⁻ → NO²⁻ →
NH3⁺
5. Medio mínimo MOPS sin 0 0 No hay fuente de nitrógeno → No
NH4Cl crecimiento
6. LB 2 1 Medio rico. Hay más crecimiento
debido al ahorro de energía de la
biosíntesis. Sin O2 también hay
crecimiento pues el extracto de
levadura tiene hidratos de carbono.
Anotaciones:
- Ringer 1/4: para lavar el medio de cultivo LB para posteriormente inocular.
-E.coli no fermenta aminoácidos ni tiene la nitrato reductasa asimilativa.
-Fermentación de azúcares (acidificación) y aminoácidos (basificación) no son compatibles.
-Usamos distinto blanco para 1-5 que para LB.
-2 motivos por los que una fuente de C y E es peor (como el malato): entra por abajo y tiene que
remontar para la síntesis de BBs + gasto en el transporte.